扁核木屬植物葉綠體基因組特征分析

王 飛，趙文植，董章宏，馬路遙，李衛(wèi)英，夏茂甜，王正德，辛培堯*

扁核木屬植物葉綠體基因組特征分析

王 飛1,2，趙文植1,2，董章宏2，馬路遙1,2，李衛(wèi)英1,2，夏茂甜1,2，王正德1,2，辛培堯2*

1. 西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224

扁核木屬（）植物在中國(guó)分布有4個(gè)種，均具有極高的食用和藥用價(jià)值。為解析扁核木屬植物的葉綠體基因組特征，基于現(xiàn)已發(fā)表的扁核木屬植物葉綠體基因組，利用相關(guān)生物信息學(xué)手段進(jìn)行其葉綠體基因結(jié)構(gòu)、SSR、密碼子偏好性和序列變異情況分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，2種扁核木屬植物葉綠體基因組大小介于159 179～ 168 206 bp之間，平均GC含量為37.3%，從編碼基因數(shù)目來(lái)看，僅相差2個(gè)tRNA，而蛋白編碼基因和rRNA數(shù)目均一致，種間具有較高的保守性；在扁核木和蕤核葉綠體全基因組序列中各檢測(cè)出分散重復(fù)49個(gè)，其中以正向重復(fù)和回文重復(fù)為主，占比達(dá)73%～82%，而串聯(lián)重復(fù)數(shù)目分別為49個(gè)和58個(gè)，經(jīng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR分析，分別在2種植物葉綠體基因組序列中分別篩選出100個(gè)和84個(gè)SSR位點(diǎn)，且多是以A/T堿基為主的單核苷酸重復(fù)類型；扁核木屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性分析發(fā)現(xiàn)GC3的堿基含量顯著低于GC1和GC2，說(shuō)明密碼子偏好以A、U結(jié)尾，ENC取值均大于48%，表明其密碼子偏性較弱，中性繪圖和PR2-plot分析發(fā)現(xiàn)自然選擇是影響扁核木屬植物密碼子使用偏好性的主要原因，通過建立高、低基因表達(dá)庫(kù)，以RSCU值為參考，確定了6個(gè)扁核木屬最優(yōu)密碼子。經(jīng)葉綠體基因組序列變異分析，根據(jù)核苷酸多態(tài)性指數(shù)>0.015篩選出-GUG-，UCCCAU和等3個(gè)高變區(qū)，以蕤核葉綠體基因組為參考，在扁核木葉綠體基因組編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)存在大量的插入、缺失和SNP突變位點(diǎn)，并在蕤核葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)該物種的特有基因。基于葉綠體基因組的間隔區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，4種扁核木屬植物可分為南系（扁核木、臺(tái)灣扁核木）和北系（蕤核、東北扁核木）兩類。研究結(jié)果可為扁核木屬植物的系統(tǒng)發(fā)育、分類鑒定及其資源的開發(fā)利用等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

扁核木屬；葉綠體基因組；特征分析；系統(tǒng)發(fā)育

扁核木屬（Royle）隸屬薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae），具有極高的藥用價(jià)值和保健作用。屬內(nèi)共有5個(gè)種，中國(guó)分布有4個(gè)種，分別是扁核木（）、蕤核（)、東北扁核木（）和臺(tái)灣扁核木（）[12]。已有相關(guān)扁核木屬植物的研究主要集中于其提取物藥理作用、生理特性、地理譜系和形態(tài)學(xué)分類、資源分布以及繁殖等方面[13-18]。但有關(guān)扁核木屬植物葉綠體基因組方面的研究報(bào)道相對(duì)較少，WANG等[19]基于扁核木質(zhì)體基因組測(cè)序，解析了其質(zhì)體基因組特征，通過與同科其他4個(gè)物種的葉綠體基因組比對(duì)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，為研究薔薇科植物葉綠體基因組進(jìn)化和突變模式提供了理論依據(jù)；而劉家奇等[15]則利用3個(gè)葉綠體DNA片段從譜系地理學(xué)的角度，分析了蕤核的遺傳結(jié)構(gòu)及種群歷史動(dòng)態(tài)。同年，研究人員報(bào)道了蕤核全葉綠體基因組序列，并簡(jiǎn)單闡述了其基本結(jié)構(gòu)[20]。

本研究基于NCBI庫(kù)中現(xiàn)已發(fā)表的2種扁核木屬植物完整葉綠體基因組序列，對(duì)比分析了葉綠體基因組的基本特征，檢測(cè)重復(fù)序列和SSR位點(diǎn)，解析密碼子使用模式和影響因素；利用比較基因組學(xué)分析核酸變異程度，并統(tǒng)計(jì)基因編碼區(qū)的突變數(shù)量及形式；通過系統(tǒng)發(fā)育樹來(lái)確定屬間各物種之間的親緣關(guān)系。以期為扁核木屬植物的分子鑒定、葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載南北方扁核木屬的代表植物扁核木和蕤核的完整葉綠體基因組序列，Genbank登錄號(hào)分別為MW332618、MZ270554。

1.2 方法

1.2.1 可視化處理 利用Geneious 8.1.3軟件對(duì)序列進(jìn)行可視化處理，統(tǒng)計(jì)葉綠體基因組大小、GC含量、基因數(shù)目，區(qū)劃葉綠體基因組，并計(jì)算各區(qū)長(zhǎng)度和GC含量等信息，運(yùn)用OGDRAW（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）在線軟件繪制扁核木屬植物葉綠體基因組物理圖譜。

