枳實(shí)化學(xué)成分與治療功能性消化不良關(guān)聯(lián)性分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

曲中原，李蘇楠，孫志偉，孫向明，于佳慧，舒 淇，鄒 翔，羅 容

枳實(shí)化學(xué)成分與治療功能性消化不良關(guān)聯(lián)性分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

曲中原1，李蘇楠1，孫志偉1，孫向明1，于佳慧1，舒 淇1，鄒 翔1，羅 容2*

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院（藥物工程技術(shù)研究中心），黑龍江 哈爾濱 150076 2. 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069

研究枳實(shí)治療功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)對(duì)10批枳實(shí)水煎液進(jìn)行分析，確定共有成分；采用不規(guī)則喂養(yǎng)和夾尾刺激建立FD大鼠模型，以小腸碳末推進(jìn)率、胃排空率及血清中胃動(dòng)素、胃泌素水平為藥效指標(biāo)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法和Pearson雙變量相關(guān)性分析建立色譜圖中共有峰峰面積與藥效指標(biāo)的相關(guān)性，篩選出枳實(shí)治療FD的藥效物質(zhì)，并通過(guò)斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)模型進(jìn)行藥效驗(yàn)證。10批枳實(shí)水煎液中共指認(rèn)35個(gè)共有成分，通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度和Pearson雙變量相關(guān)性分析，篩選出辛弗林、馬爾敏、黃柏酮、-甲基酪胺、圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷共8個(gè)成分為枳實(shí)治療FD的潛在藥效物質(zhì)。選擇藥效相關(guān)性較強(qiáng)、易得、可測(cè)的圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)成分均顯著促進(jìn)斑馬魚(yú)腸道蠕動(dòng)（＜0.01）。圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林為枳實(shí)治療FD的藥效物質(zhì)。

枳實(shí)；功能性消化不良；腸道蠕動(dòng)；圣草次苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；辛弗林

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床上最常見(jiàn)的功能性胃腸道疾病，是以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的上腹部癥狀如上腹痛或不適、腹部脹氣、噯氣、厭食、惡心、嘔吐、早飽、燒心、反胃等為特點(diǎn)的一組癥候群[1]。FD的發(fā)病機(jī)制可能與胃腸運(yùn)動(dòng)異常、內(nèi)臟高敏感、幽門(mén)螺桿菌感染、腦腸軸功能紊亂、腸道微生態(tài)失衡、十二指腸屏障受損與微炎癥、遺傳因素、精神、心理等因素密切相關(guān)[2]。目前治療FD的主要方法包括促動(dòng)力藥物治療、根除幽門(mén)螺桿菌治療、抑酸治療、心理輔助治療等。質(zhì)子泵抑制劑可以通過(guò)抑制鹽酸分泌改善上腹部的燒灼感。但越來(lái)越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)期使用質(zhì)子泵抑制劑會(huì)產(chǎn)生肝、腎毒性，增加患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。

中醫(yī)藥在FD治療上優(yōu)勢(shì)凸顯，雖不如化學(xué)藥迅捷，但療效穩(wěn)定，不良反應(yīng)小，復(fù)發(fā)率較低。中醫(yī)稱(chēng)功能性消化不良為“痞滿(mǎn)”，屬于“胃脘痛”“胃痞”范疇[6]。枳實(shí)為蕓香科植物酸橙L.及其栽培變種或甜橙Osbeck的干燥幼果，具有破氣消積、化痰消痞的功效，常用于治療積滯內(nèi)停、痞滿(mǎn)脹痛、大便不通等癥，能夠緩解FD引起的胸腹痛，對(duì)FD有顯著療效[7-8]。目前枳實(shí)治療FD療效確切，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全明確。本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)分析10批不同產(chǎn)地枳實(shí)水煎液的共有成分，結(jié)合藥效數(shù)據(jù)構(gòu)建化學(xué)成分相對(duì)含量與治療FD藥效的關(guān)聯(lián)性，并采用斑馬魚(yú)蠕動(dòng)模型對(duì)藥效物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出有效、可測(cè)的質(zhì)量標(biāo)志物，為枳實(shí)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（黑）2013-001。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度25～28 ℃、相對(duì)濕度50%～70%，光照14 h/黑暗10 h的環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)180315）。

野生型AB系斑馬魚(yú)由山東省科學(xué)院生物研究所提供，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)200318）。

