張志勇,劉震,周峻崗,呂紅*
1(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海,200438) 2(復(fù)旦大學(xué) 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心,上海,200438)
根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(www.fao.org/faostat/en/#data/QC/),近10年以來世界蘋果總產(chǎn)量逐年增加。中國是世界第一大蘋果生產(chǎn)國,蘋果的年產(chǎn)量穩(wěn)步提高,平均年增長92萬t。2019年中國蘋果產(chǎn)量為4 243萬t(圖1-a),占當(dāng)年世界總產(chǎn)量的49%。蘋果富含多酚和膳食纖維[1],對人體具有多種健康促進(jìn)作用。研究表明蘋果中含有的生物活性成分(類黃酮、多酚等)對多種類型的癌細(xì)胞生長具有抑制作用[2],同時(shí)在預(yù)防慢性心血管疾病、糖尿病、肥胖癥[3],改善腸道菌群[4]等方面均有明顯效果。目前,我國水果原料進(jìn)行深加工的比例低于30%,蘋果主要以鮮食、蘋果濃縮汁和果汁飲料產(chǎn)品為主[5],產(chǎn)品附加值較低,品類較為單一,且副產(chǎn)物(果渣)浪費(fèi)較大,亟需進(jìn)行產(chǎn)業(yè)升級[6]。
發(fā)酵是一種歷史悠久且簡單經(jīng)濟(jì)的水果加工方法;在發(fā)酵過程中,微生物作為細(xì)胞工廠將水果原料成分,如可發(fā)酵的碳水化合物等物質(zhì),轉(zhuǎn)化成多酚類化合物、有機(jī)酸、酒精和CO2等代謝產(chǎn)物[7]。發(fā)酵還能延長食品保質(zhì)期,抑制食源性病原體,改善食品的感官特性,提高蛋白質(zhì)和碳水化合物的消化率以及維生素和礦物質(zhì)的生物利用度。蘋果酒(cider)是一種由蘋果汁(部分或全部)發(fā)酵制成的酒精飲料,酒精含量較低,在1.2%~8.5%(ol)[8]。蘋果酒是僅次于葡萄酒的世界第二大發(fā)酵果酒[9]。世界上有多達(dá)25個(gè)國家在蘋果產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)蘋果酒,產(chǎn)量最高的地區(qū)是歐洲。歐洲蘋果酒和果酒協(xié)會統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(https://aic.org/en)顯示,2019年世界蘋果酒銷量26.2 mhL(億公升),西歐地區(qū)銷量14.0 mhL,占比高達(dá)52.8%;而亞洲銷量僅占1.4%。中國作為世界上人口最多、近10年人均可支配收入上升最快的國家,生活富裕帶來人們對更加健康的發(fā)酵產(chǎn)品的追求,蘋果酒在中國將有潛在的龐大市場前景。
蘋果酒的研究逐漸成為果酒領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),期刊的年發(fā)表文章數(shù)量呈現(xiàn)快速增長趨勢(圖1-b,關(guān)鍵詞apple cider,數(shù)據(jù)來源www.sciencedirect.com),年平均增長率為12%。目前,蘋果酒的研究集中于蘋果原料、發(fā)酵菌種和生產(chǎn)工藝的探索。蘋果酒和葡萄酒在微生物組成和發(fā)酵工藝方面有很多相似之處,但果實(shí)本身成分和加工特性不同,使得兩者在口感方面存在較大差異。因此,對蘋果酒的研究將有助于更好地了解和控制蘋果酒的發(fā)酵過程,提升蘋果酒品質(zhì)。
