莫金英 余 希 周 靜 肖蒲軍 瞿志軍

深圳市龍崗中心醫(yī)院感染科，廣東深圳 518116

據(jù)統(tǒng)計，全球大約有2.4億人感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）。在我國，HBV的感染者超過9000萬例。目前，主要通過核苷（酸）類藥物[nucleos （t）ide analogues，NAs]抑制乙肝病毒脫氧核糖核酸（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA）的復制，延緩肝硬化、肝癌的發(fā)生。長期的抗病毒治療不僅會帶來乳酸酸中毒、腎功能損害、肌炎等藥物相關毒副作用，還會增加患者的經(jīng)濟及心理負擔，部分患者因無法忍受長期服藥而自行停藥，從而導致肝炎再活動甚至肝衰竭、肝硬化的發(fā)生。因此，尋找有效的生物學標志物評估患者停藥的安全性仍是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）治療中急需解決的問題之一。共價閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸（covalently closed circular deoxyribonucleic acid，cccDNA）是導致CHB患者停藥后復發(fā)的重要原因。相關研究表明，乙肝病毒前基因組核糖核酸（hepatitis B virus prege nomic ribonucleic acid，HBVpgRNA）是HBV復制的中間產(chǎn)物，由cccDNA轉(zhuǎn)錄而來，與肝細胞內(nèi)的cccDNA轉(zhuǎn)錄活性密切相關。本研究主要比較CHB患者停用NAs治療后病毒學復發(fā)組與未復發(fā)組患者血清中HBVpgRNA、乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）等相關指標的差異性，探討HBVpgRNA表達水平對CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年1月深圳市龍崗中心醫(yī)院肝病門診就診的42例CHB停藥患者作為研究對象，對入組患者進行24個月的隨訪，將病毒學復發(fā)作為隨訪終點，根據(jù)隨訪結果分為病毒學復發(fā)組（20例）和未復發(fā)組（22例）。病毒學復發(fā)組中，男16例，女4例；年齡30～50歲，平均（39.50±5.99）歲。未復發(fā)組中，男18例，女4例；年齡28～53歲，平均（42.27± 7.09）歲。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。停藥時病毒學復發(fā)組有7例患者的HBVpgRNA檢測陽性，未復發(fā)組有2例HBVpgRNA檢測陽性。兩組間的HBVpgRNA檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。納入標準：①CHB患者停藥前接受NAs治療4年；②停藥時乙肝病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陰性，且HBV DNA＜20 U/ml，肝功能丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ala nine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）均在正常值范圍內(nèi)。排除標準：①合并其他病毒如丙型肝炎病毒、艾滋病病毒感染者；②合并自身免疫性肝病或其他結締組織病需長期使用激素或免疫抑制劑治療者；③合并肝癌或肝硬化患者；④合并妊娠的患者?；颊呒捌浼覍倬橥獗狙芯?，且本研究經(jīng)深圳市龍崗中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批[批準文號：20210426022（SZLG）250001]。

1.2 方法

分別于患者停藥時、停藥后前3個月每個月及隨后的每3個月各采集外周血15～20 ml，室溫下用3500 r/min（離心機半徑13.5 cm）的速度離心處理10 min分離出血清。使用美國ABI Prism 7500熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，采用磁珠法進行HBVpgRNA檢測，試劑盒購自北京熱景生物技術股份有限公司；使用美國VIIA7熒光定量PCR儀，采用熒光定量PCR技術進行HBV DNA檢測，試劑盒購自湖南圣湘生物科技股份有限公司；使用美國雅培I2000SR免疫分析儀，采用化學發(fā)光法進行乙肝五項定量測定，試劑盒購自美國雅培公司；使用羅氏全自動生化分析儀（C702-2），采用酶法檢測肝功能，試劑盒購自羅氏集團有限公司，均嚴格按說明書操作。

1.3 觀察指標及評價標準

病毒學復發(fā)定義為HBV DNA＞2000 U/ml，隨訪終點為病毒學復發(fā)，無病毒學復發(fā)患者最長隨訪24個月。比較病毒學復發(fā)組與未復發(fā)組患者停藥時及隨訪結束時的HBVpgRNA、HBsAg滴度水平，并分析與病毒學復發(fā)相關的危險因素。HBVpgRNA≥300 copies/ml為陽性，將未檢測到HBVpgRNA的樣本賦值為150 copies/ml進行數(shù)據(jù)分析。HBsAg正常范圍為0.00～0.05 U/ml，HBV DNA檢測下限值為20 U/ml，ALT正常范圍為7～40 U/L，AST正常范圍為13～35 U/L。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組間相關指標的比較

病毒學復發(fā)組在停藥時及隨訪結束時血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明顯高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。病毒學復發(fā)組隨訪結束時的HBsAg和HBVpgRNA滴度水平均明顯高于停藥時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。未復發(fā)組隨訪結束時血清中的HBsAg滴度水平明顯高于停藥時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。未復發(fā)組停藥時及隨訪結束時血清中的HBVpgRNA滴度水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組患者停藥時的肝功能ALT、AST水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；隨訪結束時，病毒學復發(fā)組的ALT、AST水平顯著高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組相關指標的比較（±s）

