侵染小構(gòu)樹(shù)的雙生病毒及其缺陷DNA形式的檢測(cè)和特征分析

孔衛(wèi)青，楊金宏，凌君，楚渠，孟剛

(安康學(xué)院陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000)

雙生病毒是世界范圍內(nèi)具有嚴(yán)重危害的單鏈環(huán)狀DNA病毒，可以侵染多種經(jīng)濟(jì)作物，通常以葉蟬、粉虱、蚜蟲(chóng)、角蟬等昆蟲(chóng)為介體進(jìn)行傳播[1]。雙生病毒基因組結(jié)構(gòu)有單組分和雙組分兩種。單組分結(jié)構(gòu)雙生病毒的基因組由一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)組成，可編碼4～7個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中病毒鏈主要編碼外殼蛋白(coat protein，CP)和移動(dòng)蛋白(movement protein，MP)，互補(bǔ)鏈上主要編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(replication-related protein A，RepA)及其剪接體Rep。病毒鏈和互補(bǔ)鏈的ORF之間由大小間隔區(qū)(large/small intergenic region，LIR/SIR)隔開(kāi)[1]。雙組分雙生病毒的基因組由兩個(gè)環(huán)狀ssDNA(DNA-A和DNA-B)組成，僅存在于菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)[2]，其中DNA-A組分的病毒鏈主要編碼CP蛋白、互補(bǔ)鏈編碼Rep，DNA-B組分主要編碼MP蛋白，具有雙生病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄需要的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及保守的頂端序列。另外，雙生病毒還往往存在伴隨分子，如缺陷DNA(defective DNA，D-DNA)，其由雙組分雙生病毒的DNA-B組分或單組分雙生病毒的DNA-A缺失引起，有部分Rep基因和完整的IR區(qū)，有些含未知來(lái)源序列的插入甚至新的ORF[3]。D-DNA可以影響輔助病毒的正常活動(dòng)，進(jìn)而使病毒病癥狀減輕，因此可以此發(fā)展新的抗病策略[4]。

小構(gòu)樹(shù)(Broussonetia kazinoki)是薔薇目?？茦?gòu)屬植物，木質(zhì)素含量低，是優(yōu)質(zhì)的造紙?jiān)?。小?gòu)樹(shù)還可做藥用，果實(shí)及根皮有補(bǔ)腎利尿、強(qiáng)筋骨的功效，韌皮部汁液可治癬瘡及蛇蟲(chóng)獸等的咬傷。由小構(gòu)樹(shù)作母本培育得到的雜交構(gòu)樹(shù)，葉片肥厚，蛋白含量高，能代替奶牛精飼料生產(chǎn)使用的苜蓿草。近年來(lái)，在秦嶺腹地發(fā)現(xiàn)較多的小構(gòu)樹(shù)出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象。據(jù)Qiu等[5]的研究表明，構(gòu)樹(shù)卷葉病毒(Paper mulberry leaf curl virus 1and2，PMLCV-1和PMLCV-2)可引起構(gòu)樹(shù)葉片卷縮，但引起小構(gòu)樹(shù)葉片黃化卷曲的病原未見(jiàn)報(bào)道?；诖吮狙芯繉?duì)小構(gòu)樹(shù)的黃化卷曲葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，對(duì)其中的病毒及D-DNA形式進(jìn)行鑒定分析，為今后該病毒的寄主及防治研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年6月至8月在陜西省安康市漢濱區(qū)建民鎮(zhèn)(JM)、恒口鎮(zhèn)(HK)、吉河鎮(zhèn)(JH)采集小構(gòu)樹(shù)表現(xiàn)黃化卷曲癥狀葉片(Kozo)各2份，液氮速凍后-86℃保存?zhèn)溆?。高保真Taq酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及病毒序列分析 取3個(gè)地點(diǎn)的小構(gòu)樹(shù)葉片各1份，采用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取RNA，送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并采用HiSeq2000平臺(tái)(美國(guó)ABI)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組雙末端測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度150 bp。對(duì)測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理，去除序列接頭、Q值＜20、長(zhǎng)度小于35 bp的序列，得到的clean data用Trinity 2.8進(jìn)行無(wú)參組裝，參數(shù)設(shè)置為min_kmer_cov 2，其余默認(rèn)。將無(wú)參組裝獲得的所有序列進(jìn)行在線BLASTx和BLASTn比對(duì)分析，利用HISTA 2.2軟件比對(duì)分析clean data中病原的基因組序列及覆蓋度。