影響蘋果酒品質(zhì)的因素有很多,蘋果品種、發(fā)酵菌種、生產(chǎn)工藝等均會影響蘋果酒的成分組成,進(jìn)而引起感官品質(zhì)的差異。COUSIN等[8]綜述了蘋果酒中微生物的組成、作用和動(dòng)態(tài)變化。然而對于蘋果酒的風(fēng)味成分組成,以及不同因素對蘋果酒感官品質(zhì)的影響暫未有相關(guān)的綜述。因此本文從蘋果酒的分類、成分組成,以及對蘋果酒品質(zhì)的影響因素進(jìn)行綜述。
a-中國和世界蘋果年產(chǎn)量;b-蘋果酒的年發(fā)表文章數(shù)量圖1 蘋果的年產(chǎn)量和蘋果酒研究的年發(fā)表文章數(shù)量Fig.1 The annual yield of apple and the number of published articles on apple cider research
按釀制工藝可分為發(fā)酵型蘋果酒和蒸餾型蘋果酒;按CO2含量可以分為平靜蘋果酒和含氣蘋果酒;按產(chǎn)品特性可分為含氣蘋果酒、冰蘋果酒、脫醇蘋果酒和利口蘋果酒[10];按酒精度可分為淡蘋果酒和烈性蘋果酒(加拿大魁北克《蘋果酒和其他蘋果酒精飲料法》)。蘋果酒(發(fā)酵型)是以蘋果、蘋果汁(漿)等為主要原料,經(jīng)全部或部分酒精發(fā)酵釀制而成的發(fā)酵酒;蘋果蒸餾酒是以蘋果為原料,經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、調(diào)配而成的飲料酒。蘋果酒的配制酒是以發(fā)酵或蒸餾蘋果酒為酒基,加入可食用的輔料或食品添加劑,進(jìn)行調(diào)配、混合或加工制成的飲料酒。目前中國市場以蘋果酒的配制酒為主,在發(fā)酵蘋果酒的基礎(chǔ)上,復(fù)配不同果汁、白砂糖(糖漿)、香精等,形成多口味的產(chǎn)品。英國、西班牙、法國、德國和愛爾蘭是歐洲蘋果酒的主要市場。加拿大魁北克地區(qū)是世界冰蘋果酒的主要產(chǎn)區(qū)。表1列舉了歐洲主要蘋果酒的品類和特點(diǎn)。歐洲蘋果酒釀造所用的蘋果原料以苦甜型蘋果為主,蘋果汁發(fā)酵度較高(干型為主),CO2含量較高,酒精度較低(4%ol左右)。
表1 歐洲主要蘋果酒的種類和釀造特點(diǎn)Table 1 The arieties and brewing characteristics of apple ciders in Europe
蘋果酒的主要成分為水、糖(果糖為主)、有機(jī)酸、酚類物質(zhì)和香氣化合物[11]。
果酒的香氣構(gòu)成主要包括:一級香氣,來源于水果品種的固有特性;二級香氣,由酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生;三級香氣(花香為主),由酒體在成熟或陳釀過程中產(chǎn)生[12]。蘋果酒中香氣成分主要包括醇類、羰基化合物(醛和酮)、揮發(fā)酸、酯類等。由表2可知,香氣物質(zhì)含量變化較大。蘋果酒發(fā)酵所用菌株的差異和香氣物質(zhì)含量測定方法(內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法)的不同可能是引起這種差異的主要原因。醛類物質(zhì)主要來源于蘋果汁,發(fā)酵后醛類物質(zhì)的種類和含量均降低[13]。高級醇是由氨基酸和糖類在酵母發(fā)酵過程中通過Ehrlich途徑產(chǎn)生[14]。3-甲基-1-丁醇(異戊醇)和2-苯乙醇是蘋果酒中主要的高級醇[15-16]。QIN等[17]測定了14種英國和斯堪的納維亞地區(qū)的蘋果酒中的揮發(fā)性成分,結(jié)果表明酯類幾乎占揮發(fā)性化合物總數(shù)的一半。風(fēng)味活性的酯類主要是乙酸酯(乙酸乙酯、乙酸異戊酯等)和中鏈脂肪酸乙酯(己酸乙酯、辛酸乙酯等)[18]。乙酸酯是由相應(yīng)高級醇的酯化反應(yīng)產(chǎn)生;乙酯類是由乙醇和中鏈脂肪酸合成。陳釀期較短的果酒,乙酸乙酯對酒體的果味貢獻(xiàn)較大[19]。適宜濃度的酯類,會賦予酒體愉悅的果香氣味,但酯類含量過高會給果酒帶來油漆或指甲油的異味,高濃度的乙酸乙酯還會抑制酒體的果香和花香[20]。