1.2.2 重復(fù)序列與SSR分析 重復(fù)序列包括散在重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)，其中散在重復(fù)又包含了正向重復(fù)（forward repeats, F）、反向重復(fù)（reverse repeats, R）、回文重復(fù)（palindromic repeats, P）和互補(bǔ)重復(fù)（complement repeats, C）。散在重復(fù)序列利用REPuter軟件[21]進(jìn)行預(yù)測(cè)，參數(shù)設(shè)置為：最小長(zhǎng)度（minimum length）為30 bp，海明距離（hamming distance）為3；串聯(lián)重復(fù)序列通過在線Tandem Repeats Finder工具[22]進(jìn)行分析。使用MISA軟件[23]檢測(cè)扁核木屬植物葉綠體基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats, SSR），SSR搜索參數(shù)設(shè)置為：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)≥10，二核苷酸重復(fù)≥5，三核苷酸重復(fù)≥4，四核苷酸及以上核苷酸重復(fù)≥3。

1.2.3 葉綠體基因組學(xué)序列分析 以蕤核葉綠體基因組作為參考，利用在線工具M(jìn)AFFT v.7 （https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）及Geneious 8.1.3軟件檢測(cè)分析2種扁核木屬植物葉綠體基因組編碼基因變異位點(diǎn)上的差異。

1.2.4 密碼子偏好性分析 利用Geneious軟件各獲取了84條編碼蛋白質(zhì)的基因序列（CDS）。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，根據(jù)以下條件對(duì)CDS進(jìn)行篩選：（1）組成CDS的堿基必為A、T、C、G；（2）CDS的起始和終止密碼子正確，即ATG起始，TAA、TAG或TGA終止；（3）剔除長(zhǎng)度小于300 bp以及重復(fù)的CDS序列。最終分別獲得了52條符合條件的CDS用于后續(xù)分析。

(2)真實(shí)反映學(xué)習(xí)過程，暴露學(xué)習(xí)問題.動(dòng)態(tài)生成的課堂給了師生更多的探索空間，教師和學(xué)生更容易發(fā)現(xiàn)探索過程中遇到的問題，進(jìn)而針對(duì)性地解決這些問題，減少將來(lái)的麻煩.

①密碼子組成分析。密碼子第1、2、3位上堿基的種類和含量是評(píng)判密碼子使用模式有效指標(biāo)[24]。利用CodonW分析篩選出來(lái)的52條CDS的ENC值（有效密碼子數(shù)）和各氨基酸所對(duì)應(yīng)密碼子的RSCU值（相對(duì)同義密碼子使用度），并應(yīng)用在線程序CUSP（http://imed.med.ucm.es/EM-B-O-SS/）計(jì)算各基因總的GC含量及密碼子第1～3位上的GC含量，分別以GCall、GC1、GC2和GC3表示。

②中性繪圖。中性圖是以GC3值作為橫坐標(biāo)，每個(gè)基因的GC1和GC2的平均值GC12作為縱坐標(biāo)進(jìn)行散點(diǎn)圖的繪制，進(jìn)而分析二者相關(guān)性，以此來(lái)初步判斷影響密碼子使用偏好性的因素，圖中的每個(gè)點(diǎn)都作為獨(dú)立的基因存在[25]。

③PR2-plot分析。統(tǒng)計(jì)各密碼子第3位上各堿基含量，以A3/(A3+T3)值為縱坐標(biāo)、G3/(G3+C3)值為橫坐標(biāo)繪制偏倚圖，分析密碼子第3位上嘌呤（A、G）和嘧啶（C、T）的使用情況及關(guān)系，當(dāng)互補(bǔ)堿基含量相等時(shí)，即G=C，A=T，表明密碼子無(wú)偏向性[26]。

④最優(yōu)密碼子分析。根據(jù)ENC值大小分別對(duì)2種扁核木屬植物的葉綠體基因進(jìn)行排序，從兩端各選取基因總數(shù)的10%（5條）來(lái)建立高、低基因表達(dá)庫(kù)。利用CodonW軟件統(tǒng)計(jì)高、低表達(dá)基因的RSCU值，并計(jì)算ΔRSCU值（ΔRSCU= RSCU高表達(dá)-RSCU低表達(dá)），以RSCU>1且ΔRSCU≥0.08兩個(gè)條件為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選扁核木屬植物的最優(yōu)密碼子。

1.2.5 核苷酸變異分析 利用DnaSP 6軟件[27]分析扁核木和蕤核葉綠體基因組的核苷酸多樣性（），滑動(dòng)窗口長(zhǎng)度設(shè)為600 bp，步長(zhǎng)設(shè)為200 bp。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析 研究表明-間隔區(qū)能提供豐富的信息位點(diǎn)且引物通用，在種間及近親屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用廣泛[28]。因此，為了確定扁核木屬植物的系統(tǒng)發(fā)育位置及種間親緣關(guān)系，基于現(xiàn)已發(fā)表的4種扁核木屬植物葉綠體基因組的基因片段，利用RAxML 8.2.12軟件下的模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而分析扁核木屬植物系統(tǒng)發(fā)育位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組物理圖譜與基本特征

扁核木和蕤核的葉綠體基因組基本信息如表1所示。2種植物葉綠體基因組總長(zhǎng)度分別為168 206、159 179 bp，相差9027 bp。從編碼基因數(shù)來(lái)看，扁核木比蕤核少2條tRNA，即-UAG和-UGC，而蛋白編碼基因和rRNA數(shù)目沒有發(fā)生變化，分別是84個(gè)和8個(gè)。葉綠體基因組的GC含量相差也不大，分別為38.0%和36.6%。經(jīng)基因類別統(tǒng)計(jì)，在2種扁核木屬植物葉綠體基因組中各發(fā)現(xiàn)了18個(gè)含有內(nèi)含子的基因，其中含有1個(gè)內(nèi)含子的基因有15個(gè)，含有2個(gè)內(nèi)含子的基因有3個(gè)。值得注意的是，基因僅在蕤核葉綠體基因組中含有2個(gè)內(nèi)含子，而在扁核木葉綠體基因組中只含有1個(gè)內(nèi)含子。根據(jù)扁核木和蕤核的葉綠體全基因組序列，運(yùn)用在線軟件OGDRAW繪制出扁核木屬植物葉綠體基因組物理圖譜（圖1）。