1.2 藥材

10批枳實(shí)藥材由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院羅容副教授收集并鑒定為蕓香科植物酸橙L.的干燥幼果，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 枳實(shí)藥材信息

Table 1 Information of Aurantii Fructus Immaturus

批號(hào)來(lái)源產(chǎn)地 S1河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)江西 S2江西樟樹(shù)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)江西 S3江西樟樹(shù)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)江西 S4河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)湖南 S5河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)湖南 S6河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)湖南 S7河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)湖南 S8河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)湖南 S9河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)湖南 S10河北安國(guó)中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)江西

1.3 藥品與試劑

對(duì)照品柚皮苷（DSTDY009902）、圣草次苷（DST211225-014）、橙皮苷（DST211108-038）、新橙皮苷（DSTDX003901）、辛弗林（DSTCP110727），均購(gòu)自天津一方科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；色譜甲醇、乙腈購(gòu)自德國(guó)默克公司；蒸餾水購(gòu)自屈臣氏；氯化鈉注射液（批號(hào)16031609）購(gòu)自哈爾濱藥業(yè)集團(tuán)三精藥業(yè)股份有限公司；多潘立酮（批號(hào)LJJ2K49）購(gòu)自西安楊森制藥有限公司；尼羅紅（批號(hào)S19279）、鹽酸洛哌丁胺（批號(hào)S26615）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；三卡因（批號(hào)C1259391）購(gòu)自天津阿爾法生物科技有限公司；胃泌素ELISA試劑盒（批號(hào)DRE20863）和胃動(dòng)素ELISA試劑盒（批號(hào)DRE10129）購(gòu)自上海邦奕生物科技有限公司。

1.4 儀器

超高效液相色譜儀（UPLC，美國(guó)Waters公司）；AB Sceix Triple TOFTM5600型質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DMI3000B型熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 不同批次枳實(shí)水煎液的化學(xué)成分分析

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取10批枳實(shí)藥材粉末各0.5 g（過(guò)60目篩），放入圓底燒瓶中，加入10倍的蒸餾水，回流提取2次，每次1 h。合并2次濾液，濃縮，定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，得到供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取辛弗林、圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對(duì)照品各1.0 mg，分別加甲醇超聲溶解，于5 mL量瓶定容，制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～13 min，90%～62% A；13～26 min，62%～10% A；26～28 min，10%～90% A。柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積0.5 μL；體積流量0.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm。

2.1.4 質(zhì)譜條件 ESI離子源；正離子模式掃描；碰撞能量15 eV；干燥氣溫度320 ℃；體積流量8 L/min；霧化器壓力241.325 kPa；毛細(xì)管電壓3500 V；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣體積流量11 L/min。數(shù)據(jù)采集采用高分辨率模式，掃描范圍/100～3000，采樣速度為1 spectra/s。

2.2 不同批次枳實(shí)對(duì)FD的治療作用

2.2.1 給藥溶液的制備 取10批枳實(shí)藥材，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，取適量浸膏，加水溶解成質(zhì)量濃度為0.103 g/mL的溶液，備用。

2.2.2 分組、造模與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為13組，每組8只，分別為對(duì)照組、模型組、多潘立酮（1.03 mg/kg，多潘立酮片研磨成粉末，用生理鹽水配制成0.103 mg/mL的溶液）組以及10個(gè)批次的枳實(shí)（2.06 g/kg，相當(dāng)于臨床劑量的2倍）組。除對(duì)照組外，其余各組采用不規(guī)則喂養(yǎng)和夾尾刺激法建立大鼠FD模型[9-10]。大鼠正常飲水，隔日禁食，每天用長(zhǎng)海綿鉗夾大鼠尾部遠(yuǎn)端1/3處，每次0.5 h，每隔3 h刺激1次，4次/d，連續(xù)14 d。造模結(jié)束后，恢復(fù)正常的飲食和飲水，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。

2.2.3 一般行為學(xué)觀察 對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠的食物攝入量、水?dāng)z入量、體質(zhì)量、活動(dòng)度、毛發(fā)、糞便等進(jìn)行觀察和評(píng)估。