表2 蘋果酒中的主要揮發(fā)性成分[15,17,21-24]Table 2 The major olatile components of apple ciders[15,17,21-24]
蘋果酒中果糖含量為3.0~32.9 g/L,蘋果酸含量為0.37~2.9g/L,檸檬酸含量為0.0~2.8 g/L[17,21]。蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化前的蘋果酒中,蘋果酸是含量較高的有機(jī)酸[21]。蘋果的抗自由基活性與總多酚含量密切相關(guān)[25]。羥基肉桂酸(1.5~5.3 mg/L)、黃烷醇和原花青素是蘋果汁中的主要酚類[26-27]。兒茶素(8.13 mg/L)、表兒茶素(24.44 mg/L)、咖啡酸(20.72 mg/L)和綠原酸(14.43 mg/L)是蘋果酒中主要的單酚物質(zhì)[28]。原花青素是果酒收斂性口感的主要來源,其聚合度越高,酒體的苦味和澀味越重[11]。
蘋果的品種、成熟度、發(fā)酵菌種和發(fā)酵工藝等均會影響蘋果酒的成分和感官品質(zhì)。
依據(jù)蘋果酸和單寧含量的不同,蘋果分為4種類型:甜、苦甜、苦酸和尖酸。我國蘋果品種多樣,主要栽培品種有富士、嘎拉、金冠、元帥、紅星等,雜交品種包括魯加、寒富、賽金、瑞紅等[29-30]。我國蘋果大多為低酸度或低單寧含量的鮮食品種。國外蘋果品種主要有Douce moet(甜麥)、Petit jaune(小黃)、Judaine(瑞丹)、Arolles(酸王)、Kermerrien(苦開麥)、Granny Smith(澳洲青蘋)等。Golden delicious(金冠)、Jonagold(喬納金)、Red delicious(紅星)3個(gè)品種在歐洲的市場占有量超過70%;Douce moet、Petit jaune和Kermerrien是法國釀造蘋果酒的常用品種;Judaine、Arolles和Granny Smith多用來生產(chǎn)果汁飲料[31]。蘋果酒的主要原料包括鮮蘋果、脫水蘋果、蘋果汁(漿)及濃縮蘋果汁(漿),根據(jù)中國果酒通用技術(shù)要求,原料以鮮蘋果計(jì)的潛在酒精度不應(yīng)小于2%。
LANZERSTORFER等[32]測定了奧地利88個(gè)蘋果品種(主要為非商業(yè)化的古老品種)的成分特征,結(jié)果表明不同蘋果品種有機(jī)酸(蘋果酸和檸檬酸)、礦物質(zhì)、磷酸鹽、微量元素和多酚物質(zhì)的含量都存在較大差異。此外,果實(shí)的成熟度也會影響蘋果的成分組成。不同成熟度的蘋果中可溶性固形物(主要是指可溶性糖類)含量為8.0~18.9 °Brix,蘋果酸含量在0.13~17.2 g/L[32]。隨著蘋果的成熟度增加,糖類總含量顯著增加,可滴定酸含量呈下降趨勢[19]。未成熟蘋果生產(chǎn)的蘋果汁和蘋果酒中酚類化合物含量高于成熟和過熟蘋果,但酚類物質(zhì)含量受蘋果品種影響較大[27]。BRAGA等[19]測定了不同成熟度(未成熟、成熟和衰老)蘋果的揮發(fā)性成分(酯類、醇類和醛酮類化合物)含量,發(fā)現(xiàn)成熟的嘎拉(Gala)蘋果的香氣物質(zhì)總含量最高。BARREIRA等[1]發(fā)現(xiàn)蘋果品種影響果渣中酚類化合物(酚酸、黃酮)的分布和含量,新鮮蘋果渣中的酚類化合物主要是綠原酸(0.03~0.40 g/kg)、咖啡酸(0.02~0.28 g/kg)、(+)-兒茶素(0.12 g/kg)、(-)-表兒茶素(0.02~0.64 g/kg)、蘆丁和槲皮素糖苷。