表1 扁核木和蕤核葉綠體全基因組特征

圖1 扁核木屬植物葉綠體全基因組物理圖譜

2.2 重復(fù)序列與SSR分析

扁核木和蕤核葉綠體基因組中的分散重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)序列分別利用REPuter軟件和Tandem Repeats Finder軟件進(jìn)行分析，在2種植物葉綠體基因組中各鑒定出49個(gè)分散重復(fù)序列，其中扁核木中有30個(gè)正向重復(fù)、16個(gè)回文重復(fù)、2個(gè)反向重復(fù)和1個(gè)互補(bǔ)重復(fù)；而蕤核中有18個(gè)正向重復(fù)、22個(gè)回文重復(fù)、6個(gè)反向重復(fù)和3個(gè)互補(bǔ)重復(fù)。串聯(lián)重復(fù)序列分別有49個(gè)和58個(gè)（圖2A）。經(jīng)MISA軟件分析，在扁核木葉綠體基因組中共篩選出100個(gè)SSRs位點(diǎn)，其中單核苷酸重復(fù)有77個(gè)（均是A/T堿基重復(fù)，沒有C/G堿基重復(fù)）、雙核苷酸重復(fù)有3個(gè)、三核苷酸重復(fù)有3個(gè)、四核苷酸重復(fù)有7個(gè)、六核苷酸重復(fù)有8個(gè)，沒有五核苷酸重復(fù)類型；而在蕤核葉綠體基因組中僅篩選出84個(gè)SSRs位點(diǎn)，其中單核苷酸重復(fù)有59個(gè)（A/T堿基重復(fù)58個(gè)，C/G堿基重復(fù)1個(gè)），雙核苷酸重復(fù)（AT）11個(gè)、三核苷酸重復(fù)2個(gè)、四核苷酸重復(fù)10個(gè)、五核苷酸重復(fù)3個(gè)，無(wú)六核苷酸重復(fù)類型（圖2B）。

圖2 重復(fù)結(jié)構(gòu)與SSR類型

2.3 葉綠體基因組學(xué)序列分析

以蕤核葉綠體基因組作參考，檢測(cè)扁核木葉綠體基因組中蛋白質(zhì)編碼基因變異位點(diǎn)上的差異。其中，基因上的插入和缺失位點(diǎn)數(shù)均大于10，而基因上的插入和缺失總位點(diǎn)數(shù)更是達(dá)55個(gè)。其次是和基因，基因上的插入和缺失位點(diǎn)均有3個(gè)，插入位點(diǎn)最大有276 bp（圖3）。扁核木葉綠體基因組特有基因?yàn)?，蕤核特有基因?yàn)閁AGUGC和。

SNP（single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）標(biāo)記作為最豐富的突變類型，在扁核木葉綠體基因組編碼區(qū)共檢測(cè)到6971個(gè)SNP，包括4288個(gè)Ts（Transition，轉(zhuǎn)換）和2683個(gè)Tv（Transversion，顛換），Ts與Tv的比率是1.60∶1。其中，C與T之間的Ts有2247個(gè)，A與G之間的Ts有2041個(gè)；而A與T之間的Tv有728個(gè)，C與G之間的Tv有409個(gè)。在眾多替換位點(diǎn)中，基因上的替換位點(diǎn)占總替換位點(diǎn)數(shù)的20.63%，占有較高水平，說(shuō)明基因具有較高的進(jìn)化率（表2）。

圖3 扁核木葉綠體基因組的插入與缺失

表2 扁核木、蕤核葉綠體基因組編碼區(qū)單核苷酸突變情況

2.4 密碼子偏好性分析

2.4.1 密碼子組成分析 經(jīng)CodonW 1.4.2和在線CUSP分析，如表3所示，扁核木和蕤核葉綠體基因組密碼子第3位堿基中T3s分別是46.04%、46.46%，A3s分別是42.63%、43.09%，說(shuō)明扁核木屬植物的葉綠體基因組密碼子偏好A/U結(jié)尾。20～61是ENC的理論取值范圍，ENC值越接近20，其同義密碼子偏性越強(qiáng)，反之越弱。扁核木、蕤核的ENC值分別為48.74和48.43，說(shuō)明扁核木屬植物的密碼子偏好性較弱。

利用熱圖統(tǒng)計(jì)扁核木和蕤核編碼基因密碼子的相關(guān)參數(shù)值，行列名分別對(duì)應(yīng)每個(gè)基因的名稱和相關(guān)參數(shù)。如圖4所示，在2種扁核木屬植物中，基因不同，其GC含量也存在差異，多數(shù)基因的GC1和GC2含量高于GC3；扁核木和蕤核的ENC實(shí)際取值范圍分別為38.44～61.00和35.94～60.48，所有基因的ENC值均大于35，進(jìn)一步表明扁核木屬植物葉綠體基因密碼子偏性較弱。另外，和基因的ENC值在扁核木與蕤核間的極差均大于5，說(shuō)明同屬植物間部分基因的密碼子偏好性存在較大差異。

表3 扁核木和蕤核葉綠體基因組密碼子相關(guān)參數(shù)

