不同馬鈴薯品種(品系)耐鹽性鑒定與綜合評(píng)價(jià)

于國(guó)紅， 劉朋程， 李明哲， 郝洪波， 崔海英， 郭安強(qiáng)

(河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所/河北省農(nóng)作物抗旱研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北衡水 053000)

馬鈴薯(L.)具有產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大的特性，是世界上第四大農(nóng)作物，被我國(guó)列為主糧。我國(guó)馬鈴薯種植面積達(dá)500多萬(wàn)hm，馬鈴薯生產(chǎn)在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占重要地位。馬鈴薯屬于鹽敏感型作物，也是我國(guó)干旱/半干旱地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物。近年來(lái)，隨著干旱/半干旱地區(qū)長(zhǎng)期鹽分積累和農(nóng)事操作不當(dāng)，導(dǎo)致土壤鹽漬化逐漸加重，嚴(yán)重制約了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。開(kāi)展馬鈴薯耐鹽性生理應(yīng)答機(jī)制研究，一方面有利于篩選到抗鹽性好的馬鈴薯品種，另一方面有利于深入挖掘馬鈴薯的抗鹽生理機(jī)制。

馬鈴薯耐鹽性評(píng)價(jià)常用的試驗(yàn)方法包括大田鑒定法、盆栽法及組織培養(yǎng)法。其中組織培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是組培苗對(duì)鹽更敏感，環(huán)境更易控制。前人利用組織培養(yǎng)法對(duì)馬鈴薯耐鹽性生理應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究，主要集中在2個(gè)方面。一方面是通過(guò)滲透調(diào)節(jié)途徑，主要研究丙二醛、可溶性糖等物質(zhì)在鹽脅迫下的變化。丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，能夠間接反映細(xì)胞膜受損程度，鹽脅迫導(dǎo)致馬鈴薯 MDA 含量增加?？扇苄蕴鞘菂⑴c逆境滲透調(diào)節(jié)的另一重要物質(zhì)，鹽脅迫會(huì)使可溶性糖快速作出響應(yīng)，導(dǎo)致可溶性糖含量增加。另一方面是氧化脅迫途徑。張景云等研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度鹽脅迫下馬鈴薯的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性均顯著升高，且耐鹽品種相對(duì)值顯著高于感鹽品種。陳彥云等研究表明，在能耐受鹽脅迫的條件下，馬鈴薯的POD、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性迅速提高，以清除植物體內(nèi)大量的自由氧基，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

前人對(duì)馬鈴薯抗鹽性的研究主要集中在單個(gè)生理指標(biāo)的變化，而結(jié)合多個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)馬鈴薯抗鹽性的研究較少。評(píng)價(jià)作物的抗鹽性不僅需要合適的生理指標(biāo)，而且要適宜的評(píng)價(jià)方法。將隸屬函數(shù)分析、聚類分析等方法和多種指標(biāo)相結(jié)合，對(duì)作物抗鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)是目前研究的熱點(diǎn)。本研究利用組織培養(yǎng)法對(duì)不同馬鈴薯品種(系)展開(kāi)耐鹽性鑒定試驗(yàn)，對(duì)處于正常和鹽脅迫條件下的10個(gè)品種(系)組培苗生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)合隸屬函數(shù)分析、聚類分析及灰色關(guān)聯(lián)度分析對(duì)馬鈴薯耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期篩選出抗鹽性強(qiáng)的馬鈴薯品種，為馬鈴薯耐鹽品種選育提供種質(zhì)資源，為馬鈴薯抗鹽機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2019—2020年在河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所馬鈴薯組培室進(jìn)行。試驗(yàn)材料包括由筆者所在課題組引進(jìn)并保存的費(fèi)烏瑞它(對(duì)照)、北方009、135、TACNA、SOSNA、F8、冀張薯5號(hào)、冀張14號(hào)、冀張3號(hào)、克新23號(hào)，共10個(gè)品種(系)。采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，因素一為品種(系)；因素二為處理方式，以正常生長(zhǎng)為對(duì)照，以250 mmol/L鹽脅迫為處理。取4周左右苗齡的試管苗進(jìn)行試驗(yàn)，正常生長(zhǎng)條件是在含有50 mL MS固體培養(yǎng)基的組培瓶中生長(zhǎng)，鹽脅迫條件是在含有250 mmol/L NaCl的50 mL MS 培養(yǎng)基的組培瓶中生長(zhǎng)。鹽處理?xiàng)l件設(shè)置為 50、150、250 mmol/L NaCl 3個(gè)梯度。因只有到250 mmol/L NaCl 時(shí)不同品種(系)馬鈴薯才出現(xiàn)不同的表型差異，因此后期只測(cè)定了正常生長(zhǎng)和250 mmol/L NaCl 2種生長(zhǎng)條件下樣品的生理指標(biāo)。生長(zhǎng)環(huán)境為溫度(25±2) ℃的組培室，在16 h光照/8 h 黑暗的條件下培養(yǎng)。每瓶設(shè)5株馬鈴薯組培苗作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。處理馬鈴薯組培苗出現(xiàn)表型時(shí)進(jìn)行取樣，并測(cè)定生理指標(biāo)。

