基于SSR標(biāo)記的新疆大蒜及其野生蒜種遺傳多樣性及聚類(lèi)分析

李輝玲， 張建文， 李守明

(1.巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆庫(kù)爾勒 8410001；2.石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆石河子 832000)

大蒜(L.)別稱(chēng)胡蒜，是百合科蔥屬中重要的蔬菜植物，兼有藥用價(jià)值，被譽(yù)為“植物黃金”，在我國(guó)山東、河南、江蘇、河北以及新疆等地廣泛種植。其生長(zhǎng)時(shí)間短、病蟲(chóng)害較輕，并且其精、深加工產(chǎn)業(yè)已初步形成，使其走俏歐洲、美國(guó)。但是一直以來(lái)，大蒜品種的篩選鑒定工作還不深入，品種資源存在同名異物或同物異名現(xiàn)象，另外大蒜長(zhǎng)年無(wú)性繁殖所產(chǎn)生的品種退化嚴(yán)重、相互引種但背景資料缺失等問(wèn)題不利于優(yōu)異大蒜品種的推廣和應(yīng)用。

遺傳變異是指不同個(gè)體或不同種類(lèi)之間的變異之和，本質(zhì)上是遺傳物質(zhì)的堿基對(duì)排序和結(jié)構(gòu)排序變化。遺傳多樣性工作的開(kāi)展可以直觀地了解種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性水平，為育種工作中的品種區(qū)分、分組、父母本選擇、野生稀有物種的保護(hù)等提供依據(jù)。通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法來(lái)研究遺傳多樣性具有簡(jiǎn)單、直觀的優(yōu)點(diǎn)，但表觀形態(tài)受基因、外部環(huán)境共同影響，只能間接反映其遺傳物質(zhì)的本質(zhì)特征，并且可檢測(cè)的信息量也較少，存在一定的缺陷和局限性。分子標(biāo)記技術(shù)是基于DNA多態(tài)性建立起來(lái)的方法，DNA堿基雙螺旋結(jié)構(gòu)排列的順序就是作物的遺傳信息，因此直接分析和比較DNA的堿基序列結(jié)構(gòu)是最優(yōu)的遺傳多樣性分析方式。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記廣泛分布于植物基因組上，呈現(xiàn)共顯遺傳特性，具有豐富的多態(tài)性，目前被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、遺傳多樣性分析、數(shù)量性狀座位(QTL)定位分析和品種純度鑒定等領(lǐng)域。

綜上所述，明確大蒜的遺傳背景信息和種質(zhì)資源多樣性，不僅可為評(píng)價(jià)與鑒定大蒜品種提供科學(xué)依據(jù)、為育種工作提供理論支持，而且也為優(yōu)異品種實(shí)現(xiàn)種子繁殖奠定了理論基礎(chǔ)，并能加速優(yōu)良品種的大面積推廣。本研究以63份不同地區(qū)來(lái)源的大蒜為材料，運(yùn)用50對(duì)SSR引物分析供試大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以期解決大蒜品種存在的同名異物問(wèn)題，最終為大蒜資源的品種評(píng)價(jià)與鑒定提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試63份大蒜種質(zhì)資源分別由巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院特色作物室、新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所收集并提供，其中來(lái)自新疆的種質(zhì)11份，來(lái)自云南的種質(zhì)10份，來(lái)自甘肅、山東的種質(zhì)各6份，來(lái)自河南的種質(zhì)5份，來(lái)自河北的種質(zhì)4份，來(lái)自遼寧、四川的種質(zhì)各3份，來(lái)自安徽、湖南、陜西的種質(zhì)各2份，來(lái)自貴州、江蘇的種質(zhì)各1份，野生資源7份(表1)。將63份大蒜種質(zhì)資源于2021年4月初種植于巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)田及新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)田內(nèi)，按照常規(guī)田間管理。2021年6月每個(gè)品種隨機(jī)采集5株嫩葉，未出苗的品種以鱗莖為材料，放置于液氮罐中處理后及時(shí)存貯于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備用。試驗(yàn)時(shí)稱(chēng)取200 mg左右葉片，用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒抽提材料的DNA，80 mg左右鱗莖用傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法提取DNA。

