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      β-catenin基因?qū)献髫i絨毛生長發(fā)育的影響

      2022-10-19 00:28:56孔夢潔耿永琪秦永斌黃曉宇滾雙寶
      甘肅畜牧獸醫(yī) 2022年10期
      關鍵詞:臀部毛囊肩部

      孔夢潔,耿永琪,楊 磊,秦永斌,黃曉宇,2*,滾雙寶,2

      (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術研究中心,甘肅 蘭州 730070)

      合作豬又被稱為蕨麻豬、山豬,具有適應高海拔惡劣環(huán)境、抗寒、抗病、耐粗飼等特點,個體較小,體軀較短,四肢結(jié)實緊湊,周身被毛黑色,少數(shù)出現(xiàn)棕色。寒冷季節(jié),合作豬身上會長出棕色絨毛,溫暖炎熱季節(jié)身上絨毛退化,直至消失,這種現(xiàn)象可能與合作豬周期性生長絨毛以抵御寒冷環(huán)境,從而適應高海拔高寒地區(qū)的環(huán)境有關。因此,探究合作豬絨毛生長相關基因?qū)τ谘芯亢献髫i的抗寒性能具有重要意義。

      β-catenin基因是機體內(nèi)一種重要的功能蛋白,可與很多蛋白相互結(jié)合形成復合體[1-2]。其遍布動物體各個結(jié)構(gòu)中,功能十分豐富,且在動物進化過程中非常保守。截至目前,主要在動物間質(zhì)組織和上皮組織中發(fā)現(xiàn)了β-catenin基因的存在。研究證實,β-catenin基因在毛發(fā)生長中具有調(diào)節(jié)作用。當β-catenin基因發(fā)生突變或被敲除后,存在于動物體皮膚中的毛囊則不會繼續(xù)發(fā)育,而補償缺失的β-catenin基因后,毛囊又會長出新的毛發(fā),這充分說明β-catenin基因在毛囊生長發(fā)育過程中是必須存在的[3-4]。還有研究表明,在毛囊的發(fā)生發(fā)育過程中β-catenin基因會被激活,以此促進細胞的增殖分化,從而促進毛囊結(jié)構(gòu)的發(fā)生發(fā)育[5]。此外,Plikus等[6]以小鼠皮膚組織作為模型探究毛囊膨出處的毛干細胞調(diào)控機制時,發(fā)現(xiàn)β-catenin基因在炎熱與寒冷環(huán)境下分別表現(xiàn)為高活性和低活性,說明其在毛干細胞調(diào)控過程中與溫度變化呈正相關。目前關于β-catenin基因的研究主要是圍繞人體β-catenin基因開展,而關于豬β-catenin基因及其在絨毛生長發(fā)育過程中的研究鮮有報道。

      本試驗以夏季和冬季的合作豬皮膚組織為研究材料,通過qRT-PCR探究β-catenin基因在合作豬絨毛生長過程中的表達特征及作用。

      1 材料與方法

      1.1 試驗材料

      1.1.1 實驗動物 本研究以甘南州迭部縣8月齡合作豬為研究對象,在夏季極熱和冬季極冷的時間點采集5 cm×1 cm的豬皮膚。具體采集頸部、肩部、側(cè)部、臀部等組織樣品作為本次試驗樣品。

      1.1.2 主要試劑、耗材 Trizol新型RNA抽提劑、2*Taq PCR MasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP Mixture、Oligo dT Primer、RNase Inhibitor、DNA凝膠回收試劑盒等。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 樣品采集 在夏季極熱和冬季極冷時間點分別選擇健康的8 月齡合作豬各20 頭。將兩組試驗對象宰殺后,在無菌條件下采集其頸部、肩部、側(cè)部、臀部等部位大小為5 cm×1 cm的皮膚組織樣品備用,將樣品在液氮中快速冷凍,放到-80 ℃冰箱存放。

      1.2.2 引物設計與合成 以GenBank中的豬β-catenin基因核苷酸序列為參考,運用NCBI中的Primer Premier 5.0和Primer-BLAST工具,按照定量引物設計的一般原則,設計本次實時熒光定量PCR分析試驗所需的特異性引物,并由陜西中科羽瞳生物科技有限公司合成,引物信息如表1所示。

      表1 引物信息

      1.2.3 RNA提取與cDNA模板合成 采用Trizol試劑抽提合作豬仔豬的臀部、側(cè)部、肩部和頸部等部位組織的RNA,分別運用凝膠電泳法、分光光度計法檢測所抽提的RNA(驗證完整性和純度),將得到的cDNA放到-20 ℃冰箱保存。

      1.2.4 實時熒光定量PCR 分別以不同部位組織的cDNA為模板,以GAPDH基因為內(nèi)參基因,采用qRT-PCR檢測β-catenin基因在合作豬臀部、側(cè)部、頸部和肩部等組織的表達量。qRTPCR反應體系、反應條件分別見表2、表3。為減少試驗誤差,每組設3個重復,用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