1.2.2 PCR檢測(cè)和克隆測(cè)序鑒定 根據(jù)組裝獲得的病毒序列設(shè)計(jì)引物(表1)。利用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取Kozo-JM、Kozo-HK、Kozo-JH樣本的基因組DNA，分別使用750F/2455R、3460F/1780R和2420F/3580R引物組合對(duì)3個(gè)樣本的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為:2×Premix 25 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃5 min；94℃30 s，52℃45 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。瓊脂糖凝膠回收試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]回收擴(kuò)增目的條帶，連接至pGEMT easy載體(Promega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞[寶生物工程(大連)有限公司]，挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究使用引物及序列

1.2.3 序列分析 克隆子序列的拼接使用Bioedit 7.2.5，使用在線ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)編碼區(qū)，使用FGENESH 2.6[6]預(yù)測(cè)內(nèi)含子，蛋白的保守功能域預(yù)測(cè)使用在線CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/)[7]和SMART(http://smart.embl.de/)，使 用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，使用MUSCLE 3.8.31[8]進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.4 D-DNA的擴(kuò)增和分析 根據(jù)雙生病毒可能存在D-DNA的情況，對(duì)1.2.2中的非目標(biāo)擴(kuò)增條帶產(chǎn)物進(jìn)行回收和克隆測(cè)序。同時(shí)再次提取Kozo-JM、Kozo-HK、Kozo-JH樣本各1份的基因組DNA，使用2420F引物分別和1780R以及3700R引物對(duì)各樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別回收各擴(kuò)增條帶，挑取3個(gè)克隆送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，分析其中的D-DNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

Kozo-JM、Kozo-HB、Kozo-JH樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控處理，分別獲得45 808 556、45 564 724、44 670 450條高質(zhì)量序列，平均長(zhǎng)度分別為140.69、137.70、138.81 bp；Trinity組裝所有序列獲得77 583條unigene；經(jīng)BLASTx和BLASTn比對(duì)分析，得到一條與PMLCV-2同源的病毒序列，命名為小構(gòu)樹(shù)卷葉病毒(Kozo leaf curl virus 2，KozoLCV-2)，未發(fā)現(xiàn)其它病原序列。

2.2 病毒序列的PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序

使用設(shè)計(jì)合成的引物750F和2455R、3460F和1780R以及2420F和3580R對(duì)3個(gè)小構(gòu)樹(shù)樣本中的病毒序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果750F和2455R引物對(duì)擴(kuò)增出1 700 bp左右的單一條帶(圖1A)，3460F和1780R引物對(duì)除了擴(kuò)增出約2 100 bp的主條帶，還在1 300 bp左右有一弱條帶(圖1B)，2420F和3580R引物對(duì)在JM和HK樣本中擴(kuò)增出1 200 bp左右的單一條帶，JH樣本同時(shí)還獲得了500 bp左右的2條擴(kuò)增條帶(圖1C)。

圖1 KozoLCV-2的PCR擴(kuò)增

對(duì)擴(kuò)增條帶1a、1b1和1c1進(jìn)行回收克隆測(cè)序，拼接各序列獲得基因組序列，KozoLCV-2-JM和KozoLCV-2-HK長(zhǎng)3 756 bp，KozoLCV-2-JH長(zhǎng)3 758 bp(GenBank登錄號(hào):OL514011～OL514013)，均為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，相互之間相似性在97.46%～99.65%，與PMLCV-2(MN595126～MN595128)序列相似性為88.82%～94.59%。

2.3 KozoLCV-2的D-DNA擴(kuò)增和克隆測(cè)序

對(duì)2.2中PCR擴(kuò)增的條帶1b2、1c2和1c3進(jìn)行克隆測(cè)序，以分析其中是否存在D-DNA序列。結(jié)果分別獲得了1 270、610、582 bp序列，3條序列均發(fā)生了部分片段的缺失。

進(jìn)一步使用2420F和1780R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果3個(gè)樣本均在約1 200 bp和650 bp處分別有2條條帶(圖2A)；使用引物2420F和3700R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Kozo-JM和Kozo-HK樣本只有一條約150 bp條帶，而Kozo-JH樣本在約500 bp處還有兩條擴(kuò)增條帶(圖2B)。

圖2 KozoLCV-2的D-DNAs的PCR擴(kuò)增

對(duì)2a1、2a2、2b1、2b2、2b3擴(kuò)增條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，2a1、2a2、2b1和2b2分別獲得1 196、635、549 bp和453 bp的序列，2b3的克隆子獲得了6條長(zhǎng)度從128 bp到153 bp的序列。拼接組裝所有序列獲得10條長(zhǎng)度1 257～3 114 bp的D-DNAs(GenBank登錄號(hào):OL581701～OL581703，OL581710～OL581715，OL581717)。