2.2.4 胃排空率和小腸碳末推進(jìn)率測(cè)定 將羧甲基纖維素鈉溶于250 mL蒸餾水中，然后分別加入10 g淀粉、8 g糖、8 g淀粉和2 g活性炭粉末，均勻攪拌，制成300 mL的碳末糊，于4 ℃保存。各組大鼠禁食24 h，ig碳末糊（10 mL/kg），30 min后麻醉，摘眼球取血，脫臼處死。打開(kāi)腹腔，結(jié)扎胃賁門(mén)和幽門(mén)，取胃，擦干，稱(chēng)定胃全質(zhì)量，然后剪開(kāi)胃體，洗去內(nèi)容物后擦干，稱(chēng)定凈質(zhì)量；同時(shí)，迅速取出小腸，鋪于白瓷盤(pán)上，測(cè)量幽門(mén)至回盲腸部全長(zhǎng)及幽門(mén)至碳末前沿的距離。計(jì)算胃排空率和小腸碳末推進(jìn)率。

胃排空率＝[ig碳末糊質(zhì)量－(胃全質(zhì)量－胃凈質(zhì)量)]/ig碳末糊質(zhì)量

小腸碳末推進(jìn)率＝碳末推進(jìn)距離/小腸全長(zhǎng)

2.2.5 血清胃動(dòng)素、胃泌素的測(cè)定 各組大鼠血樣于室溫下靜止20 min，3000 r/min離心20 min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中胃動(dòng)素及胃泌素水平。

2.3 譜效相關(guān)性分析

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 灰色關(guān)聯(lián)度分析是一種多因素統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)原始數(shù)據(jù)采用均值變化法進(jìn)行無(wú)量綱處理，分別將小腸碳末推進(jìn)率、胃排空率、胃動(dòng)素和胃泌素4個(gè)藥效指標(biāo)作為母序列，枳實(shí)10批次35個(gè)共有峰峰面積作為子序列，計(jì)算關(guān)聯(lián)度（）。

2.3.2 Pearson雙變量相關(guān)性分析 以10批枳實(shí)35個(gè)共有峰峰面積為自變量，4個(gè)藥效指標(biāo)為因變量，通過(guò)皮爾森雙變量相關(guān)性分析計(jì)算兩者之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。

2.4 枳實(shí)單體成分對(duì)斑馬魚(yú)腸道蠕動(dòng)的促進(jìn)作用

2.4.1 最大耐受濃度測(cè)定 隨機(jī)選取180尾受精后6 d（6 day post fertilization，6 dpf）的斑馬魚(yú)胚胎于6孔板中，每孔30尾，分別加入3 mL質(zhì)量濃度為125、250、500、1000、2000 μg/mL的藥物（圣草次苷、辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（不含藥物）。處理24 h后，觀察并記錄斑馬魚(yú)的死亡情況，確定各藥物對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐受濃度。

2.4.2 斑馬魚(yú)腸道蠕動(dòng)模型的建立及給藥 斑馬魚(yú)在5 dpf表現(xiàn)出自發(fā)的節(jié)律性肌肉收縮，開(kāi)始外源性自發(fā)進(jìn)食[11]。將140尾5 dpf的野生型AB斑馬魚(yú)置于6孔板中，每孔20尾，設(shè)置對(duì)照組、模型組、多潘立酮（30 μg/mL）組、圣草次苷（250 μg/mL）組、柚皮苷（250 μg/mL）組、橙皮苷（250 μg/mL）組、新橙皮苷（250 μg/mL）組和辛弗林（250 μg/mL）組。各組加入3 mL尼羅紅（10 μg/mL），作用16 h后清洗3遍。除對(duì)照組外，其余各組給予3 mL鹽酸洛哌丁胺（20 μg/mL）造模，對(duì)照組用胚胎培養(yǎng)水正常培養(yǎng)。造模同時(shí)，各給藥組給予3 mL相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組給予等體積胚胎培養(yǎng)水，于28 ℃恒溫水浴避光培養(yǎng)24 h。

2.4.3 斑馬魚(yú)的腸蠕動(dòng)促進(jìn)率測(cè)定 按“2.4.2”項(xiàng)下方法給藥24 h后，用0.02%三卡因進(jìn)行麻醉。各組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)置于熒光顯微鏡下對(duì)胃腸部進(jìn)行拍照，采集斑馬魚(yú)腸道內(nèi)容物（尼羅紅）熒光強(qiáng)度（），用Image J圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算腸蠕動(dòng)促進(jìn)率。