圖4 扁核木和蕤核葉綠體編碼基因密碼子GC含量

2.4.2 中性繪圖分析 從圖5可以看出，扁核木GC12的取值介于0.34～0.52之間，GC3取值介于0.22～0.38之間，GC12與GC3相關(guān)系數(shù)=0.1975；蕤核GC12取值在0.31～0.54之間，GC3取值在0.22～0.37之間，GC12與GC3相關(guān)系數(shù)=0.2555，這說(shuō)明扁核木屬植物GC12與GC3的相關(guān)性弱，密碼子第1、2位與第3位之間堿基的相關(guān)性不顯著，進(jìn)化方式存在一定差異，進(jìn)而可判斷選擇壓力是影響密碼子偏好性的主要原因。

圖5 中性繪圖

2.4.3 PR2-plot分析 PR2-plot繪圖可直觀地看出密碼子第3位嘌呤（A、G）和嘧啶（C、T）的使用頻率，若各編碼基因在4個(gè)區(qū)域內(nèi)均勻分布，則4個(gè)堿基的使用頻率相等，密碼子偏好性完全受突變影響。從圖6中可以看出2種扁核木屬植物葉綠體基因分布并不均勻，多數(shù)基因匯集在右下方區(qū)域，從堿基使用頻率來(lái)看，T>A、G>C，密碼子第3位的嘧啶使用頻率高于嘌呤，說(shuō)明2種植物葉綠體基因組密碼子偏好性除了受突變的影響，還與其他因素有關(guān)。

圖6 PR2-plot繪圖

2.4.4 最優(yōu)密碼子確定 根據(jù)ENC值對(duì)2種扁核木屬植物葉綠體基因組CDS進(jìn)行排序，分別建立高、低表達(dá)基因庫(kù)，計(jì)算表達(dá)庫(kù)中密碼子的RSCU值和ΔRSCU值。以既符合高表達(dá)密碼子（ΔRSCU≥0.08）又符合高頻密碼子（RSCU>1）為條件來(lái)篩選最優(yōu)密碼子。結(jié)果如圖7所示，扁核木含有高表達(dá)密碼子29個(gè)，高頻密碼子24個(gè)，同時(shí)滿足高表達(dá)、高頻的最優(yōu)密碼子有15個(gè)，其中以U結(jié)尾的有9個(gè)，以A結(jié)尾的有6個(gè)；而蕤核含有高表達(dá)密碼子25個(gè)，高頻密碼子28個(gè)，同時(shí)滿足高表達(dá)、高頻的最優(yōu)密碼子有15個(gè)，其中7個(gè)以U結(jié)尾，7個(gè)以A結(jié)尾，還有1個(gè)以G結(jié)尾。通過對(duì)最優(yōu)密碼子的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)了2種植物中共有6個(gè)最優(yōu)密碼子，分別是UGU、UUA、GAA、CAA、AUU、GCU。

2.5 核苷酸多態(tài)性分析

利用DnaSP6軟件分析2種扁核木屬植物葉綠體基因組序列的核苷酸變異程度。結(jié)果表明大部分變異發(fā)生在LSC區(qū)域，且與SSC和IR區(qū)相比表現(xiàn)出更高的核苷酸變異。核苷酸多態(tài)性指數(shù)>0.015的3個(gè)間隔區(qū)均位于LSC區(qū)，分別為GUG（1～1362 bp），UCCCAU（39 550～41 465 bp）和（74 082～75 529 bp）（圖8）。

注：框選的密碼子為扁核木最優(yōu)密碼子； 框選的密碼子為蕤核最優(yōu)密碼子；加粗的密碼子為2種植物共有的最優(yōu)密碼子。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

以黑刺李（）為外類群，基于葉綠體基因組的間隔區(qū)序列構(gòu)建扁核木屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖9所示，系統(tǒng)發(fā)育樹以100%的支持率將4種扁核木屬植物劃分為2個(gè)小類，扁核木和臺(tái)灣扁核木聚為一類，蕤核和東北扁核木聚為另一類，由此可以看出，扁核木屬植物具有明顯的南北系分化。

圖8 扁核木屬植物葉綠體基因核苷酸多態(tài)性

圖9 基于葉綠體基因組的trnS-trnG間隔區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

SSR現(xiàn)已作為一種高效的分子標(biāo)記工具被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因標(biāo)定、種質(zhì)資源鑒定等方面[29-30]。利用SSR分析從2種扁核木屬植物葉綠體基因組中分別篩選出100個(gè)和84個(gè)SSR位點(diǎn)，其中多是以A/T堿基為主的單核苷酸重復(fù)類型，占總位點(diǎn)數(shù)的69.04%～77.00%；其次是二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸，但占比均不到10%，說(shuō)明隨著核苷酸數(shù)的增加，占比會(huì)逐漸降低。這與在柴胡屬植物葉綠體基因組得出的隨著拷貝數(shù)目的增加SSRs數(shù)量明顯減少這一結(jié)論相一致[31]。另外，二核苷酸及以上核苷酸重復(fù)單元也主要由A、T堿基組合而成，如二核苷酸重復(fù)（AT）、三核苷酸重復(fù)（AAT/ATT）、四核苷酸重復(fù)（AAAT/ATTT/AATT）等。蕤核葉綠體基因組中AT重復(fù)在二核苷酸重復(fù)類型中占到了100%，AAT/ATT重復(fù)在三核苷酸重復(fù)類型也占比100%，這進(jìn)一步說(shuō)明葉綠體基因組中的SSR序列組成堿基主要是A、T，較少有C、G串聯(lián)重復(fù)[32]。篩選出來(lái)的這些SSR位點(diǎn)可以為扁核木屬植物的種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析等研究提供分子標(biāo)記基礎(chǔ)。同時(shí)，核苷酸多樣性分析發(fā)現(xiàn)，>0.015的高變異區(qū)有3個(gè)，包括了9個(gè)基因（-GUG、、、-UCC、-CAU、），其中UCCCAU和之前已經(jīng)在不同植物中被檢測(cè)到作為高度可變的區(qū)域，其中一些被用作DNA條形碼[33-34]。

