香丹注射液中致類過(guò)敏反應(yīng)成分篩選及機(jī)制初探

龐 菲，王彎彎，郝瑞瑞，周甜雨，陳世忠*，靳洪濤, 4, 5*

香丹注射液中致類過(guò)敏反應(yīng)成分篩選及機(jī)制初探

龐 菲1，王彎彎2，郝瑞瑞1，周甜雨3，陳世忠2*，靳洪濤1, 4, 5*

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，北京 100050 2. 北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 100191 3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046 4. NMPA創(chuàng)新藥物安全性研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206 5. 北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，北京 100176

篩選香丹注射液中可能存在的致類過(guò)敏成分并探討其作用機(jī)制。使用Auto Dock Tools Vina軟件，以人類Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體X2（Mas-related G protein-coupled receptor X2，MRGPRX2）和小鼠MRGPRb2為目標(biāo)蛋白，對(duì)香丹注射液中的水溶性酚酸類物質(zhì)進(jìn)行分子對(duì)接，并將香丹注射液及與MRGPRX2和MRGPRb2有較高結(jié)合（≤?25.10 kJ/mol）的組成成分丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸與小鼠肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞孵育1 h，檢測(cè)組胺（histamine，His）和β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase，β-Hex）釋放率，篩選出致類過(guò)敏成分，進(jìn)一步觀察丹酚酸B及紫草酸刺激P815細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員及細(xì)胞脫顆粒情況，最后進(jìn)行小鼠后爪外滲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。P815細(xì)胞分別給予香丹注射液（1∶25、1∶250）及丹酚酸B（100 μg/mL）和紫草酸（100 μg/mL）刺激后，His、β-Hex釋放均顯著升高（＜0.01）。P815細(xì)胞分別給予丹酚酸B（100 μg/mL）和紫草酸（100 μg/mL）刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度均顯著升高（＜0.05），并有脫顆?，F(xiàn)象。丹酚酸B（43.5、21.7 μg/kg）和紫草酸（43.5 μg/kg）均能顯著提高小鼠后爪伊文思藍(lán)滲出程度（＜0.05、0.01）。香丹注射液誘導(dǎo)的類過(guò)敏反應(yīng)可能與丹酚酸B和紫草酸有關(guān)，且丹酚酸B和紫草酸誘導(dǎo)的類過(guò)敏反應(yīng)可能與動(dòng)員Ca2+內(nèi)流相關(guān)。

香丹注射液；類過(guò)敏反應(yīng)；分子對(duì)接；丹酚酸B；紫草酸；P815細(xì)胞

中藥注射劑（traditional Chinese medicine injections，TCMIs）是由中醫(yī)藥理論指導(dǎo)，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法，從中草藥、天然藥物中提取有效成分制成可供注入體內(nèi)（包括肌內(nèi)、穴位、皮內(nèi)、皮下、靜脈以及其他組織或器官）的無(wú)菌溶液以及供臨床前配制溶液的無(wú)菌粉末或濃縮液[1]。近年來(lái)，中藥制劑種類越來(lái)越多，且在病毒感染性疾病、心腦血管疾病等疾病中療效顯著，隨其應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，其用藥安全性也備受重視。中藥是在藥物過(guò)敏反應(yīng)中常見(jiàn)的觸發(fā)因素，TCMIs復(fù)方復(fù)雜多樣，幾乎所有（95.7%）與中藥有關(guān)的過(guò)敏性病例均來(lái)自TCMIs[2]。在2014—2019年湖北省基于自發(fā)報(bào)告系統(tǒng)的TCMIs安全性研究中發(fā)現(xiàn)類過(guò)敏反應(yīng)（14.39%）是最常見(jiàn)的不良反應(yīng)[3]，對(duì)TCMIs中的潛在致類過(guò)敏反應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行篩選，對(duì)提高臨床應(yīng)用的安全性至關(guān)重要。