      表2 qRT-PCR反應體系

      表3 qRT-PCR反應條件

      2 結(jié)果與分析

      2.1 β-catenin基因擴增曲線

      從β-catenin基因的擴增曲線可以看出(圖1),雖然曲線在平臺期有所變化,但在指數(shù)增長區(qū)域的重復性非常好,說明適宜進行聚合酶鏈式反應(PCR)的定量分析。

      圖1 β-catenin基因的擴增曲線

      2.2 β-catenin基因溶解曲線

      如圖2所示,β-catenin基因的溶解曲線峰形為單一窄峰,無雜峰出現(xiàn),說明該試驗所設計的引物特異性良好,可以進行后續(xù)試驗分析。

      圖2 β-catenin基因的溶解曲線

      2.3 β-catenin基因在不同組織中的表達

      通過qRT-PCR檢測合作豬各組織中β-catenin基因的表達水平(表4、圖3),發(fā)現(xiàn)合作豬4個部位中β-catenin基因的表達量夏季均高于冬季,說明β-catenin基因的表達量與溫度變化呈正比。此外,冬季合作豬β-catenin基因在肩部(0.85±0.13)和臀部(0.79±0.14)的表達量相比側(cè)部(0.62±0.11)和頸部(0.50±0.077)要高,而夏季肩部(0.85±0.14)和臀部(0.89±0.0071)較側(cè)部(1.00±0.08)和頸部(0.92±0.091)的表達量低,說明合作豬肩部和臀部的β-catenin基因隨著溫度變化表達量較為恒定,而側(cè)部和頸部的β-catenin基因表達量隨溫度變化起伏較大。以上結(jié)果表明,合作豬β-catenin基因與溫度變化呈正相關,但隨著溫度的變化,肩部和臀部的β-catenin基因表達較為恒定,這或許是冬季合作豬肩部和臀部絨毛生長的原因之一,但具體分子調(diào)控機制還有待研究。

      表4 熒光定量分析結(jié)果

      圖3 β-catenin基因在合作豬夏、冬季節(jié)不同組織中的表達水平

      3 討論

      毛囊的生長發(fā)育依靠多種信號分子的共同作用,其中大部分的信號分子屬于Wnt信號通路以及一些其他傳導通路和因子等。上皮細胞和真皮細胞受到這些信號分子的共同作用,促進細胞的增殖與分化,并最終形成毛囊結(jié)構(gòu)。Wnt/β-catenin信號通路與分子激活在毛囊的生長和發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用[7]。β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中的主要調(diào)控蛋白中的一種,具有促進細胞增殖的作用[8]。β-catenin基因是毛發(fā)生成過程中的重要存在,其突變會導致毛囊基板的產(chǎn)生被阻斷,敲除毛囊中β-catenin基因會導致毛發(fā)掉落[9]。目前關于β-catenin基因的研究主要是圍繞人體β-catenin基因開展,而關于豬β-catenin基因及其在絨毛生長發(fā)育過程中的相關研究較少。

      動物絨毛的生長是季節(jié)性變化的,大部分動物皮膚表層會在秋冬季節(jié)長出絨毛,依靠絨毛的防寒性能抵御寒冷[10]。季節(jié)性換毛是動物為了應對環(huán)境溫度的變化所作出的適應性反應[11]。合作豬絨毛的生長同樣具有季節(jié)性,秋季新生絨毛生長出體表,秋冬季快速生長,冬春寒冷季節(jié)絨毛密度達到最大,以此抵御寒冷環(huán)境氣候。本試驗利用qRT-PCR方法檢測了夏冬兩季合作豬頸部、肩部、體側(cè)和臀部皮膚組織中β-catenin基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)β-catenin基因的表達量夏季高于冬季,且頸部和側(cè)部中β-catenin基因的表達量夏季顯著高于冬季(P<0.05),但肩部和臀部中β-catenin基因的表達量隨溫度變化較為恒定。以上結(jié)果與Plikus等[6]對β-catenin基因在不同季節(jié)小鼠皮膚中的變化規(guī)律結(jié)果相一致,即合作豬皮膚中β-catenin基因的mRNA表達量與溫度變化呈正相關。在整個絨毛生長過程中,β-catenin基因的mRNA表達量在夏冬兩季存在差異,尤其在冬季絨毛生長發(fā)育最迅速的時期,其表達量在頸部和側(cè)部顯著降低,但肩部和臀部的表達量與夏季相比較為恒定,表明β-catenin基因的表達可能調(diào)控絨毛的發(fā)生[12-13],同時β-catenin基因?qū)γ腋杉毎只鹱饔肹6],從而影響絨毛生長,但具體調(diào)控機制還有待研究。

      4 結(jié)論

      通過檢測夏季和冬季β-catenin基因在合作豬豬體中的表達變化,發(fā)現(xiàn)合作豬β-catenin基因在頸部與側(cè)部中的表達量夏季顯著高于冬季(P<0.05)。因此推測β-catenin基因與合作豬周期性絨毛生長有關。本研究結(jié)果可為探索合作豬絨毛生長調(diào)控分子機制和毛發(fā)周期性生長調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

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