1.2 指標(biāo)測(cè)定方法

葉綠素含量采用95%乙醇提取法測(cè)定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法測(cè)定；SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定。生理指標(biāo)具體檢測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。然后按照以下公式，計(jì)算抗鹽系數(shù)、綜合抗鹽系數(shù)、抗鹽指數(shù)、隸屬函數(shù)值，對(duì)隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析，劃分抗鹽級(jí)別：

(1)

(2)

(3)

(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(最小極差法進(jìn)行多重比較)、關(guān)聯(lián)度分析及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下馬鈴薯葉綠素含量變化

葉綠素是作物進(jìn)行光合作用所必需的光合色素，作物體內(nèi)葉綠素含量的高低可以判定其光合作用的強(qiáng)弱。如圖1所示，與正常處理相比，10個(gè)馬鈴薯品種(系)在鹽脅迫下葉綠素含量均顯著降低，但下降幅度有所差異。135、冀張薯5號(hào)、費(fèi)烏瑞它、TACNA、克新23號(hào)、SOSNA、冀張14號(hào)、冀張3號(hào)、F8、北方009葉綠素含量在鹽脅迫下分別顯著降低48.79%、6.59%、29.57%、40.28%、29.99%、47.09%、52.13%、16.89%、8.17%、30.59%，降低幅度大小順序?yàn)榧綇?4號(hào)>135>SOSNA>TACNA>北方009>克新23號(hào)>費(fèi)烏瑞它>冀張3號(hào)>F8>冀張薯5號(hào)。葉綠素含量降低幅度越大的品種(系)說(shuō)明其對(duì)鹽脅迫越敏感，光合作用受到的影響越大。

2.2 鹽脅迫對(duì)馬鈴薯滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物在遭受一定逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)丙二醛、可溶性糖含量均會(huì)有所增加。丙二醛是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，其值大小可代表植物在逆境脅迫下受到的氧化傷害；可溶性糖可通過(guò)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，減輕逆境脅迫的傷害。如圖2-A所示，與正常處理相比，10個(gè)馬鈴薯品種(系)受到鹽脅迫后其丙二醛含量均有不同程度的升高，但僅費(fèi)烏瑞它、克新23號(hào)、冀張14號(hào)、F8、北方009達(dá)到顯著水平，這5個(gè)品系較正常處理分別提高26.79%、83.53%、63.10%、106.54%、17.00%。丙二醛含量增加幅度越高的品種(系)受到的氧化脅迫也相對(duì)越大。如圖2-B所示，鹽脅迫下馬鈴薯可溶性糖含量較正常處理均有不同程度升高，冀張薯5號(hào)、冀張14號(hào)升高不顯著，其他品種(系)均顯著升高。135、費(fèi)烏瑞它、 TACNA、克新23號(hào)、 SOSNA、冀張3號(hào)、F8、北方009分別升高45.35%、45.42%、37.49%、162.35%、54.36%、30.93%、247.50%、54.88%，升高幅度大小順序依次為F8>克新23號(hào)>北方009>SOSNA>費(fèi)烏瑞它>135>TACNA>冀張3號(hào)。可溶性糖含量升高的品種(系)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生了明顯變化，可溶性糖含量升高幅度越大的品種(系)，其抗鹽性越好。