香丹注射液屬于活血化瘀類藥物，在臨床中廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，脂溶性的二萜醌類及水溶性的酚酸類物質(zhì)是該制劑的主要活性物質(zhì)[4]，丹參和降香是香丹注射液的主要組成，Cao等[5]和陳影等[6]測(cè)定出香丹注射液中水溶性酚酸類成分包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸等生物活性成分。香丹注射液療效顯著確切，隨著臨床對(duì)其應(yīng)用的認(rèn)知加深，其不良反應(yīng)也受到廣泛重視。藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)（第45期）指出要警惕香丹注射液的嚴(yán)重不良反應(yīng)[7]，理血?jiǎng)┲谢钛鏊帲?4.5%）在2021年藥品不良反應(yīng)/事件報(bào)告涉及的中藥中排第1位[8]，在2013年TCMIs嚴(yán)重不良反應(yīng)/事件報(bào)告中香丹注射液排第5位[9]。香丹注射液的不良反應(yīng)累及皮膚、呼吸等多個(gè)組織器官，主要體現(xiàn)在超敏反應(yīng)上，且集中于給藥后30 min內(nèi)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)休克死亡[10]?；加行难芗膊?、有過(guò)敏史及過(guò)敏體質(zhì)患者更易發(fā)生不良反應(yīng)，當(dāng)香丹注射液與其他藥物聯(lián)用時(shí)，會(huì)加重不良反應(yīng)，增加嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率[11-12]。對(duì)香丹注射液進(jìn)行致類過(guò)敏物質(zhì)篩選，有利于提高制劑的安全性。本研究利用已建立的成熟致敏物質(zhì)篩選平臺(tái)[13-14]，尋找香丹注射液引起類過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的原因，為提高其臨床應(yīng)用的安全性并為制劑進(jìn)行質(zhì)量控制以及工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠，4～5周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h晝夜交替循環(huán)，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)0000262）。

1.3 藥品與試劑

香丹注射液（批號(hào)110401）購(gòu)自河南同源制藥有限公司；對(duì)照品丹酚酸A（批號(hào)DST201109-008）、丹酚酸B（批號(hào)DSTDD000901）、丹酚酸C（批號(hào)DST200302-010）、迷迭香酸（批號(hào)DSTDM002701）、紫草酸（批號(hào)DST201209-028）購(gòu)自成都德斯特生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；C48/80（批號(hào)088M4120V）、對(duì)硝基苯基--乙?；?β--葡糖酰胺（批號(hào)1002575112）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Triton X-100（批號(hào)EZ1609D315）購(gòu)自BioFroxx公司；CCK-8（批號(hào)PN558）購(gòu)自日本株式會(huì)社會(huì)同仁化學(xué)研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)AF29546226）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)DD19099560）購(gòu)自Hyclone公司；胰酶（批號(hào)2114092）、鹽酸（批號(hào)20140703）購(gòu)自北京利維寧生物科技有限公司；PBS（批號(hào)2126176）購(gòu)自BI公司；改良臺(tái)式液（批號(hào)20211019）、0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（批號(hào)20200728）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Na2CO3（批號(hào)20160616）、NaHCO3（批號(hào)20170216）均購(gòu)自北京化工廠；NaOH（批號(hào)20200701）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；鄰苯二甲醛（批號(hào)K2024111）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醇（批號(hào)100296）購(gòu)自Honeywell公司；Fluo-8 AM新型鈣離子熒光探針檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2021A0JC0012）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

LB942S型多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（Berthold公司）；SW-CJ-2D型細(xì)胞操作超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；DHP-9052型電熱37 ℃恒溫培養(yǎng)箱[中儀國(guó)科（北京）科技有限公司]；XMTD-6000型三用電熱恒溫水箱（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；3K18型小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；ASV-3023型滅菌蒸氣高壓鍋（Sakura公司）；Scepter型手持細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、ScepterTMSensors-60 μm細(xì)胞計(jì)數(shù)芯片（美國(guó)Millipore公司）；Axio Vert A I型半自動(dòng)倒置研究級(jí)顯微鏡（CARL ZEISS公司）。

2 方法

2.1 分子對(duì)接

在Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)中（https://www.uniprot.org/）下載蛋白質(zhì)PDB結(jié)構(gòu)。利用ChemDraw 20.0和Chem3D 20.0軟件繪制化合物結(jié)構(gòu)并將結(jié)構(gòu)扭轉(zhuǎn)得到化合物mol2結(jié)構(gòu)。利用Auto Dock軟件對(duì)分子進(jìn)行去水、加氫后進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)Auto Dock Tools Vina進(jìn)行分子對(duì)接評(píng)價(jià)靶蛋白和化合物之間的相互作用，并利用Ligplot進(jìn)行可視化處理。