傳統(tǒng)蘋果酒的釀造是由存在于蘋果表皮和環(huán)境中的微生物自發(fā)進(jìn)行的發(fā)酵。蘋果表皮中分離鑒定的酵母菌主要有釀酒酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hanseniaspora)和酒香酵母屬(Brettanomyces)等[8]。COTON等[33]測定了法國蘋果酒中的酵母種類,在分離到的208個(gè)菌株中鑒定出15種酵母(表3)。其中,貝酵母(Saccharomycesbayanus)占比最高,其次是釀酒酵母(Saccharomycescereisiae)。COUSIN等[8]綜述了自然發(fā)酵的蘋果酒中存在的細(xì)菌種類,主要包括乳桿菌科(Lactobacillaceae)、明串珠藻科(Leuconostocaceae)、孢子乳桿菌科(Sporolactobacilliaceae)和鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)等。蘋果酒的自然發(fā)酵過程包括3個(gè)階段:氧化過程、酒精發(fā)酵(酵母菌將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇)和蘋果酸-乳酸發(fā)酵(由乳酸菌主導(dǎo),將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸)[34]。氧化過程是在非釀酒酵母作用下進(jìn)行,主要產(chǎn)生果香和花香味的香氣化合物[35]。酒精發(fā)酵過程中,釀酒酵母(Saccharomycescereisiae)是發(fā)酵的優(yōu)勢菌株[36]。西班牙蘋果酒自然發(fā)酵過程中,非釀酒酵母的漢遜酵母屬(Hanseniaspora)和美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)在發(fā)酵早期生長良好,但在隨后的發(fā)酵階段被釀酒酵母屬的酵母取代;在發(fā)酵的初期和中期,貝酵母(Sacchamomycesbayanus)是優(yōu)勢菌種(33%~41%),而發(fā)酵后期釀酒酵母(Sacchamomycescereisiae)則成為占主導(dǎo)地位的菌種[36]。傳統(tǒng)蘋果酒生產(chǎn)的發(fā)酵周期較長,主發(fā)酵需要幾周,陳釀過程可能長達(dá)幾個(gè)月,發(fā)酵過程不可控,容易受外界因素影響而使產(chǎn)品批次差異較大。
表3 法國蘋果酒中鑒定的酵母種類[33]Table 3 Yeast species identified in French cider[33]
現(xiàn)代蘋果酒生產(chǎn)工藝中通常采用加入純種酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵。表4列舉了可用于蘋果酒發(fā)酵的菌種和發(fā)酵條件。發(fā)酵菌種的添加有助于控制蘋果酒的發(fā)酵過程,同時(shí)由于異味成分(揮發(fā)酸、硫化物和有異味的酚類物質(zhì))的產(chǎn)生減少,使得蘋果酒的品質(zhì)得到提升[37]。釀酒酵母和貝酵母是目前工業(yè)蘋果酒發(fā)酵最常用的酵母[38-39]。不同酵母菌種的使用主要
表4 蘋果酒發(fā)酵菌種和發(fā)酵條件Table 4 Starter cultures and fermentation conditions of cider fermentation