選用蕤核葉綠體基因組為參考，統(tǒng)計(jì)分析扁核木葉綠體基因組突變的數(shù)量、形式及特有基因。發(fā)現(xiàn)二者葉綠體基因組編碼區(qū)存在大量的插入、缺失和SNP突變位點(diǎn)，從而導(dǎo)致扁核木和蕤核葉綠體基因組大小以及以和等為代表的編碼基因序列存在較大差異，這些差異顯著的基因?qū)⒂兄诤笃诘奈锓N分類研究。WANG等[19]通過薔薇科葉綠體基因組進(jìn)化和突變模式的研究，發(fā)現(xiàn)在所有蛋白編碼基因中序列的分化程度最高，相比其他基因更有助于物種區(qū)分，這與本研究結(jié)果一致。相關(guān)研究表明，第四紀(jì)以來(lái)多次氣候（冰期與間冰期）的周期性波動(dòng)很大程度上影響了現(xiàn)今植物種群分布和遺傳格局[35]。劉家奇等[15]基于葉綠體基因組、和片段分析發(fā)現(xiàn)蕤核與我國(guó)北方多數(shù)植物類群一樣，其遺傳結(jié)構(gòu)受氣候及環(huán)境影響有著明顯的遺傳分化。而經(jīng)基因類型比較，在蕤核葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)多個(gè)新編碼基因，推測(cè)其可能與北方長(zhǎng)期特殊的氣候和環(huán)境響應(yīng)有關(guān)。

葉綠體基因組間隔區(qū)序列不受基因功能限制，進(jìn)化速率快。研究表明-間隔區(qū)能提供豐富的信息位點(diǎn)且引物通用，在種間及近親屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用廣泛[28]。因此，本研究基于扁核木屬葉綠體基因組的間隔區(qū)序列來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將4種扁核木屬植物按遺傳距離及親緣關(guān)系遠(yuǎn)近劃分為南系（扁核木、臺(tái)灣扁核木）和北系（蕤核、東北扁核木）兩類。而陸玲娣[36]根據(jù)花蕊數(shù)量分類以及楊瑞林等[16]根據(jù)葉表皮角質(zhì)膜及花粉外壁條脊排列形態(tài)進(jìn)行聚類分析的研究結(jié)論與此一致。同時(shí)，通過核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)在> 0.015的高變區(qū)內(nèi)，具有較顯著的多態(tài)性，大小為1039 bp，進(jìn)一步說(shuō)明葉綠體基因組中的基因片段用于扁核木屬植物的分類鑒定是可行的。

扁核木屬植物葉綠體基因組同義密碼子偏好以A/T結(jié)尾，這與多數(shù)陸生植物的研究結(jié)果一致，如：槲蕨屬[37]、石斛屬[38]植物等，并且扁核木葉綠體基因組中篩選出來(lái)的SSR序列也多是A、T串聯(lián)重復(fù)，這可能與陸生植物葉綠體基因組富含A、T堿基且進(jìn)化相對(duì)保守等有關(guān)。

同義密碼子使用偏倚現(xiàn)象在絕大多數(shù)生物中均存在，但偏倚程度卻因物種不同而異[39]。相關(guān)研究表明，造成密碼子使用偏倚的原因并非單一因素所決定的，各物種在不同的環(huán)境中長(zhǎng)期受選擇壓力、堿基突變、基因漂移等多因素影響，而密碼子使用偏性就是在這個(gè)復(fù)雜的物種選擇進(jìn)化過程中形成的[40-41]。密碼子第3位上的堿基突變不改變氨基酸類型，受到的選擇壓力較小[42]。因此，本研究基于GC3含量通過中性繪圖分析發(fā)現(xiàn)自然選擇是影響扁核木屬植物密碼子偏好性的主導(dǎo)因素。另外，從PR2-plot繪圖可看出密碼子第3位嘌呤（A、G）和嘧啶（C、T）的使用頻率不盡相同，T＞A、G＞C，說(shuō)明2種植物葉綠體基因組密碼子偏好性除了受突變的影響，還與選擇、堿基組成等其他因素有關(guān)。這與香花枇杷[10]、燈盞花[43]、杜梨[44]等植物葉綠體基因組密碼子偏好性分析結(jié)果一致，說(shuō)明選擇和突變是造成植物密碼子偏倚的主要?jiǎng)恿?lái)源。

[1] HENRY D, IN C S, YU M, CHANG W J. Chloroplast genomes: diversity, evolution and applications in genetic engineering[J]. Genome Biology, 2016, 17(1): 134.

[2] PARK I Y, SONG J H, YANG S Y, MOON B C. Comparative analysis ofchloroplast genomes and molecular marker development for the identification of authentic[J]. Plants, 2020, 9(2): 157.

[3] CLAUDIA L H, ABDULLAH, IBRAR A, MONICA M C, ALEJANDRO Z, THOMAS B C, MICHAEL R M. Evolutionary dynamics of chloroplast genomes in subfamily(Araceae)[J]. Genomics, 2020, 112(3): 2349-2360.

[4] 段義忠, 張 凱. 沙冬青屬植物葉綠體基因組對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2020, 40(8): 1323-1332.

DUAN Y Z, ZHANG K. Comparative analysis and phylogenetic evolution of the complete chloroplast genome of[J]. Northwestern Journal of Botany, 2020, 40(8): 1323-1332. (in Chinese)

[5] 德 偉, 張一鳴. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)[M]. 南京: 東南大學(xué)出版社, 2018.