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

P815細(xì)胞用含1%青霉素-鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以4×104個(gè)/孔接種到96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，另設(shè)調(diào)零組不接種細(xì)胞。香丹注射液臨床使用需將原液稀釋25倍，以該質(zhì)量濃度為最高質(zhì)量濃度，將最高質(zhì)量濃度以10倍梯度稀釋，共稀釋8個(gè)質(zhì)量濃度；各給藥組分別加入200 μL 8個(gè)稀釋倍數(shù)的香丹注射液以及100、50、12.5、3.125、0.781 25 μg/mL的丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸，對(duì)照組加入200 μL含1%青霉素-鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，孵育1 h。孵育結(jié)束后，棄去藥物，每孔加入110 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（）值，并計(jì)算抑制率。

抑制率＝1－(給藥－調(diào)零)/(對(duì)照－調(diào)零)

2.3 組胺（histamine，His）釋放試驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以4×104個(gè)/孔接種到黑色不透光96孔板中，孵育過(guò)夜，另設(shè)調(diào)零組不接種細(xì)胞。設(shè)置對(duì)照組、C48/80組和各給藥組，調(diào)零組和對(duì)照組每孔加入200 μL改良臺(tái)式液，C48/80組加入200 μL C48/80（30 μg/mL），各給藥組分別加入200 μL高、低劑量（1∶25、1∶250）的香丹注射液稀釋液及高、低劑量（50、5 μg/mL）的丹酚酸A和高、低劑量（100、10 μg/mL）的丹酚酸B、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸，孵育1 h。裂解組加入200 μL 1% Triton X-100，每孔取100 μL放入黑色不透光96孔板中，每孔加入20 μL 1 mol/L NaOH，再加入20 μL 1%鄰苯二甲醛底物，37 ℃孵育15 min，加入20 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，立即采用酶標(biāo)儀m/x＝350/460測(cè)定各組值，并計(jì)算His釋放率。

His釋放率＝(樣品上清－調(diào)零)/(裂解－調(diào)零)

2.4 β-氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase，β-Hex）釋放試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，孵育1 h，裂解組加入200 μL 1% Triton X-100，取上清液50 μL加到1個(gè)新的96孔板，每孔加入50 μL對(duì)硝基苯基--乙?；?β--葡糖酰胺顯色底物制劑（1.70 mg/mL），37 ℃孵育1.5 h，每孔加入150 μL Na2CO3/NaHCO3終止液，采用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的各組值，并計(jì)算β-Hex釋放率。

β-Hex釋放率＝(樣品上清－調(diào)零)/(裂解－調(diào)零)

2.5 小鼠后爪外滲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

丹酚酸B及紫草酸高質(zhì)量濃度下均可顯著刺激P815細(xì)胞釋放His和β-Hex，因此進(jìn)行小鼠局部類過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。雄性ICR小鼠56只隨機(jī)分為C48/80（13.0 μg/kg）組及丹酚酸B高、中、低劑量（43.5、21.7、10.9 μg/kg）組和紫草酸高、中、低劑量（43.5、21.7、10.9 μg/kg）組，每組8只。小鼠iv 0.4%伊文思藍(lán)鹽水（10 mL/kg），5 min后將10 μL生理鹽水注射到左爪中作為對(duì)照，將10 μL含各質(zhì)量濃度待測(cè)藥物的生理鹽水注射到右爪中。15 min后，收集爪組織，37 ℃干燥24 h后稱定質(zhì)量，剪碎，置于800 μL丙酮-生理鹽水（7∶3）溶液中。65 ℃孵育12 h，5000 r/min離心取上清液，取200 μL移至96孔板中，于620 nm處測(cè)定值。