影響果酒中黃酮類化合物和花青素的組成[40]。貝酵母發(fā)酵的蘋果酒,其羥基肉桂酸衍生物(特別是對香豆酸)的含量高于釀酒酵母發(fā)酵的蘋果酒,但酵母菌株對蘋果酒酚類成分的影響程度低于加工過程、蘋果品種或不同成熟度[27]。BEDRIANA等[41]比較了分離自西班牙本土酒窖的貝酵母與商業(yè)貝酵母在冰蘋果酒發(fā)酵中的差異,結(jié)果表明本土菌株的甲醇、乙酸和乙酸乙酯產(chǎn)量更低。MASNEUF-POMARDE等[42]測定了28株貝酵母的葡萄汁酵母變種(Sacchamomycesbayanusar.uarum)與釀酒相關(guān)的表型特征,結(jié)果表明與釀酒酵母相比,該酵母具有更短發(fā)酵滯后期、更高細(xì)胞活力、更好的低溫適應(yīng)特性,可在13 ℃下完成酒精發(fā)酵[42]。
近年來,探究新菌種來提高蘋果酒風(fēng)味多樣性成為研究熱點(diǎn)。非釀酒酵母屬酵母因具有生產(chǎn)低酒精含量果酒和改變蘋果酒的香氣組成的潛力,在釀酒行業(yè)受到越來越多的關(guān)注。CONTRERAS等[45]測定了50種非釀酒酵母屬酵母的發(fā)酵能力,結(jié)果表明不同酵母對合成培養(yǎng)基的糖消耗率差異較大,糖耗量為0~68%。馬克斯克魯維酵母(Kluyeromycesmarxianus)已經(jīng)作為生產(chǎn)乙酸乙酯、2-苯乙醇等香氣化合物的工業(yè)菌株[46-48],其分泌的內(nèi)聚半乳糖醛酸酶具有較高的果膠酶活性[49-50]。ROLLERO等[51]研究表明馬克斯克魯維酵母具有良好的果酒發(fā)酵能力,且發(fā)酵過程中不會影響釀酒酵母的發(fā)酵特性。ZHANG等[24]比較了馬克斯克魯維酵母與釀酒酵母發(fā)酵的蘋果酒的代謝組學(xué)差異,結(jié)果表明馬克斯克魯維酵母發(fā)酵的蘋果酒具有更高含量的乙酸、乙酸乙酯和乙酸丙酯。與商業(yè)貝酵母相比,馬克斯克魯維酵母發(fā)酵的蘋果酒的總酚和酯類(乙酸-3-甲基-1-丁酯、辛酸乙酯、己酸乙酯)含量更高[52]。
部分非釀酒酵母屬酵母因其發(fā)酵能力較低,通常不能單獨(dú)完成酒精發(fā)酵。通過與釀酒酵母或非釀酒酵母屬酵母的混合接種,可以提高非釀酒酵母屬酵母的果酒發(fā)酵能力[15]。已有研究的非釀酒酵母屬酵母主要包括漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyeromyces)、Brettanomyces屬等[35,53-54]??唆斁S畢赤酵母(Pichiakluyeri)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauarum)混合發(fā)酵的蘋果酒,其葡萄糖和果糖含量顯著低于克魯維畢赤酵母單獨(dú)發(fā)酵的蘋果酒,揮發(fā)酸和醛類含量顯著高于2種酵母單獨(dú)發(fā)酵的蘋果酒[13]。Metschnikowiapulcherrima與釀酒酵母的順序接種能夠提高果酒中高級醇和酯類的含量,且乙醇含量較低(體積分?jǐn)?shù)0.9%~1.6%)[45]。馬克斯克魯維酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的果酒中2-苯乙醇和乙酸苯乙酯的產(chǎn)量高于釀酒酵母發(fā)酵的果酒[51]。此外,通過添加合適的營養(yǎng)物質(zhì)(碳源、氮源)也可以改善非釀酒酵母屬酵母的發(fā)酵能力[55]。GSCHAEDLER等[54]在蘋果汁中添加不同濃度的鎂、鋅和氮,馬克斯克魯維酵母、克魯維畢赤酵母、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)的乙醇產(chǎn)量均顯著增加,同時(shí)蘋果酒揮發(fā)性成分的組成也發(fā)生了顯著變化。