DE W, ZHANG Y M. Biochemistry and molecular biology[M]. Nanjing: Southeast University Press, 2018. (in Chinese)

[6] 王 婧, 王天翼, 王羅云, 張建國(guó), 曾艷飛. 沙棗葉綠體全基因組序列及其使用密碼子偏性分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2019, 39(9): 1559-1572.

WANG J, WANG T Y, WANG L Y, ZHANG J G, ZENG Y F. Assembling analysis of the whole chloroplast genome sequence ofand its codon usage bias[J]. Northwest Botany, 2019, 39(9): 1559-1572. (in Chinese)

[7] LIU S S, QIAO Z Q, WANG X M, ZENG H J, LI Y X, CAI N, CHEN Y. Analysis of codon usage patterns in “l(fā)onicerae flos” (Hand.-Mazz.) based on transcriptome data[J]. Gene, 2019(705): 127-132.

[8] 王占軍, 丁 亮, 蔡倩文, 李 杰, 吳子琦, 姚懷桐, 王 悅, 焦春燕, 歐祖蘭, 徐忠東, 施季森, 陳金慧. 3種木薯全基因組的密碼子偏好性模式與變異來(lái)源比較[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2021, 27(4): 1013-1021.

WANG Z J, DING L, CAI Q W, LI J, WU Z Q, YAO H T, WANG Y, JIAO C Y, OU Z L, XU Z D, SHI J S, CHEN J H. Comparison of codon preference patterns and variation so-u-rces in cassavagenomes[J]. Journal of Application and Envir-onmental Biology, 2021, 27(4): 1013-1021. (in Chinese)

[9] 辛雅萱, 黎若竹, 李 鑫, 陳麗瓊, 唐軍榮, 屈亞亞, 楊琳懿, 辛培堯, 李云芳. 杧果葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 41(9): 148-156, 165.

XIN Y X, LI R Z, LI X, CHEN L Q, TANG J R, QU Y Y, YANG L Y, XIN P Y, LI Y F. Analysis on codon usage bias of chloroplast genome in[J]. Journal of Central South University of Forestry & Technology, 2021, 41(9): 148-156, 165. (in Chinese)

[10] 屈亞亞, 辛 靜, 馮發(fā)玉, 董章宏, 瞿紹宏, 王海洋, 李 斌, 辛培堯. 香花枇杷質(zhì)體基因組序列密碼子偏性分析[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2021, 36(4): 138-144, 158.

QU Y Y, XIN J, FENG F Y, DONG Z H, QU S H, WANG H Y, LI B, XIN P Y. Codon usage bais in chloroplast genome ofChamp. ex Benth.[J]. Journal of Northwestern Forestry College, 2021, 36(4): 138-144, 158. (in Chinese)

[11] 原曉龍, 劉 音, 康洪梅, 陳中華, 李云琴, 王 毅. 蒜頭果葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 2021, 41(3): 15-22.

YUAN X L, LIU Y, KANG H M, CHEN Z H, LI Y Q, WANG Y. Analysis of codon usage bias in chloroplast genome of[J]. Journal of Southwest Forestry University (Natural Sciences), 2021, 41(3): 15-22. (in Chinese)

[12] 周海燕, 楊峻山. 扁核木屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2011, 13(5): 44-47.

ZHOU H Y, YANG J S. Progress in chemical composition and pharmacological action of[J]. Modern Chinese Medicine, 2011, 13(5): 44-47. (in Chinese)

[13] 解仲伯, 林華慶, 余楚欽, 王遠(yuǎn)蘋. 青刺果各類提取物的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中成藥, 2016, 38(12): 2651-2656.

XIE Z B, LIN H Q, YU C Q, WANG Y P. Progress in the pharmacological effects of various extracts of[J]. Chinese Patent Medicine, 2016, 38(12): 2651-2656. (in Chinese)

[14] 李新蕾, 李葉芳, 李鳳榮, 關(guān)文靈. 干旱脅迫對(duì)扁核木種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 2020, 35(4): 682-687.

LI X L, LI Y F, LI F R, GUAN W L. Effects of drought stress on seed germination and seedling physiological characteristics of[J]. Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Sciences), 2020, 35(4): 682-687. (in Chinese)

[15] 劉家奇, 付孟嬌, 吳海洋, 田 斌. 基于葉綠體DNA的黃土高原特有植物蕤核的譜系地理學(xué)[J]. 廣西植物, 2021, 41(3): 396-403.

LIU J Q, FU M J, WU H Y, TIAN B. Phylogeography of the Loess Plateau endemic plantinferred from the chloroplast DNA[J]. Guangxi Plants, 2021, 41 (3): 396-403. (in Chinese)

[16] 楊瑞林, 魏學(xué)智. 中國(guó)扁核木屬植物花粉和葉表皮微形態(tài)研究[J]. 植物研究, 2015, 35(2): 172-178.

YANG R L, WEI X Z. Micromorphological observations on leaf epidermis and pollen ofRoyle in China[J]. Plant Research, 2015, 35(2): 172-178. (in Chinese)

[17] 葉俊偉, 田 斌. 中國(guó)西南地區(qū)重要木本油料植物扁核木的遺傳結(jié)構(gòu)及成因[J]. 生物多樣性, 2021, 29(12): 1629-1637.

YE J W, TIAN B. Genetic structure and causes of an import-ant woody oil plants in Southwest China of[J]. Biodiversity, 2021, 29(12): 1629-1637. (in Chinese)

[18] 范志遠(yuǎn), 習(xí)學(xué)良, 歐陽(yáng)和, 陳 武, 廖永堅(jiān), 鄒偉烈. 青刺果的植物學(xué)特性及其人工栽培技術(shù)[J]. 西部林業(yè)科學(xué), 2005(4): 47-52, 66.