2.6 甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化

將細(xì)胞爬片放入6孔板中，P815細(xì)胞以1.8×106個(gè)/孔接種到爬片上，孵育過(guò)夜。對(duì)照組每孔加入600 μL改良臺(tái)式液，C48/80組加入30 μg/mL C48/80，丹酚酸B高、中、低劑量（100、50、10 μg/mL）組和紫草酸高、中、低劑量（100、50、10 μg/mL）組每孔加入200 μL待測(cè)藥物，孵育1 h。取出爬片，于4%多聚甲醛溶液中固定，滴加甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以4×104個(gè)/孔接種到黑色不透光96孔板中，孵育過(guò)夜，另設(shè)調(diào)零組不接種細(xì)胞。設(shè)置對(duì)照組、C48/80組和各給藥組，調(diào)零組和對(duì)照組每孔加入200 μL鈣離子熒光探針試劑盒內(nèi)稀釋緩沖液，C48/80組加入200 μL C48/80（30 μg/mL），各給藥組分別加入200 μL高、中、低劑量（100、25、6.25 μg/mL）的丹酚酸B、紫草酸，孵育1 h。棄去上清液，每孔加入100 μL Fluo-8 AM工作液，37 ℃孵育40 min，用稀釋緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每孔加入200 μL稀釋緩沖液，立即采用酶標(biāo)儀m/x＝490/514測(cè)定各組值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 分子對(duì)接

配體與受體結(jié)合能量越低，配體與受體結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合活性越強(qiáng)。當(dāng)結(jié)合能＜?29.29 kJ/mol可推測(cè)其有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[15-16]。迷迭香酸與人類Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體X2（Mas-related G protein-coupled receptor X2，MRGPRX2）結(jié)合能接近該標(biāo)準(zhǔn)，且與小鼠MRGPRb2結(jié)合能＜?29.29 kJ/mol，本研究以?25.10 kJ/mol為后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選標(biāo)準(zhǔn)[17]。如表1所示，丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸與MRGPRX2和MRGPRb2結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能均≤?25.10 kJ/mol。丹酚酸B、紫草酸與MRGPRX2/MRGPRb2分子對(duì)接見(jiàn)圖1、2。

3.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，丹酚酸A在100 μg/mL對(duì)P815 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為42.99%，其余藥物及組分對(duì)P815細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。為確保篩選實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，減少細(xì)胞毒性作用對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，藥物對(duì)P815細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率≤20%，故以香丹注射液原液稀釋25倍為最高質(zhì)量濃度（1∶25），丹酚酸A以50 μg/mL為最高質(zhì)量濃度，丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸、迷迭香酸以100 μg/mL為最高質(zhì)量濃度。

表1 核心成分與MRGPRX2/MRGPRb2的分子對(duì)接

Table 1 Molecular docking of core components with MRGPRX2/MRGPRb2

蛋白化合物結(jié)合能/(kJ·mol?1) MRGPRX2丹酚酸B?35.98 紫草酸?35.12 丹酚酸C?32.64 丹酚酸A?29.71 迷迭香酸?28.03 原兒茶醛?23.85 丹參素?22.59 咖啡酸?20.92 原兒茶酸?20.08 MRGPRb2丹酚酸C?35.15 紫草酸?32.64 丹酚酸B?31.80 丹酚酸A?30.54 迷迭香酸?30.12 丹參素?24.27 咖啡酸?23.01 原兒茶酸?20.50 原兒茶醛?20.08

圖1 丹酚酸B與MRGPRX2/MRGPRb2分子對(duì)接可視化

圖2 紫草酸與MRGPRX2/MRGPRb2分子對(duì)接可視化

圖3 香丹注射液及其各組分對(duì)P815細(xì)胞毒性測(cè)定

3.3 His及β-Hex釋放實(shí)驗(yàn)

如圖4所示，香丹注射液高、低劑量組及丹酚酸B高劑量組和紫草酸高劑量組均能顯著刺激P815細(xì)胞釋放His（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性；而丹酚酸A高、低劑量組能夠顯著抑制P815細(xì)胞釋放His（＜0.01）。

如圖5所示，香丹注射液、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸的高、低劑量組和丹酚酸C高劑量組均能顯著刺激P815細(xì)胞釋放β-Hex（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性；丹酚酸A高劑量組顯著刺激P815細(xì)胞釋放β-Hex（＜0.01），而丹酚酸A低劑量組抑制P815細(xì)胞釋放β-Hex（＜0.01）。根據(jù)His釋放率及β-Hex釋放率增加倍數(shù)對(duì)其致敏可疑程度進(jìn)行排序（表2），丹酚酸B及紫草酸可能是香丹注射液中潛在的致類過(guò)敏組分。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.4 小鼠后爪外滲試驗(yàn)驗(yàn)證及細(xì)胞形態(tài)變化

