王瑞雪，房一明，郭娜，姚晶，張筠，初眾

1. 黑龍江東方學(xué)院食品工程學(xué)院（哈爾濱市 150066）；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（萬寧市 571533）

糖尿病是由于胰島素分泌不足而引發(fā)的代謝紊亂疾病，主要分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅱ型糖尿病患者占多數(shù)[1-2]。胰島β細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要成因，胰島素抵抗主要表現(xiàn)為肝臟及其外周組織對葡萄糖的攝取和利用能力下降[3-5]。建立細(xì)胞模型是一種在體外探究物質(zhì)功能性的試驗(yàn)手段，HepG2細(xì)胞與正常肝細(xì)胞功能相近，在高濃度胰島素作用下，其表面的胰島素受體減少，較易產(chǎn)生胰島素抵抗，故此，用高濃度的胰島素誘導(dǎo)建立的IRHepG2模型是篩選改善胰島素抵抗成分的理想細(xì)胞模型[6-11]。

檸檬（Citrus limon）屬蕓香科柑橘屬，檸檬果皮占整個檸檬的20%左右，是檸檬加工的主要副產(chǎn)物[12]。其果皮富含精油、果膠、酚酸、類黃酮等活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗癌、抗菌和降血糖等作用[13-16]。試驗(yàn)首先探究IR-HepG2細(xì)胞模型的最佳建立方法，其次來研究檸檬皮多酚對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響，以期為進(jìn)一步研究檸檬皮多酚的降血糖功能奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞株、DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、0.25%EDTA-胰酶、青-鏈霉素（蘇州美侖生物科技有限公司）；胎牛血清（哈爾濱市立峰生物工程有限公司）；鹽酸二甲雙胍、MTT、DMSO（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；胰島素（Beyotime公司）；葡萄糖檢測試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；純度68%檸檬皮多酚（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

150iCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；TS2-FL倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（上海博迅生物儀器股份有限公司）；80-2離心機(jī)（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）；RT-6000酶標(biāo)分析儀（深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)合Seyfizadeh等[17]和馬萍等[18]的方法，將凍存的HepG2細(xì)胞于37 ℃水浴中1 min內(nèi)快速解凍，于89%DMEM∶10%胎牛血清∶1%青-鏈霉素的培養(yǎng)基和37℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～4 d按1∶3傳代。

1.3.2 不同濃度胰島素對HepG2細(xì)胞存活率的影響

參考隋淼等[19]的方法稍作修改，設(shè)立空白組（不含細(xì)胞）、對照組（含細(xì)胞不加胰島素）和模型組（含細(xì)胞和不同濃度胰島素），將HepG2細(xì)胞消化后，吹打均勻，以每孔2×104個細(xì)胞鋪于96孔板，培養(yǎng)過夜，模型組分別加入胰島素濃度為1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8和1×10-9mol/L的DMEM培養(yǎng)液，100 μL/孔，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)MTT法[20]，加入5 mg/mL MTT溶液（10 μL/孔），4 h后移除培養(yǎng)液，加入DMSO（150 μL/孔），充分振蕩，酶標(biāo)儀492 nm測定吸光度，根據(jù)式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 胰島素抵抗模型的建立

1.3.3.1 胰島素最佳作用濃度和時間的確定

參考王夢等[21]的方法稍作修改，設(shè)立空白對照組（不含胰島素）和胰島素組（分別加入胰島素終濃度為1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8和1×10-9mol/L的培養(yǎng)基），HepG2細(xì)胞鋪板同1.3.2小節(jié)，培養(yǎng)過夜，棄去舊液，加入各濃度胰島素培養(yǎng)液，100 μL/孔，培養(yǎng)48 h，每12 h用葡萄糖檢測試劑盒測定一次葡萄糖消耗量（方法參照試劑盒說明書），按式（2）、（3）計(jì)算葡萄糖消耗量和消耗率。