FAN Z Y, XI X L, OU Y H, CHEN W, LIAO Y J, ZOU W L. Phyany properties ofand their artificial cultivation techniques[J]. Western Forestry Science, 2005(4): 47-52, 66. (in Chinese)

[19] WANG S, SHI C, GAO L Z. Plastid genome sequence of a wild woody oil species,, provides insights into evolutionary and mutational patterns of Rosaceae chloroplast genomes[J]. Public Library of Science, 2017, 8(9): 73946.

[20] WANG Y L, NIU Y, QIANG Z, TIAN Y, LI Y. The complete chloroplast genome of(Rosaceae), a medicinal plant found in northwest China[J]. Mitochondrial DNA Part B, 2021, 6(10): 3057-3058.

[21] KURTZ S, CHOUDHURI J V, OHLEBUSCH E, SCHLE-IERMACHER C, STOYE J, GIEGERICH R. REPuter: the m-a-nifold applications of repeat analysis on a genomic sc-ale[J]. Nucleic Acids Research, 2001(29): 4633-4642.

[22] BENSON G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences[J]. Nucleic Acids Research, 1999(27): 573- 580.

[23] 王 希, 陳 麗, 趙春雷. 利用MISA工具對(duì)不同類型序列進(jìn)行SSR標(biāo)記位點(diǎn)挖掘的探討[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016, 32(10): 150-156.

WANG X, CHEN L, ZHAO C L. Exploration of SSR marker site mining for different types of sequences using the MISA tools[J]. China Agriculture Bulletin, 2016, 32(10): 150-156. (in Chinese)

[24] 傅建敏, 索玉靜, 劉慧敏, 譚曉風(fēng). 柿屬植物葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因密碼子用法[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 2017, 35(2): 38-44.

FU J M, SUO Y J, LIU H M, TAN X F. Codon usage of chloroplast protein-coding genes in[J]. Economic Forest Study, 2017, 35(2): 38-44. (in Chinese)

[25] JIANG Y, DENG F, WANG H L, HU Z H. An extensive analysis on the global codon usage pattern of baculoviruses[J]. Archives of Virology, 2008, 153(12): 2273.

[26] YANG G F, SU K L, ZHAO Y R. Analysis of codon usage in the chloroplast genome of[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2015, 6(12): 171-179.

[27] 杜致輝, 楊 瀾, 張朝君, 許紅娟, 陳之林. 黑喉石斛葉綠體基因組特征及比較分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2021, 42(11): 3111-3119.

DU Z H, YANG L, ZHANG C J, XU H J, CHEN Z L. Characteristics of the complete chloroplast genome ofand its comparative analysis[J]. Journal of Tropical Crops, 2021, 42(11): 3111-3119. (in Chinese)

[28] 董雷雷. 葉籽銀杏序列分析及系統(tǒng)發(fā)育研究[D]. 濟(jì)南: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

DONG L L.sequence analysis and phylogenetic study ofL.[D]. Jinan: Shandong Agricultural University, 2009. (in Chinese)

[29] 耿樹香, 楊生超, 寧德魯, 李勇杰. 麗江油橄欖品種表型及SSR標(biāo)記的多樣性及聚類分析[J]. 西部林業(yè)科學(xué), 2018, 47(6): 30-34.

GENG S X, YANG S C, NING D L, LI Y J. Diversity and cluster analysis ofphenotype and SSR markers in Lijiang[J]. Western Forestry Science, 2018, 47(6): 30-34. (in Chinese)

[30] CHMIELEWSKI M, MEYZA K, CHYBIKI I J, DZIALUK A, LITKOWIEC M, BURCZYK J. Chloroplast microsatellites as a tool for phylogeographic studies: the case of white oaks in Poland[J]. iForest Biogeosciences and Forestry, 2015(8): 765-771.

[31] 張明英, 張雨曲, 李依民, 高 靜, 沈 霞, 楊新杰, 顏永剛, 王昌利, 張 崗. 北柴胡、紫花闊葉柴胡葉綠體全基因組解析及柴胡屬藥用植物葉綠體基因組比較與系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 56(2): 618-629.

ZHANG M Y, ZHANG Y Q, LI Y M, GAO J, SHEN X, YANG X J, YAN Y G, WANG C L, ZHANG G. Complete plastid genomes ofDC. andH. Wolff, with comparative and phylogenetic analyses of medicinalspecies[J]. Pharmaceutical Journal, 2021, 56(2): 618-629. (in Chinese)

[32] KUANG D Y, WU H, WANG Y L, GAO L M, ZHANG S Z, LU L. Complete chloroplast genome sequence of(Magnoliaceae): implication for DNA barcoding and population genetics[J]. Genome, 2011(54): 663-673.

[33] HU Y, WOESTE K E, ZHAO P. Completion of the chloroplast genomes of five Chineseand their contribution to chloroplast phylogeny[J]. Frontiers in Plant Science. 2016(7): 1955.

[34] LI X, YANG Y, HENRY R J, ROSSETTO M, WANG Y T, CHEN S L. Plant DNA barcoding: from gene to genome[J]. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society, 2015, 90(1): 157-166.

[35] PROVAN J, BENNETT K D. Phylogeographic insights into cryptic glacial refugia[J]. Trends in Ecology and Evolution, 2008, 23(10): 564-571.

[36] 陸玲娣. 中國(guó)植物志: 第38卷[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1986.