腸蠕動(dòng)促進(jìn)率＝1－(給藥－對(duì)照)/(模型－對(duì)照)

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 枳實(shí)水煎液特征圖譜的建立

對(duì)正離子模式下10批枳實(shí)水煎液基峰離子色譜圖（base peak chromatograms，BPC）進(jìn)行疊加（圖1-A），共標(biāo)記35個(gè)共有峰（圖1-B）。通過(guò)對(duì)比保留時(shí)間，分析一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)共有峰成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 10批枳實(shí)水煎液正離子模式下的BPC疊加圖 (A)和共有峰(B)

表2 10批枳實(shí)共有峰成分分析

Table 2 Analysis of common peaks in 10 batches of Aurantii Fructus Immaturus

峰號(hào)tR/min誤差(×10?6)離子模式m/z離子碎片(m/z)分子式化合物 理論值實(shí)驗(yàn)值 11.55 1.26[M＋H]+152.107 0152.106 8121.064 9, 103.055 1, 91.056 0, 77.040 7, 65.042 1, 51.028 3C9H13NON-甲基酪胺[12] 213.47 1.67[M＋H]+163.039 0163.038 7119.049 8, 107.049 6, 91.055 4, 77.040 7, 65.041 8, 51.027 4C9H6O3傘形花內(nèi)酯[12] 31.48 1.23[M＋H]+168.101 9168.101 7150.091 5, 107.050 9, 91.055 6, 77.040 7, 65.042 0C9H13NO2辛弗林[12-13] 44.912.16[M＋H]+179.033 9179.033 5161.022 8, 155.033 5, 137.022 9, 133.028 1, 123.043 6, 111.043 7C9H6O45,7-二羥基香豆素[13] 514.32?0.57[M＋H]+203.033 9203.034 0175.038 4, 159.043 5, 147.043 6, 131.048 8, 119.048 7C11H6O4花椒毒酚[12] 69.48 0.14[M＋H]+261.112 1261.112 1243.100 4, 159.043 6, 103.054 5C15H16O4橙皮內(nèi)酯[12] 78.05 1.29[M＋H]+273.075 7273.075 4153.017 3, 91.055 1C15H12O5柚皮素[13] 810.15?0.70[M＋H]+287.091 4287.091 6153.017 2, 133.064 9C16H14O5野櫻素[14] 97.35 ?0.82[M＋H]+289.070 7289.070 9153.017 8C15H12O6圣草酚[14] 108.55 ?0.94[M＋H]+303.086 3303.086 6153.017 0, 117.033 7C16H14O6高圣草素[14] 1112.68 ?0.94[M＋H]+303.086 3303.086 6153.017 2, 89.039 5C16H14O6橙皮素[13] 1213.40?0.68[M＋H]+315.151 0315.159 3163.038 1, 107.049 7C19H22O4環(huán)氧橙皮油素[15] 139.73 ?1.08[M＋H]+279.122 7279.123 0261.112 8, 243.100 4, 189.054 3, 103.054 7C15H18O5水合橙皮內(nèi)酯[14] 1413.32 0.15[M＋H]+333.169 7333.169 6163.038 3, 107.085 8C19H24O5馬爾敏[12] 1515.75 ?0.25[M＋H]+343.117 6343.117 7328.091 5, 313.067 8, 153.016 8C19H18O64′,5,7,8-四甲氧基黃酮[14] 1618.42 ?0.25[M＋H]+343.117 6343.117 7313.067 8, 285.073 4, 153.017 1C19H18O63′,4′,7,8-四甲氧基黃酮[14]