2.3 鹽脅迫下馬鈴薯抗氧化酶活性的影響

植物在逆境脅迫下會(huì)產(chǎn)生活性氧，活性氧會(huì)損害細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，而SOD、POD、CAT為清除活性氧的關(guān)鍵酶。與正常處理相比，鹽脅迫條件下，冀張薯5號(hào)、費(fèi)烏瑞它、TACNA、克新23號(hào)、SOSNA、冀張14號(hào)、冀張3號(hào)、F8、北方009中SOD酶活性分別顯著提高14.32%、30.44%、46.10%、21.90%、14.97%、89.79%、8.37%、43.68%、9.19%(圖3-A)。與正常處理相比，在鹽脅迫下，除北方009外，其他馬鈴薯品種(系)中POD活性均顯著提高(圖3-B)，提高幅度大小順序依次為冀張3號(hào)>135>冀張14號(hào)>F8>費(fèi)烏瑞它>克新23號(hào)>冀張薯5號(hào)>SOSNA>TACNA。與正常處理相比，鹽脅迫下馬鈴薯CAT活性均顯著升高，升高幅度大小順序依次為F8>135>北方009>冀張薯5號(hào)>SOSNA>TACNA>克新23號(hào)>費(fèi)烏瑞它>冀張14號(hào)>冀張3號(hào)(圖3-C)。同一品種(系)在鹽脅迫下的3種抗氧化酶活性變化幅度有所差異，說(shuō)明不同品種(系)在鹽脅迫下所依賴的清除活性氧的酶有所差異。

2.4 單項(xiàng)指標(biāo)的抗鹽性評(píng)價(jià)

根據(jù)公式(1)(2)計(jì)算出各個(gè)材料各個(gè)指標(biāo)的單項(xiàng)抗鹽系數(shù)和綜合抗鹽系數(shù)(表1)。綜合抗鹽系數(shù)結(jié)果顯示，馬鈴薯抗鹽性由強(qiáng)到弱的順序依次為F8>冀張3號(hào)>135>克新23號(hào)>費(fèi)烏瑞它>SOSNA>北方009>冀張薯5號(hào)>冀張14號(hào)>TACNA。參照連續(xù)變數(shù)的數(shù)次分布統(tǒng)計(jì)方法，將各性狀的抗鹽系數(shù)以組距為0.5分成9個(gè)組區(qū)間，制成次數(shù)分布表(表2)。結(jié)果顯示，同一組間各性狀的抗鹽系數(shù)分布有較大差距，同一種質(zhì)不同指標(biāo)抗鹽系數(shù)并不完全一致。因此，利用單一生理指標(biāo)的抗鹽系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)馬鈴薯抗鹽性并不準(zhǔn)確。

表1 各個(gè)材料的抗鹽系數(shù)

表2 供試材料各個(gè)性狀指標(biāo)的抗鹽系數(shù)在不同區(qū)間的分布

2.5 綜合抗鹽評(píng)價(jià)

利用相關(guān)分析計(jì)算各個(gè)性狀與綜合抗鹽指數(shù)的相關(guān)系數(shù)，首先利用公式(4)計(jì)算出各品種(系)的隸屬函數(shù)值，然后根據(jù)綜合隸屬函數(shù)值的大小對(duì)供試材料進(jìn)行抗鹽性排序(表3)，最后利用最長(zhǎng)距離法對(duì)綜合隸屬函數(shù)進(jìn)行聚類分析，劃分抗鹽級(jí)別。如圖4所示，當(dāng)歐氏距離為0.1528時(shí)，可將馬鈴薯品種(系)抗鹽性分為4類：第1類為耐鹽品系F8；第2類為中等耐鹽品種(系)，包括135、冀張薯5號(hào)、克新23號(hào)、冀張3號(hào)；第3類為中等感鹽品種(系)，包括費(fèi)烏瑞它、SOSNA、北方009；第4類感鹽品種(系)，包括TACNA、冀張14號(hào)。

表3 各個(gè)材料的抗鹽性排序

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度分析

按灰色系統(tǒng)理論要求，將10個(gè)不同馬鈴薯品種(系)的綜合抗鹽系數(shù)和鹽脅迫下的 6個(gè)指標(biāo)視為一個(gè)整體，即灰色系統(tǒng)。將綜合抗鹽指數(shù)作為參考數(shù)列(母序列)，各個(gè)指標(biāo)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值作為比較數(shù)列(子序列)，建立灰色系統(tǒng)，計(jì)算各個(gè)指標(biāo)與其綜合抗鹽指數(shù)的關(guān)聯(lián)度(表4)。在鹽脅迫條件下，6個(gè)指標(biāo)與綜合抗鹽系數(shù)的密切程度(關(guān)聯(lián)序)為POD 活性>丙二醛含量>SOD 活性>可溶性糖含量>CAT活性>葉綠素含量。