式中：Δm為葡萄糖消耗量，mmol/L；M為葡萄糖消耗率，%；n為空白對照組葡萄糖消耗量，mmol/L；m為模型組葡萄糖消耗量，mmol/L。

1.3.3.2 IR-HepG2模型穩(wěn)定性的測定

用1.3.3.1小節(jié)中的最佳建模方案建模后，棄去舊液，更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每隔24 h測定一次葡萄糖消耗量（方法同1.3.3.1小節(jié)）。

1.3.4 IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量及存活率的測定

結(jié)合符群等[22]和齊佳等[23]的方法稍作修改，以1.3.3小節(jié)中最佳建模方案建模，設(shè)空白對照組和0.05mg/mL二甲雙胍陽性對照組以及LPP樣品組，LPP終質(zhì)量濃度分別為2.5，2，1.5，1，0.5和0.1 mg/mL，分別培養(yǎng)24，48和72 h，測定LPP干預(yù)后IR-HepG2細(xì)胞存活率（方法同1.3.2小節(jié)）及其培養(yǎng)液中葡萄糖的含量（方法同1.3.3小節(jié)），探究不同濃度的檸檬皮多酚對IR-HepG2細(xì)胞存活率和葡萄糖消耗量的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 2019b、SPSS 17.0進(jìn)行繪圖及數(shù)據(jù)分析，以Duncans’法進(jìn)行組間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度胰島素對HepG2細(xì)胞存活率的影響

通過測定24 h時各組細(xì)胞在不同劑量胰島素作用后的細(xì)胞存活率來判斷用胰島素建模的安全用藥濃度。

由表1可知，除1×10-8mol/L的胰島素組外，其余濃度的胰島素組，隨胰島素濃度增加，吸光度減小，1×10-8mol/L的胰島素可能對細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用。胰島素濃度在1×10-5～1×10-9mol/L濃度范圍內(nèi)時，細(xì)胞存活率均在80%以上，對細(xì)胞基本無毒副作用，因此后續(xù)建模安全給藥濃度可以設(shè)置在1×10-5～1×10-9mol/L范圍內(nèi)[24]。

表1 不同濃度的胰島素對HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=5）

2.2 建立胰島素抵抗模型

2.2.1 確定最佳濃度和作用時間

經(jīng)過對比空白對照組和樣品組在各時間段的葡萄糖消耗量，來判斷IR-HepG2細(xì)胞模型的最佳建模方案。

由圖1可知，在0～12 h與對照組相比胰島素組的葡萄糖消耗量除了胰島素濃度為1×10-8mol/L組以外差異均不明顯，在細(xì)胞培養(yǎng)的前12 h內(nèi)，HepG2細(xì)胞攝取葡萄糖的能力良好，未出現(xiàn)胰島素抵抗的現(xiàn)象。在細(xì)胞培養(yǎng)到24 h時，部分濃度下的HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取和利用能力出現(xiàn)異常，當(dāng)胰島素濃度為1×10-5mol/L和1×10-6mol/L時，葡萄糖消耗量相比前12 h有所下降，僅為1.81±0.05 mmol/L和1.84±0.11 mmol/L，與對照組相比葡萄糖消耗量分別減少了34.4%和33.3%，差異顯著（P＜0.05），此時可以判斷HepG2細(xì)胞出現(xiàn)了糖代謝紊亂現(xiàn)象，且這兩組的葡萄糖消耗量在12～48 h內(nèi)均顯著（P＜0.05）低于對照組，在24 h時抵抗?fàn)顟B(tài)最為明顯。結(jié)合1.3.4的細(xì)胞存活率，最終確定培養(yǎng)液中胰島素的濃度為1×10-6mol/L培養(yǎng)24 h為最佳建模方案。該結(jié)果與劉志霞等[25]建立IR-HepG2模型時所用的胰島素添加量和誘導(dǎo)時間相吻合。