續(xù)表2

峰號(hào)tR/min誤差(×10?6)離子模式m/z離子碎片(m/z)分子式化合物 理論值實(shí)驗(yàn)值 1713.35 0.21[M＋H]+373.128 2373.128 1358.102 3, 181.012 1, 153.017 3C20H20O7異甜橙黃酮[14] 1815.68 0.21[M＋H]+373.128 2373.128 1343.077 7, 211.021 7, 135.043 2C20H20O7甜橙黃酮[12] 1920.08 0.21[M＋H]+373.128 2373.128 1343.076 8, 313.069 4, 153.017 3C20H20O7橘皮素[12] 2021.80 ?0.02[M＋H]+389.123 1389.123 1374.099 5, 313.069 8C20H20O85-O-去甲基川陳皮素[14] 2118.22 0.61[M＋H]+403.138 7403.138 5373.087 2, 165.050 3C21H22O8川陳皮素[12] 2220.25 ?0.58[M＋H]+419.133 7419.133 9404.109 0, 389.084 7, 371.075 1, 211.022 9C21H22O93-羥基-3′,4′,5,6,7,8-六甲氧基黃酮[12] 2319.42 0.48[M＋H]+433.149 3433.149 1418.123 5, 165.053 5C22H24O93′,4′,3,5,6,7,8-七甲氧基黃酮[12] 248.48 0.17[M＋H]+435.128 6435.128 5273.073 3, 153.016 9C21H22O10櫻桃苷[14] 2519.33 0.07[M＋H]+455.206 4455.206 4409.200 2, 161.059 4C26H30O7黃柏酮[13] 2617.22 0.73[M＋H]+471.201 3471.201 0425.193 5, 339.194 1, 161.059 2, 95.014 0C26H30O8檸檬苦素[12] 274.08 0.04[M＋H]+487.144 6487.144 6341.084 8, 179.032 9C21H26O13法篳枝苷[13] 2819.15 1.87[M＋H]+515.227 6515.226 6469.218 0, 411.214 6, 161.058 5, 95.013 0C28H34O9諾米林[12] 297.88 1.00[M＋H]+581.186 5581.185 9419.131 8, 273.073 6, 153.017 3C27H32O14蕓香柚皮苷[14] 308.42 1.00[M＋H]+581.186 5581.185 9383.110 6, 273.072 8, 153.017 2C27H32O14柚皮苷*[12-13] 315.51 ?0.76[M＋H]+595.165 7595.166 2577.151 5, 457.108 7, 295.060 3C27H30O15忍冬苦苷[14] 3210.00 0.05[M＋H]+595.202 1595.202 1433.147 8, 287.090 0, 153.017 9C28H34O14香風(fēng)草苷[12] 337.08 0.16[M＋H]+597.181 4597.181 3435.127 8, 289.070 3, 153.019 0C27H32O15圣草次苷*[12-13] 348.28 1.55[M＋H]+611.197 0611.196 1449.143 2, 303.084 2, 153.017 4C28H34O15橙皮苷*[12-13] 358.82 1.55[M＋H]+611.197 0611.196 1449.142 4, 303.083 6, 153.017 2C28H34O15新橙皮苷*[12-13]

*與對(duì)照品比對(duì)的化合物

*compounds compared to standard

3.2 枳實(shí)對(duì)FD的影響

3.2.1 一般行為學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠飲水、飲食、皮毛色澤、糞便無(wú)明顯變化，精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量增加。模型組大鼠飲水量和飲食逐漸減少，皮毛呈黃色，糞便柔軟，氣味惡臭和刺鼻，精神狀態(tài)差，容易被激怒，體質(zhì)量下降。與模型組相比，給予多潘立酮和不同批次枳實(shí)干預(yù)后，大鼠飲水量、進(jìn)食量逐漸增加，皮毛恢復(fù)光澤，糞便干燥，氣味稍臟，性情溫和，體質(zhì)量趨于正常水平。

3.2.2 胃腸動(dòng)力及血清藥效指標(biāo)測(cè)定 如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠胃排空率、小腸碳末推進(jìn)率及血清中胃動(dòng)素、胃泌素水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃排空率、小腸碳末推進(jìn)率及血清中胃動(dòng)素、胃泌素水平均顯著升高（＜0.01），且10批枳實(shí)組間無(wú)顯著差異。

3.3 譜效指標(biāo)相關(guān)性分析

通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度法和Pearson雙變量相關(guān)性分析計(jì)算35個(gè)共有峰峰面積與藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度，灰色關(guān)聯(lián)度數(shù)值越大，表明色譜峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)關(guān)聯(lián)性越大。成分與藥效指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)度值如圖3-A所示，根據(jù)平均關(guān)聯(lián)度值大于0.7進(jìn)行篩選，共篩選出10個(gè)與藥效指標(biāo)相關(guān)性強(qiáng)的成分，相關(guān)性程度依次為峰1＞峰3＞峰14＞峰34＞峰17＞峰2＞峰30＞峰33＞峰25＞峰35。成分與藥效指標(biāo)的Pearson相關(guān)系數(shù)值如圖3-B所示，根據(jù)平均值大于0.6篩選出與4個(gè)藥效指標(biāo)呈正相關(guān)的成分，相關(guān)性程度依次為峰3＞峰14＞峰33＞峰35＞峰34＞峰30＞峰25＞峰1。綜合分析2種方法可知辛弗林（峰3）、馬爾敏（峰14）、黃柏酮（峰25）、-甲基酪胺（峰1）、圣草次苷（峰33）、柚皮苷（峰30）、橙皮苷（峰34）、新橙皮苷（峰35）8個(gè)成分與枳實(shí)治療FD關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及相關(guān)性結(jié)果，選擇相關(guān)性較高、易得、可測(cè)的圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林5個(gè)成分進(jìn)行斑馬魚(yú)腸道蠕動(dòng)模型驗(yàn)證。