表4 馬鈴薯中各指標(biāo)與綜合抗鹽系數(shù)關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)序

3 討論

鹽脅迫條件下，馬鈴薯通過(guò)改變體內(nèi)生理生化過(guò)程來(lái)響應(yīng)逆境環(huán)境。本研究通過(guò)對(duì)不同處理?xiàng)l件下不同馬鈴薯品系中葉綠素含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、CAT活性6個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與綜合分析，篩選馬鈴薯耐鹽性強(qiáng)的品種(系)，解析馬鈴薯耐鹽生理應(yīng)答機(jī)制。

葉綠素主要與植物的光合作用有關(guān)，其含量的高低決定了植物對(duì)不同光的吸收和利用效率，是研究植物生理的重要指標(biāo)之一。一定濃度的鹽脅迫可促使植物體內(nèi)葉綠素含量增加，過(guò)高濃度鹽脅迫會(huì)使葉綠素含量呈下降趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下，10個(gè)馬鈴薯品種(系)中葉綠素含量均呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯葉綠素分解，這與趙曼利等的研究結(jié)果一致。在逆境條件下，丙二醛是植物細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其大量累積可造成細(xì)胞調(diào)節(jié)功能紊亂，損傷生物膜，而細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度與植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱成負(fù)相關(guān)?？扇苄蕴鞘侵参镏匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們的積累能提高細(xì)胞的保水能力，減輕活性氧對(duì)膜脂和蛋白質(zhì)的過(guò)氧化作用，從而對(duì)生物膜起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫條件下，不同馬鈴薯品種(系)中丙二醛和可溶性糖含量均呈上升趨勢(shì)，表明馬鈴薯細(xì)胞膜受到損害，而馬鈴薯通過(guò)釋放可溶性糖來(lái)減少損傷。植物在受到鹽脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生各種活性氧及其化合物，它們會(huì)對(duì)機(jī)體的正常生理活動(dòng)產(chǎn)生危害，SOD、POD、CAT可以在細(xì)胞中通過(guò)不同途徑協(xié)同作用降低這種危害。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫促使了不同馬鈴薯品種(系)酶活性增加，這與顧恒等的研究結(jié)果一致。

近年來(lái)，土壤鹽漬化給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，為了篩選抗鹽性種質(zhì)資源、探究作物抗旱生理應(yīng)答機(jī)制，一些學(xué)者采用相關(guān)分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析等方法相結(jié)合對(duì)作物的抗鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果顯示，利用單一生理指標(biāo)計(jì)算得到的抗鹽系數(shù)有所差異，說(shuō)明采用單一生理指標(biāo)的抗鹽系數(shù)不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)馬鈴薯的抗鹽性，這與王苗苗等的研究結(jié)果一致。通過(guò)進(jìn)一步結(jié)合單項(xiàng)指標(biāo)抗鹽系數(shù)、隸屬函數(shù)分析、聚類分析以及灰色關(guān)聯(lián)度分析對(duì)馬鈴薯種質(zhì)資源的抗鹽性進(jìn)行綜合分析，可將10個(gè)不同馬鈴薯品種(系)抗鹽性分為4類：第1類為耐鹽品系F8；第2類為中等耐鹽品種(系)，包括135、冀張薯5號(hào)、克新23號(hào)、冀張3號(hào)；第3類為中等感鹽品種(系)，包括費(fèi)烏瑞它、SOSNA、北方009；第4類為感鹽品種(系)，包括TACNA、冀張14號(hào)。在鹽脅迫條件下，6個(gè)指標(biāo)與綜合抗鹽系數(shù)的密切程度(關(guān)聯(lián)序)為POD 活性>丙二醛含量>SOD 活性>可溶性糖含量>CAT活性>葉綠素含量。

4 結(jié)論

鹽脅迫能夠降低馬鈴薯葉綠素含量，增加丙二醛和可溶性糖含量，提高保護(hù)酶活性。單一生理指標(biāo)的變化不能說(shuō)明馬鈴薯品種(系)的抗鹽強(qiáng)弱，運(yùn)用隸屬函數(shù)分析、聚類分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析相結(jié)合，可以對(duì)馬鈴薯種質(zhì)資源的抗鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。