如圖6所示，觀察小鼠后右爪注射C48/80以誘導(dǎo)局部類過(guò)敏反應(yīng)，伊文思藍(lán)滲出增加，右爪相較僅注射生理鹽水的左爪藍(lán)色更深，丹酚酸B高、中劑量組和紫草酸高劑量組均能顯著提高小鼠后爪伊文思藍(lán)滲出程度（＜0.05、0.01）。

如圖7所示，對(duì)照組細(xì)胞完整，邊緣光滑，結(jié)構(gòu)致密；C48/80組細(xì)胞邊緣不整，背景中出現(xiàn)大量的藍(lán)色顆粒樣物質(zhì)；丹酚酸B組和紫草酸組誘導(dǎo)P815細(xì)胞脫顆粒呈劑量相關(guān)性減弱，表明丹酚酸B和紫草酸可能是致類過(guò)敏物質(zhì)。

表2 致類過(guò)敏可疑程度

Table 2 Suspicious degree of induction of anaphylactic reaction

組別劑量刺激His釋放刺激β-Hex釋放 香丹注射液1∶25＋＋＋ 1∶250＋－ 丹酚酸A50 μg·mL?1－－ 5 μg·mL?1－－ 丹酚酸B100 μg·mL?1＋＋＋ 10 μg·mL?1－＋ 丹酚酸C100 μg·mL?1－＋ 10 μg·mL?1－－ 紫草酸100 μg·mL?1＋＋＋ 10 μg·mL?1－－ 迷迭香酸100 μg·mL?1－－ 10 μg·mL?1－－

－：與對(duì)照組比較，His釋放率增長(zhǎng)倍數(shù)（）≤2，β-Hex釋放率增長(zhǎng)倍數(shù)（）≤5；＋：2＜≤5，5＜≤20；＋＋：＞5，＞20

－: His release rate increased multiple ()≤ 2control group,β-Hex release rate increased multiple () ≤ 5control group; ＋: 2<≤ 5, 5<≤ 20;＋＋:>5,>20

3.5 細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員試驗(yàn)結(jié)果

如圖8所示，丹酚酸B高劑量組和紫草酸高劑量組刺激P815細(xì)胞后胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高（＜0.05），表明丹酚酸B和紫草酸誘導(dǎo)的類過(guò)敏反應(yīng)可能與動(dòng)員Ca2＋內(nèi)流相關(guān)。

4 討論

類過(guò)敏反應(yīng)與I型超敏反應(yīng)臨床表癥相似，但不會(huì)引起抗原特異性免疫反應(yīng)。類過(guò)敏反應(yīng)可以通過(guò)直接刺激或激活補(bǔ)體系統(tǒng)間接刺激肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放活性介質(zhì)而被誘導(dǎo)，還可通過(guò)激活Ca2+相關(guān)信號(hào)通路釋放活性介質(zhì)而被誘導(dǎo)[18-19]。MRGPRX2/MRGPRb2是一種在肥大細(xì)胞上表達(dá)的A類G蛋白偶聯(lián)受體，可以活化非IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞，研究已證明羅庫(kù)溴銨等幾種FDA批準(zhǔn)的陽(yáng)離子藥物的類過(guò)敏反應(yīng)與其相關(guān)，MRGPRX2/ MRGPRb2是類過(guò)敏反應(yīng)的關(guān)鍵靶標(biāo)，并可在體外通過(guò)MRGPRX2對(duì)體內(nèi)假過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測(cè)[20-23]。將酚酸類物質(zhì)與MRGPRX2/MRGPRb2進(jìn)行分子對(duì)接評(píng)估，發(fā)現(xiàn)丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸與MRGPRX2/MRGPRb2結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合力較高，其中丹酚酸B、紫草酸和丹酚酸C的結(jié)合排于前3，故選擇丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸這5個(gè)單體進(jìn)行類過(guò)敏反應(yīng)物質(zhì)篩選。