3.4 枳實(shí)單體成分的最大耐受劑量測(cè)定

如圖4所示，圣草次苷、辛弗林、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷5個(gè)單體成分在125～500 μg/mL質(zhì)量濃度下，斑馬魚(yú)無(wú)死亡。1000、2000 μg/mL質(zhì)量濃度下有不同程度的死亡，因此本研究中5個(gè)單體對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐受劑量為500 μg/mL。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

圖3 枳實(shí)共有峰峰面積與藥效指標(biāo)灰色關(guān)聯(lián)度(A) 和Pearson雙變量相關(guān)性(B) 分析

圖4 單體劑量-死亡率圖

3.5 枳實(shí)單體成分對(duì)斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用

如圖5和表3所示，與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)腸道內(nèi)容物熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組斑馬魚(yú)腸道內(nèi)容物熒光強(qiáng)度明顯降低（＜0.01），其對(duì)斑馬魚(yú)腸道蠕動(dòng)的促進(jìn)效果依次為新橙皮苷＞柚皮苷＞辛弗林＞橙皮苷＞圣草次苷。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為FD屬于“痞滿(mǎn)”“胃脘痛”“積滯”等范疇，主要與情志不暢、外邪侵襲、飲食所傷、脾胃虛弱等因素有關(guān)，臨床上中醫(yī)辨證施治，以健脾和胃、理氣降逆為主[16]。枳實(shí)具有破氣消積、化痰消痞的功效，為中醫(yī)臨床治療FD的常用中藥之一，以其為君藥的復(fù)方如枳實(shí)消痞丸[17]、枳實(shí)導(dǎo)滯丸、枳術(shù)丸、四逆散[18]等治療FD也取得了良好療效，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明晰。

圖5 各組斑馬魚(yú)腸道內(nèi)容物的熒光顯微成像圖 (×4)

表3 枳實(shí)單體成分對(duì)斑馬魚(yú)腸蠕動(dòng)的促進(jìn)作用(, n = 10)

Table 3 Promoting effect of monomer components of Aurantii Fructus Immaturus on intestinal peristalsis of zebrafish (, n = 10)

組別劑量/(μg·mL?1)斑馬魚(yú)腸道內(nèi)容物熒光強(qiáng)度腸蠕動(dòng)促進(jìn)率/% 對(duì)照—541.79±214.12100.00 模型—1 376.86±354.85##0 多潘立酮30741.65±280.05**76.07 圣草次苷250881.96±250.37**59.26 柚皮苷250761.88±338.53**73.64 橙皮苷250827.62±202.39**65.77 新橙皮苷250758.31±173.04**74.07 辛弗林250774.27±283.44**72.16