表1 63份大蒜種質(zhì)的資源信息

1.2 DNA質(zhì)量及濃度的檢測(cè)

提取63份大蒜資源的DNA，DNA濃度和純度用核酸檢測(cè)儀(NanoDrop-1000)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定。根據(jù)測(cè)定值和前期優(yōu)化的PCR體系所需的DNA模板濃度，將所有樣品濃度稀釋到 30 ng/μL，放置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考Barboza等的研究，共設(shè)計(jì)50對(duì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 PCR擴(kuò)增

根據(jù)前期優(yōu)化試驗(yàn)，確定大蒜SSR-PCR反應(yīng)體系(10 μL)：30.0 ng模板DNA、各0.5 μmol/L正反向引物、5.0 μL 2×PCR Mix，用dd HO補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，在不同引物的上、下游平均溫度下退火45 s，72 ℃延伸90 s；30次循環(huán)的最后1個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間設(shè)為10 min；4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。

采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳結(jié)果分析擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳儀參數(shù)：120 V恒定電壓，電流200 mA，時(shí)間75 min。電泳結(jié)束后小心拆膠，用銀染法顯色至條帶清晰可辨，在醫(yī)用膠片觀察燈下拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果的重復(fù)性、擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)量及清晰程度、多態(tài)性表現(xiàn)等篩選表現(xiàn)較為優(yōu)異的SSR引物。統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)引物處理下每個(gè)樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶，同一遷移位置處有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0，缺失的記為9，組成1和0矩陣，在Excel表中登記。用NTSYS-pc(Version 2.10e)軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)圖，計(jì)算遺傳相似性系數(shù)(genetic similar coefficient，GS)和遺傳距離(genetic distance，GD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板的檢測(cè)

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)隨機(jī)挑選的14份大蒜資源DNA的質(zhì)量(圖1中1～9為試劑盒提取，10～14為傳統(tǒng)CTAB法提取)。如圖1所示，所提DNA條帶整齊一致、帶型清晰、濃度均勻。核酸檢測(cè)儀測(cè)定結(jié)果顯示，所提DNA的/位于 1.85～2.00之間，濃度為61～93 ng/μL，可以稀釋為30 ng/μL用于后續(xù)SSR-PCR分析。

2.2 SSR擴(kuò)增結(jié)果

以6份生物學(xué)性狀差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的大蒜材料為模板，利用優(yōu)化后的最佳SSR-PCR反應(yīng)體系和循環(huán)數(shù)，對(duì)50對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，淘汰擴(kuò)增效果不佳、帶型不好辨認(rèn)的引物，最終篩選出33對(duì)引物對(duì)63份材料有特異性條帶，特異性檢出率為66%；共擴(kuò)增出353條條帶，其中多態(tài)性條帶162條，多態(tài)性比例為45.89%(表2)。不同引物所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果存在明顯差異，本試驗(yàn)中，每對(duì)引物可擴(kuò)增出2～22條條帶，多態(tài)性條帶數(shù)共162條，每對(duì)前期多態(tài)性表現(xiàn)良好的引物平均產(chǎn)生4.9條條帶。圖2是引物ASM072在63份新疆大蒜及其野生蒜種中的擴(kuò)增情況，平均每對(duì)引物能夠擴(kuò)增出10.69個(gè)位點(diǎn)，表明大蒜資源間的遺傳多樣性較為豐富，所用SSR標(biāo)記多態(tài)性表現(xiàn)較好。