LU L D. Chinese flora: Volume 38[M]. Beijing: Science Press, 1986. (in Chinese)

[37] 沈宗芳, 陸添權(quán), 張志榮, 蔡傳濤, 田 波. 槲蕨屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 廣西植物, 2021, 41(2): 266-273.

SHEN Z F, LU T Q, ZHANG Z R, CAI Z T, TIAN B. Analysis of codon preference in the chloroplast genome of[J]. Guangxi Plants, 2021, 41(2): 266-273. (in Chinese)

[38] 王曉雙, 楊 芳, 羅 茜, 劉映良, 朱 斌. 石斛屬葉綠體基因組密碼子使用偏性及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 分子植物育種, 2021(3): 1-22.

WANG X S, YANG F, LUO Q, LIU Y L, ZHU B. Codon usage bias and phylogenetic analysis of chloroplast genome of[J]. Molecular Plant Breeding, 2021(3): 1-22. (in Chinese)

[39] LI G L, PAN Z L, GAO S C, HE Y Y, XIA Q Y, JIN Y, YAO H P. Analysis of synonymous codon usage of chloroplast genome in[J]. Genes and Genomics, 2019, 41(10): 1173-1181.

[40] XU C, CAI X M, CHEN Q Z, ZHOU H X, CAI Y, BEN A L. Factors affecting synonymous codon usage bias in chloroplast genome ofRamsey[J]. Evolutionary Bioinformatics, 2011(7): 271-278.

[41] TANG D F, WEI F, CAI Z Q, WEI Y Y, KHAN A, MIAO J H, WEI K H. Analysis of codon usage bias and evolution in the chloroplast genome ofBenth[J]. Development Genes and Evolution, 2020, 11(4): 670-679.

[42] 葉友菊, 倪州獻(xiàn), 白天道, 徐立安. 馬尾松葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2018, 37(10): 4464-4471.

YE Y J, NI Z X, BAI T D, XU L A. Codon preference analysis ofchloroplast genome[J]. Genomics and Applied Biology, 2018, 37(10): 4464-4471. (in Chinese)

[43] 李顯煌, 楊生超, 辛雅萱, 屈亞亞, 楊琳懿, 馮發(fā)玉, 范 偉, 辛培堯. 燈盞花葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 2021, 36(3): 384-392.

LI X H, YANG S C, XIN Y X, QU Y Y, YANG L Y, FENG F Y, FAN W, XIN P Y. Analysis of the codon usage bias of chloroplast genome in(Vant.) Hand- Mazz[J]. Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Sciences), 2021, 36(3): 384-392. (in Chinese)

[44] 辛雅萱, 董章宏, 瞿紹宏, 劉 成, 葉 鵬, 辛培堯. 杜梨葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 43(6): 51-59.

XIN Y X, DONG Z H, QU S H, LIU C, YE P, XIN P Y. Analysis on codon usage bias of chloroplast genome inBge.[J]. Journal of Hebei Agricultural University, 2020, 43(6): 51-59. (in Chinese)

Analysis of Chloroplast Genome Characteristics of

WANG Fei1,2, ZHAO Wenzhi1,2, DONG Zhanghong2, MA Luyao1,2, LI Weiying1,2, XIA Maotian1,2, WANG Zhengde1,2, XIN Peiyao2*

1. Southwest Research Center for Landscape Architecture Engineering, State Forestry and Grassland Administration, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650224, China; 2. Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Southwest China, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650224, China

There are four species ofRoyle in China, which have high edible and medicinal value. In order to elucidate the chloroplast genome characteristics of, we analyzed the chloroplast genome structure, simple sequence repeats (SSR) loci, the preference of the codon, and sequence variation using bioinformatics methods based on the published chloroplast genome sequences of, and constructed a phylogenetic tree in. The results showed that the chloroplast genome sizes ofwere ranged from 159 179 bp to 168 206 bp, and the average GC content was 37.3%. In terms of the number of coding genes, only two tRNAs were different, while the number of protein-coding genes and rRNA were all consistent, showing a high level of conservation between species. A total of 49 dispersed repeats were detected in the chloroplast genomes ofand, including mainly forward and palindromic repeats, accounting for 73% to 82%, while the number of tandem repeats was 49 and 58, respectively. By the simple repetitive sequence (SSR) analysis, 100 and 84 SSRs loci were detected respectively in the chloroplast genome sequence ofand, and most of SSRs were single nucleotide repeats with A/T base. The codon bias analysis of chloroplast genome offound that the base content of GC3 was significantly lower than that of GC1 and GC2, indicating that the codon preference ended with A and U, and the effective number of codon (ENC) values was all greater than 48%, indicating that the codon bias was weak. Analysis of Neutral-plot and PR2-plot showed that natural selection was the main factor affecting the codon preference ofBy establishing high and low gene expression libraries and using RSCU values as reference, six optimal codons ofwere identified. Three highly variable regions-GUG-,UCCCAUandwere screened by the chloroplast genome sequence variation analysis with nucleotide polymorphism index Pi>0.015. Taking the chloroplast genome ofas a reference, a large number of insertions, deletions and SNP mutations were found in the coding region of chloroplast genome in, and several unique genes ofchloroplast genome were found. Based on the phylogenetic trees byspacers in the chloroplast genomes of, there were two groups in the four species of, one was southern (), and the other was northern (). The present study would provide a theoretical basis for study of the phylogeny, taxonomic identification and resource exploitation of the genus in.

Royle; chloroplast genome; characteristics analysis; phylogeny

Q732

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.09.002

2022-02-15；

2022-03-09

云南省科技廳科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（No. 2018BB005）.

王 飛（1996—），男，碩士研究生，研究方向：林木分子生物學(xué)與遺傳改良。*通信作者（Corresponding author）：辛培堯（XIN Peiyao），E-mail：xpytgyx@163.com。