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01

##< 0.01control group;**< 0.01model group

本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)10批枳實(shí)的水煎液進(jìn)行分析，對(duì)色譜圖進(jìn)行疊加獲得共有峰，確認(rèn)了35個(gè)共有峰，通過(guò)保留時(shí)間以及文獻(xiàn)信息對(duì)共有峰成分進(jìn)行分析鑒定。其次，采用不規(guī)則喂養(yǎng)和夾尾刺激復(fù)合因素建立FD大鼠模型，通過(guò)觀察大鼠行為學(xué)以及枳實(shí)對(duì)大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率及血清中胃動(dòng)素、胃泌素水平的影響，探究枳實(shí)對(duì)FD大鼠的影響[19]。進(jìn)一步運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立枳實(shí)圖譜數(shù)據(jù)與中藥藥效活性的內(nèi)在聯(lián)系，有助于探明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠推測(cè)與藥效相關(guān)的成分群[20]?；疑P(guān)聯(lián)度分析能夠很好地識(shí)別出與藥效具有較高相關(guān)性的峰，但不能精確識(shí)別出正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)；而Pearson雙變量相關(guān)性分析可以篩選出與藥效呈正相關(guān)的成分。本研究將2種方法相結(jié)合，初步篩選出辛弗林、馬爾敏、黃柏酮、-甲基酪胺、圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷與枳實(shí)治療FD的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，辛弗林能夠顯著提高胃泌素和辛?；囸I激素的含量，更好地促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)[21]；橙皮苷能夠促進(jìn)胃動(dòng)素的釋放，增加胃排空率和小腸碳末推進(jìn)率，促進(jìn)胃腸動(dòng)力，從而改善FD癥狀[22]；新橙皮苷具有較好的抗氧化作用，可以改善胃黏膜損傷，增加黏液含量，且可顯著降低胃酸分泌和排出，增加胃pH值，促進(jìn)胃腸動(dòng)力[23]；辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷能夠影響胃腸激素分泌，從而促進(jìn)脾虛模型大鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)[24]。枳實(shí)的主要藥效成分為生物堿和黃酮2類(lèi)物質(zhì)，黃酮類(lèi)成分含量較高，占5%～28%，為促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)的主要成分[25-26]；生物堿類(lèi)成分為強(qiáng)心、升壓的主要成分[25]，其中辛弗林也具有促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)的作用[21]。本研究通過(guò)譜效相關(guān)性篩選出的8個(gè)成分中，馬爾敏不易獲得，-甲基酪胺在枳實(shí)中含量較低，黃柏酮與藥效指標(biāo)相關(guān)性相對(duì)較低。因此從8個(gè)成分中選出與藥效相關(guān)性高、易得、可測(cè)的圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林5個(gè)成分進(jìn)行斑馬魚(yú)腸道蠕動(dòng)模型的驗(yàn)證，結(jié)果表明5個(gè)單體均能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，為枳實(shí)治療FD的藥效物質(zhì)。

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，采用FD大鼠模型和斑馬魚(yú)腸道蠕動(dòng)模型闡明了枳實(shí)治療FD的藥效物質(zhì)，并篩選出潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)枳實(shí)藥材、飲片及制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升具有重要的參考價(jià)值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Correlation analysis and experimental verification between chemical components ofand treatment of functional dyspepsia

QU Zhong-yuan1, LI Su-nan1, SUN Zhi-wei1, SUN Xiang-ming1, YU Jia-hui1, SHU Qi1, ZOU Xiang1, LUO Rong2

1. Pharmaceutical Engineering Technology Research Center, College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China 2. School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

To study the pharmacodynamic basis of Zhishi () in the treatment of functional dyspepsia (FD).UPLC-Q-TOF-MS/MS technology was used to analyze the common components of 10 batches of. FD model of rats was established by irregular feeding and tail pinching stimulation, small intestine carbon end advance rate, gastric emptying rate and levels of motilin and gastrin in serum were used as pharmacodynamic indexes, grey correlation analysis method and Pearson bivariate correlation analysis were used to establish the correlation between the peak area of common peak in chromatogram and pharmacodynamic index. Pharmacodynamic substances ofin the treatment of FD were screened out, and efficacy was verified by zebrafish intestinal motility model.A total of 35 common components were identified in 10 batches ofdecoction. Synephrine, malmin, obacunone,-methyltyramine, eriocitrin, naringin, hesperidin and neohesperidin eight components were screened out as potential pharmacodynamic substances ofin the treatment of FD through grey correlation and Pearson bivariate correlation analysis. Eriocitrin, naringin, hesperidin, neohesperidin and synephrine with strong efficacy correlation, easy to obtain and measurable were selected for experimental verification, above five components significantly promoted zebrafish intestines peristalsis (< 0.01).Eriocitrin, naringin, hesperidin, neohesperidin and synephrine are the pharmacodynamic substances ofin the treatment of FD.

; functional dyspepsia; intestinal peristalsis; eriocitrin; naringin; hesperidin; neohesperidin; synephrine

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6521 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.024

2022-07-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973431）

曲中原（1980—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及中藥炮制研究。E-mail: qiuqiuqu@163.com

羅 容（1978—），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥鑒定方法學(xué)和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: zhongyaojianding@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]