蘋果汁的前處理、發(fā)酵溫度、外源物質(zhì)的添加等均會影響蘋果酒的成分和感官品質(zhì)。
ROSEND等[56]探究了濃縮蘋果汁與鮮榨蘋果汁對蘋果酒發(fā)酵和產(chǎn)品品質(zhì)的影響,結(jié)果表明較高溫度下(30 ℃),釀酒酵母在濃縮果汁中的發(fā)酵速率稍慢,且對果糖的利用率降低;以濃縮果汁生產(chǎn)的蘋果酒中長鏈脂肪酸酯(癸酸乙酯、十二酸乙酯)的含量更高。在冰蘋果酒的生產(chǎn)中,相比低溫濃縮,低溫萃取制備的蘋果汁釀造的果酒具有更高的糖酸比和糖多酚比,且果香味更濃郁,澀味更低[57]。蘋果酒發(fā)酵過程中,溫度會影響酵母菌代謝,進(jìn)而影響蘋果酒的香氣組成。隨著發(fā)酵溫度的升高(17~20 ℃),蘋果酒的關(guān)鍵香氣成分(乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、異戊醇、苯乙醇和3-甲硫基-1-丙醇等)含量顯著增加,但過高的發(fā)酵溫度(20~26 ℃)則會導(dǎo)致香氣成分含量降低[58]。
研究人員嘗試通過天然產(chǎn)物、外源酶的添加來提升酒體的風(fēng)味,改善果酒的感官品質(zhì)。XU等[28]發(fā)現(xiàn)在蘋果汁中添加還原型谷胱甘肽能夠降低蘋果酒的色度值,保護(hù)綠原酸和根皮素,并能改變蘋果酒的香氣組成。在蘋果汁中加入蘋果渣酚類粗提物能夠增加發(fā)酵后酒體的色度值和苦澀感,且槲皮苷含量增加可使蘋果酒的抗氧化活性提升[59]。β-葡萄糖苷酶能夠顯著提高果酒中單萜的含量,起到改善果酒香氣的作用[60]。O2和脂類的缺乏會抑制發(fā)酵過程中酵母的生長和對糖的消耗,從而導(dǎo)致發(fā)酵不完全。ARELA等[61]的研究表明脂(甾醇和不飽和脂肪酸)和O2的加入能夠增加果酒中高級醇的含量,改變酯類物質(zhì)和揮發(fā)性脂肪酸的組成。
歐洲是蘋果酒的主要生產(chǎn)和消費(fèi)地區(qū),其蘋果酒品類多樣,且具有完善的蘋果酒生產(chǎn)和銷售體系。中國是世界第一大蘋果種植國,但主要以鮮食品種為主;且蘋果酒行業(yè)起步較晚,從釀酒蘋果品種、發(fā)酵菌種、生產(chǎn)工藝到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的建立還有待完善。蘋果酒的成分主要包括揮發(fā)性香氣物質(zhì)和非揮發(fā)性的糖、有機(jī)酸和多酚化合物等。酯類是蘋果酒中含量最高的香氣成分,多酚類物質(zhì)對蘋果酒的口感起重要作用。與揮發(fā)性成分相比,蘋果酒的非揮發(fā)性成分,尤其是多酚化合物的研究相對較少。蘋果原料(品種和成熟度)、釀酒微生物和發(fā)酵溫度等對蘋果酒的品質(zhì)有顯著影響。
未來,風(fēng)味多樣性的提升和口感的優(yōu)化,仍將是蘋果酒的研究熱點(diǎn)。以蘋果為主要原料,加入果蔬、香料等可食用的天然原料進(jìn)行混合發(fā)酵,是增加蘋果酒品類多樣性的方式。專用釀酒蘋果品種的篩選、多菌種的混合發(fā)酵以及特定的發(fā)酵溫度、時(shí)間等對蘋果酒品質(zhì)的影響需要進(jìn)一步的探究。微生物細(xì)胞工廠對于蘋果成分的轉(zhuǎn)換作用,微生物之間的相互作用對蘋果酒品質(zhì)的影響也應(yīng)得到更多關(guān)注。此外,發(fā)酵過程中特殊功能性成分的變化及其代謝機(jī)制的研究,將有助于理解酒體的色、味、氣以及成分的產(chǎn)生,為更好地控制釀酒過程提供指導(dǎo)。