表2 篩選出的33對(duì)大蒜SSR多態(tài)性引物

2.3 SSR聚類(lèi)分析

用33對(duì)多態(tài)性差異表現(xiàn)優(yōu)異的引物對(duì)63份新疆大蒜及其野生蒜種進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，63份大蒜資源的遺傳相似系數(shù)位于0.41～0.9之間。如圖3所示，可在遺傳相似系數(shù)0.5處將63份新疆大蒜及其野生蒜種分成4個(gè)大類(lèi)群，其中第1類(lèi)群包含40份材料；第2類(lèi)群包含15份材料；第3類(lèi)群包含7份材料，為7份野生資源；第4類(lèi)群包含1份材料，為貴州畢節(jié)蒜。聚類(lèi)結(jié)果表明，大部分地理區(qū)域位置相近或相同的品種被聚在一起，比如第2類(lèi)群包含15份材料，其中8份資源主要來(lái)自云南地區(qū)；第3類(lèi)群包含的7份材料全部來(lái)源于烏魯木齊，為野生蒜，但也有少部分地理區(qū)域位置較遠(yuǎn)的蒜種被聚在一起，如來(lái)自山東濰坊的大蒜(1號(hào))與來(lái)自新疆石河子的資源(4、5號(hào))被聚到第1類(lèi)群的小亞群中；來(lái)自山東金鄉(xiāng)的大蒜(2號(hào))與來(lái)自遼寧黑山、陜西漢中的資源(22、24號(hào))聚到了第1類(lèi)群的小亞群中，造成這種現(xiàn)象的原因很可能是地區(qū)間引種，說(shuō)明不同區(qū)域間的大蒜資源存在一定的基因交流情況。非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類(lèi)分析結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記引物能夠有效區(qū)分不同地域及距離來(lái)源的大蒜資源并相對(duì)精確地鑒定資源間的親緣關(guān)系?；谙嗨葡禂?shù)的結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)SSR-PCR反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行主坐標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)前3個(gè)主坐標(biāo)的多態(tài)性貢獻(xiàn)值分別為 20.34%、8.39%和6.63%。對(duì)63份大蒜材料在第1、第2主坐標(biāo)構(gòu)成的二維圖(圖4)、3個(gè)主坐標(biāo)構(gòu)成的三維圖(圖5)中進(jìn)行分類(lèi)，由圖4、圖5可見(jiàn)，63份大蒜材料在第1、第2主坐標(biāo)排序中可分為6類(lèi)，其中22(云南獨(dú)頭4號(hào))、46(阿合奇縣大蒜)距離其他材料較遠(yuǎn)，因此將它們重新單獨(dú)分組。

綜合上述3個(gè)主坐標(biāo)的分析結(jié)果，63份大蒜材料可分為6個(gè)類(lèi)群。分析比較得出，圖3、圖4、圖5的結(jié)果與63份大蒜材料的聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。在主坐標(biāo)的分析中，第2類(lèi)群基本一致，可將聚類(lèi)分析結(jié)果中的第3、第4類(lèi)群歸為1類(lèi)，將聚類(lèi)分析中的第1類(lèi)群分為2個(gè)組群，主坐標(biāo)分析后的分組結(jié)果和聚類(lèi)分析后的分組結(jié)果大體一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同部位DNA提取的比較分析

一般通過(guò)取幼嫩組織來(lái)獲得較高質(zhì)量的DNA，既容易破壁又能夠避免經(jīng)過(guò)不同程度的發(fā)育后細(xì)胞內(nèi)其他組分的干擾。在本研究中，利用大蒜鱗莖和葉片提取的DNA進(jìn)行SSR-PCR得到的試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明SSR擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)模板DNA的質(zhì)量沒(méi)有太高要求，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，從大蒜不同部位提取的模板DNA濃度和質(zhì)量有很大差異。大蒜鱗莖中存在大量多糖，用試劑盒抽提除雜不充分，材料的用量不宜過(guò)多，最好控制在0.2 g以?xún)?nèi)，否則大量多糖成分會(huì)產(chǎn)生很多黏液，從而干擾抽提效果。綜合試驗(yàn)結(jié)果，用大蒜不同部位取材抽提的DNA對(duì)擴(kuò)增效果的影響很小，可根據(jù)實(shí)際情況，在保證產(chǎn)率及質(zhì)量的前提下合理選擇取材部位。

3.2 大蒜資源間遺傳多樣性分析

本試驗(yàn)利用33對(duì)多態(tài)性SSR引物將63份新疆大蒜及其野生蒜種分為6個(gè)大類(lèi)群，大多數(shù)來(lái)自同一地域的材料被聚為1類(lèi)，說(shuō)明本研究開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的SSR引物能夠有效區(qū)分不同地域距離來(lái)源的大蒜資源，有一定的應(yīng)用價(jià)值。也有少部分地域距離較遠(yuǎn)的大蒜材料被聚為1類(lèi)，說(shuō)明大蒜材料背景來(lái)源復(fù)雜且不同地域間存在一定的基因交流情況。因此本研究選用的SSR引物可以判斷不同品種或材料間是否有基因交流的現(xiàn)象，也可以用于分析種源間的親緣關(guān)系。