本研究使用P815細(xì)胞，因其表面沒(méi)有高親和性的IgE Fc段受體，更適合作為類過(guò)敏反應(yīng)肥大細(xì)胞脫顆粒檢測(cè)模型[24]。C48/80是常用的誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒的藥物，能夠通過(guò)MRGPRX2誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化。MRGPRX2可以通過(guò)激活磷脂酶C信號(hào)通路誘導(dǎo)Ca2+動(dòng)員，激活G蛋白，促使肥大細(xì)胞胞吐，合成磷脂酰肌醇3-激酶，并形成花生四烯酸代謝物，激活Ca2+通道和蛋白激酶C，胞內(nèi)Ca2+水平升高，發(fā)生脫顆?，F(xiàn)象并釋放介質(zhì)，此外補(bǔ)體系統(tǒng)激活產(chǎn)生C3a和C5a，C3a和C5a在動(dòng)員Ca2+方面具有高活性[25]。本研究結(jié)果顯示，香丹注射液在一定劑量下可以誘導(dǎo)P815細(xì)胞釋放His、β-Hex介質(zhì)，且在香丹注射液中篩選出其單體成分丹酚酸B及紫草酸可以誘導(dǎo)P815細(xì)胞脫顆粒，并釋放His、β-Hex介質(zhì)。本研究中丹酚酸A低劑量組可顯著抑制P815細(xì)胞釋放His和β-Hex，Jeon等[26]發(fā)現(xiàn)丹酚酸A可以降低二硝基氯苯誘導(dǎo)的BALB/c小鼠血清中IgE水平，可能具有抗過(guò)敏作用，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道較一致。在小鼠后爪外滲驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)小鼠發(fā)生類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)，其皮膚血管壁通透性升高，伊文思藍(lán)可與血漿蛋白結(jié)合，滲出血管外，表現(xiàn)出組織藍(lán)染，丹酚酸B高、中劑量組和紫草酸高劑量組均可導(dǎo)致小鼠后爪血管通透性增加，類過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，這一結(jié)果與分子對(duì)接結(jié)果相互對(duì)應(yīng)。Ca2+內(nèi)流對(duì)His釋放和肥大細(xì)胞脫顆粒有顯著影響[27]，丹酚酸B和紫草酸高劑量組刺激P815細(xì)胞后，胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高，香丹注射液誘導(dǎo)的類過(guò)敏反應(yīng)可能與丹酚酸B和紫草酸有關(guān)。

圖B為圖A紅色框內(nèi)各組局部放大圖，與左足比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖7 丹酚酸B及紫草酸刺激P815細(xì)胞脫顆粒變化

與對(duì)照組比較：*P＜0.05

紫草酸是一種具有神經(jīng)保護(hù)、肝保護(hù)、心臟保護(hù)等多種生物活性的天然產(chǎn)物[28]。丹酚酸B是丹參中丹酚酸類里含量最豐富、最具生物活性的成分之一，富含丹酚酸B的相關(guān)藥物廣泛用于各種心血管疾病的臨床治療，丹酚酸B還可通過(guò)抑制過(guò)敏誘導(dǎo)的氣道黏蛋白MUC5AC過(guò)表達(dá)來(lái)改善氣道高反應(yīng)性[29-30]。在丹參水提液中，丹參酚酸類成分不穩(wěn)定，易發(fā)生降解和相互轉(zhuǎn)化。丹酚酸B是水溶性酚酸中含量最高的成分，在不同溫度（80～210 ℃）下，其呋喃環(huán)相連酯鍵發(fā)生水解反應(yīng)，生成紫草酸和丹參素，且隨溫度升高水解反應(yīng)程度增加[31]。在高溫高壓處理丹酚酸B水溶液時(shí)，紫草酸含量會(huì)先升高再降低，可能與丹酚酸B和紫草酸之間存在可逆反應(yīng)有關(guān)，且紫草酸也會(huì)發(fā)生降解反應(yīng)，形成丹參素、丹酚酸A、原兒茶醛[31-32]。目前尚無(wú)有關(guān)丹酚酸B和紫草酸單體致超敏反應(yīng)的報(bào)道，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸A具有一定的抗類過(guò)敏作用，當(dāng)?shù)し铀酈、紫草酸與丹酚酸A同時(shí)存在的致敏作用或者抗過(guò)敏作用也值得進(jìn)一步深入探索。