2.2 病毒學復發(fā)及預測因素分析

采用單因素COX回歸分析篩選出影響患者停藥后病毒學復發(fā)的2個相關因素，即停藥時的血清HBVpgRNA陽性、HBsAg＞1000 U/ml（表2），同時對相關因素進行賦值（表3）。停藥時血清中的HBVpgRNA陽性是導致CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的獨立危險因素（P=0.045），與HBVpgRNA陰性患者相比，HBVpgRNA陽性患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的風險明顯升高（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38）。停藥時HBsAg＞1000 U/ml是導致CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的另一獨立危險因素（P=0.000），HBsAg＞1000 U/ml的患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的風險要明顯高于HBsAg≤1000 U/ml患者（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99）（表4）。

表2 單因素回歸分析篩選出相關因素

表3 相關因素賦值

表4 多因素回歸分析結果

2.3 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預測病毒學復發(fā)的效能

ROC曲線顯示，HBVpgRNA單獨預測CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的曲線下面積（the area under the curve，AUC）為0.857（95%CI：0.71～0.95，P＜0.05），敏感性為65.00%，特異性為100.00%。HBsAg單獨預測CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的AUC為0.886 （95%CI：0.75～0.96，P＜0.05），敏感性為90.00%，特異性為77.27%。HBsAg與HBVpgRNA聯(lián)合檢測的AUC為0.936，與兩者單獨預測的AUC值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），敏感性為90.00%，特異性為86.36%（表5、圖1）。

圖1 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預測病毒學復發(fā)的ROC曲線圖

表5 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預測病毒學復發(fā)的效能

3 討論

目前，在現(xiàn)有的國內(nèi)外的CHB防治指南中并未提出能有效預測NAs安全停藥的生物學標志物。既往主要依據(jù)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換、HBVDNA轉(zhuǎn)陰、肝功能ALT復常等情況為患者提供停藥建議，但復發(fā)率非常高。還有研究建議結合HBsAg檢測情況評估患者停藥的安全性，但結果并不理想。相關研究認為，CHB患者停用抗病毒藥物時的HBsAg表達水平與停藥后的病毒學復發(fā)無明顯相關性。因此，尋找能有效預測NAs安全停藥的生物學標志物指導CHB患者停藥具有非常重要的臨床意義。

HBVpgRNA是cccDNA最長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其長度大約為3.5 kb。相關研究證實，cccDNA轉(zhuǎn)錄為HBVpgRNA的過程不會被NAs的治療所阻斷。在本研究中，42例經(jīng)過4年及以上長期使用NAs治療的CHB患者在停藥時HBVDNA＜20 U/ml的情況下，仍有9例患者的HBVpgRNA檢測陽性；同時，病毒學復發(fā)組在停藥時基線及出現(xiàn)病毒學復發(fā)時血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明顯高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示在停藥時如果CHB患者血清中還檢測到HBVpgRNA存在，則肝細胞內(nèi)仍然存在具有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA，預示停藥后復發(fā)風險大。另一項研究也顯示，相對于其他病毒學標志物，血清中的HBVpgRNA表達水平在NAs治療的背景下可以更好地反映肝細胞內(nèi)cccDNA的活性。小樣本臨床研究顯示，停藥時血清HBVpgRNA的表達水平可以預測停藥后HBV反彈的情況。在本研究中，多因素COX回歸分析顯示，停藥時血清中的HBVpgRNA陽性是導致病毒學復發(fā)的獨立危險因素（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38，P=0.045），停藥時的HBsAg＞1000 U/ml是導致病毒學復發(fā)的另一獨立危險因素（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99，P=＜0.001），這與Fan等的研究結果相類似。Fan等對40例患者（初治時HBeAg陽性，使用恩替卡韋或替諾福韋治療）進行停藥后隨訪5.5年發(fā)現(xiàn)，停藥時HBV DNA及HBV RNA檢測均為陰性的患者4年后的臨床復發(fā)比例（2/35）明顯低于HBV DNA或RNA陽性的患者（32/ 102）（P=0.018）。但是，在另一項研究中卻顯示，HB-sAg≤100 U/ml可作為指導CHB患者安全停藥的獨立預測因子，而HBV RNA的表達水平不是預測患者停藥后出現(xiàn)病毒學或臨床復發(fā)的獨立危險因素。這些研究結果的差異可能與停藥時患者的HBeAg狀態(tài)、HBsAg滴度水平以及HBV RNA檢測的敏感性有關。此外，本研究的ROC曲線結果顯示，HBVpgRNA表達水平對CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)具有較好的預測價值，AUC為0.857，特異性為100%，但敏感性較差（僅為65.00%）；與HBsAg聯(lián)合檢測后，AUC高達0.936，敏感性也提高到90%，可以為CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的判斷提供輔助依據(jù)。由此可見，停藥時患者血清中的HBVpgRNA和HBsAg表達水平可以作為CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的預測因子，對指導CHB患者安全停藥具有一定的臨床參考價值。由于本研究不是多中心大數(shù)據(jù)臨床研究，研究結論可能會存在一定的偏倚，關于HBVpgRNA 在CHB患者安全停藥方面的價值仍有待更多的臨床研究進一步證實。

綜上所述，病毒學復發(fā)患者停藥時的HBVpgRNA及HBsAg表達水平均顯著高于未復發(fā)患者，HBVpgRNA陽性和HBsAg＞1000 U/ml是CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的獨立危險因素，對預測CHB患者安全停藥具有一定的臨床價值。