圖1 不同濃度胰島素對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（n=5）

2.2.2 IR-HepG2模型穩(wěn)定性評估

培養(yǎng)液胰島素濃度1×10-6mol/L作用24 h后IRHepG2細(xì)胞更換為正常培養(yǎng)基中每隔24 h測定葡萄糖消耗量，結(jié)果見表2。

表2 IR-HepG2細(xì)胞模型去負(fù)荷后不同時間點(diǎn)的葡萄糖消耗量（n=5） 單位：mmol/L

由表2可知，與對照組相比，胰島素組在24～72 h內(nèi)HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量更低，具有顯著性差異（P＜0.05），因此本方法建立的IR-HepG2細(xì)胞模型可持續(xù)72 h。

2.3 檸檬皮多酚對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量及存活率的影響

用0.1～2.5 mg/mL的LPP分別作用于IR-HepG2細(xì)胞24，48和72 h，測定葡萄糖含量及細(xì)胞存活率。如圖2～圖3。

圖2 檸檬皮多酚對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（n=5）

圖3 LPP對IR-HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=5）

由圖2可知，各組葡萄糖消耗量隨時間的增加逐漸降低，出現(xiàn)這個趨勢的原因極可能是與細(xì)胞活性有關(guān)，隨著培養(yǎng)時間增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，利用葡萄糖的能力有所下降[26]。模型組的葡萄糖消耗量在各時間段均顯著低于空白對照組，說明細(xì)胞出現(xiàn)了葡萄糖代謝異常[27]。與模型組相比，陽性對照組和LPP濃度為0.1～2 mg/mL時的葡萄糖消耗量在各時間段均顯著（P＜0.05）高于模型組，且在LPP濃度為0.5 mg/mL時葡萄糖消耗量整體達(dá)到了峰值，在24 h時最高（4.78±0.13 mmol/L），比模型組的葡萄糖消耗率高了15.1%。與陽性對照組相比，在LPP質(zhì)量濃度為0.1～1 mg/mL時各時段的葡萄糖消耗量與陽性對照組差異不顯著（P＞0.05），說明LPP在這個濃度范圍內(nèi)與0.05 mg/ml的二甲雙胍改善胰島素抵抗的能力相近。與王夢麗[28]研究的莢蒾果多酚相比，LPP在相同劑量（0.05 mg/mL）和培養(yǎng)時間（24 h）下對葡萄糖的消耗量比莢蒾果多酚多了1.29 mmol/L，相比之下LPP改善胰島素抵抗的效果更好。

評價LPP緩解胰島素抵抗時，對IR-HepG2細(xì)胞活性的影響，以確保對細(xì)胞的安全性。測定LPP在不同濃度和時間下，對IR-HepG2細(xì)胞存活率的影響，如圖3。

從圖3中可以看出，相較空白對照組，各組細(xì)胞存活率均在80%以上，且樣品組隨著LPP濃度的降低細(xì)胞存活率上升，呈現(xiàn)劑量依賴性，說明高濃度的LPP對IR-HepG2細(xì)胞存活率有一定的抑制作用[29]。整體趨勢表明24 h時細(xì)胞存活率高于其他時間組，72 h時細(xì)胞存活率最低。可判定24 h可作為LPP改善胰島素抵抗干預(yù)的最佳時間[30]。

3 結(jié)論

文章以 HepG2細(xì)胞為載體，通過建立最佳的IRHepG2細(xì)胞模型，探究檸檬皮多酚對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)液中胰島素濃度為1×10-6mol/L培養(yǎng)24 h時可以建立效果最佳的IRHepG2細(xì)胞模型。當(dāng)檸檬皮多酚質(zhì)量濃度在0.1～2 mg/mL時可以明顯提高IR-HepG2細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，但是對于其作用機(jī)制還不清楚，因此還需繼續(xù)深入探究其作用機(jī)制，為檸檬皮多酚在食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的運(yùn)用提供理論依據(jù)。