隨著香丹注射液廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)備受臨床重視。香丹注射液致敏反應(yīng)受多種因素影響[33-34]：①鞣質(zhì)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多元酚類化合物，含有大量的酚羥基或羧基，因其結(jié)構(gòu)與香丹注射液中活性成分相似，不易完全分離，生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的鞣質(zhì)可作為半抗原在體內(nèi)與大分子蛋白結(jié)合形成復(fù)合物引起過(guò)敏反應(yīng)，或者通過(guò)共激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)、凝血、補(bǔ)體途徑誘導(dǎo)類過(guò)敏反應(yīng)；②輔料聚山梨酯80可誘導(dǎo)類過(guò)敏反應(yīng)；③選擇生理鹽水作為溶媒可能會(huì)產(chǎn)生不溶性顆粒；④聯(lián)合用藥可誘導(dǎo)超敏反應(yīng)發(fā)生率增加；⑤其活性成分可能作為半抗原誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)或直接誘導(dǎo)類過(guò)敏反應(yīng)。在衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（WS3-B-3289-98）中僅要求對(duì)香丹注射液中原兒茶醛含量進(jìn)行定量分析[35]。丹酚酸B和紫草酸誘導(dǎo)的P815細(xì)胞脫顆粒釋放介質(zhì)具有劑量相關(guān)性，為提高香丹注射液臨床使用的安全性，在確保制劑有效性的前提下有必要對(duì)其潛在的致敏物質(zhì)進(jìn)行限量標(biāo)準(zhǔn)研究，重視各酚酸類的相互轉(zhuǎn)化，改善制劑工藝，以進(jìn)一步提高香丹注射液的安全性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening and preliminary mechanism of inducer of anaphylactic reaction in Xiangdan Injection

PANG Fei1, WANG Wan-wan2, HAO Rui-rui1, ZHOU Tian-yu3, CHEN Shi-zhong2, JING Hong-tao1, 4, 5

1. New Drug Safety Evaluation Center, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China 2. School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China 3. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 4. NMPA Key Laboratory for Safety Research and Evaluation of Innovative Drug, Beijing 102206, China 5. Beijing Union-Genius Pharmaceutical Technology Development Co., Ltd., Beijing 100176, China

To screen the components induced the anaphylactic reaction in Xiangdan Injection (香丹注射液) and explore the mechanism.With human Mas-related G protein-coupled receptor X2 (MRGPRX2) and mouse MRGPRb2 as target proteins, water-soluble phenolic acids in Xiangdan Injection were docked with target protein by Auto Dock Tools Vina. P815 cells were incubated with Xiangdan Injection and its constituents of salvianolic acid A, salvianolic acid B, salvianolic acid C, rosmarinic acid and lithospermic acid for 1 h, which had high binding energy (≤ ?25.10 kJ/mol) to MRGPRX2 and MRGPRb2. According to histamine (His) and β-hexosaminidase (β-Hex) release rate, possible components that may induce the anaphylactic reaction were screened out. The intracellular Ca2+mobilization and cell degranulation stimulated by salvianolic acid B and lithospermic acid were further observed. Finally, the mouse hind paw extravasation experiment was observed for verification.After P815 cells were stimulated with Xiangdan Injection (1∶25, 1∶250), salvianolic acid B (100 μg/mL) and lithospermic acid (100 μg/mL), the release of His and β-Hex were significantly increased (< 0.01). After P815 cells were stimulated with salvianolic acid B (100 μg/mL) and lithospermic acid (100 μg/mL), the intracellular Ca2+concentration was significantly increased (< 0.05), and degranulation was observed. Salvianolic acid B (43.5, 21.7 μg/kg) and lithospermic acid (43.5 μg/kg) could significantly increase the degree of Evans blue exudation in hind paw of mice (< 0.05, 0.01).The anaphylactoid reaction induced by Xiangdan Injection may be related to salvianolic acid B and lithospermic acid, and the anaphylactoid reaction induced by salvianolic acid B and shikonic acid may be related to the mobilization of Ca2+influx.

Xiangdan Injection; anaphylactic reaction; molecular docking; salvianolic acid B; lithospermic acid; P815 cells

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6500 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.022

2022-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773996）；中國(guó)毒理學(xué)會(huì)臨床毒理專項(xiàng)資助課題（CST2021CT101）

龐 菲，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锩庖叨纠韺W(xué)。E-mail: pangfei@imm.ac.cn

靳洪濤，博士生導(dǎo)師，從事藥物毒理學(xué)研究。E-mail: jinhongtao@imm.ac.cn

陳世忠，博士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: chenshizhong66@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]