2.4 序列分析

本研究獲得的KozoLCV-2基因組結(jié)構(gòu)與PMLCV-2非常相似(圖3A)，正義鏈均含有4個(gè)ORF(V1、V2、V3和V4)，互補(bǔ)鏈2個(gè)(C1和C1:C2)；LIR位于C1和V3間，含有復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需的由高度保守的非核苷酸基序TAATATTAC及其兩側(cè)富含GC的反向重復(fù)序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖3B)；SIR位于V4和C1:C2間，也是正義鏈和互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。

進(jìn)一步分析KozoLCV-2的編碼區(qū)，V1的ORF與V2部分重疊，其編碼的CP蛋白(E值4.41e-24)與PMLCV-2和柑橘褪綠矮縮相關(guān)病毒(Citrus chlorotic dwarf associated virus，CCDaV)的CP蛋白相似性分別為98%和73%。V2的ORF長(zhǎng)321 bp，編碼106個(gè)氨基酸，N末端和中心區(qū)相對(duì)保守。V3區(qū)長(zhǎng)216 bp，與V2部分重疊，編碼71個(gè)氨基酸，其中E13～V35為其跨膜結(jié)構(gòu)域。V4區(qū)長(zhǎng)909 bp，編碼302個(gè)氨基酸，在線CD預(yù)測(cè)其N11～S284區(qū)域與雙生病毒BL1移動(dòng)蛋白有非常高的相似性(E值7.85e-107)。互補(bǔ)鏈上的兩個(gè)ORF(C1和C1:C2)分別編碼RepA和Rep，與PMLCV-2和CCDaV的同源蛋白相似性分別為90%和67%，含有雙生病毒Rep的相關(guān)結(jié)構(gòu)域，如Motif I(F37LTYP41)、Motif II(H79VH81)、RCR motif III(Y131LKKS135)以及Walker A(G246PSRSGKT253)和Walker B(L279YNVIDDI286)等。

另外本研究KozoLCV-2的互補(bǔ)鏈上存在一個(gè)長(zhǎng)119 bp的內(nèi)含子(圖3C)，AU(61.34%)含量明顯高于兩側(cè)外顯子。利用轉(zhuǎn)錄組clean data分析其對(duì)基因組的覆蓋度，獲得了37條序列覆蓋兩外顯子間的連接處(圖3C)，表明其為選擇性剪接內(nèi)含子，為體內(nèi)同時(shí)產(chǎn)生編碼RepA和Rep的選擇性剪接提供了證據(jù)。

分析拼接所得10種D-DNAs形式，其中9種有完好的雙生病毒莖環(huán)結(jié)構(gòu)，1種形式的該結(jié)構(gòu)被來(lái)自PMLCV-2-TL的RepA第二外顯子的末端序列(2 531～2 636 bp)的插入破壞，該序列還同時(shí)插入了3種D-DNAs的SIR區(qū)。7種DDNAs形式有完整的ORF(V1～V4)，完全或部分缺失了復(fù)制酶區(qū)域，2種D-DNAs形式僅有ORF V4和V1部分(圖3D)，僅一種D-DNA有完整ORF V1和V4以及復(fù)制酶區(qū)域。

圖3 KozoLCV-2基因組結(jié)構(gòu)特征及其D-DNAs的結(jié)構(gòu)示意圖

3 討論與結(jié)論

小構(gòu)樹(shù)廣泛分布于我國(guó)各省區(qū)，富含黃酮、生物堿和高蛋白，具有較大的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值，迄今為止，未見(jiàn)有關(guān)小構(gòu)樹(shù)病原體的研究。本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序獲得了小構(gòu)樹(shù)黃化葉片中的雙生病毒序列，并通過(guò)不同覆蓋區(qū)域克隆子的測(cè)序，證實(shí)了小構(gòu)樹(shù)的雙生病毒序列、環(huán)狀基因組結(jié)構(gòu)及其D-DNAs形式。

與本研究KozoLCV-2具有序列相似性的病毒還有來(lái)自雙生病毒Citlodavirus屬的CCDaV[9]、PCMoV[10]、CaCDaV[11]，尤其V1(CP)和C1:C2(Rep)區(qū)。但KozoLCV-2的V2編碼的氨基酸僅與PMLCV-2的V2有高相似性，與CaCDaV的MP(QEQ92297.1)部分區(qū)域有50%的相似性。KozoLCV-2的V3編碼氨基酸，除PMLCV-2外，沒(méi)有其他匹配結(jié)果，類似的結(jié)果也存在于Euphorbia caput-medusae latent virus(EcmLV)[12]、Turnip curly top virus(TCTV)[13]、Eragrostis curvula streak virus(ECSV)[14]等雙生病毒中。KozoLCV-2的V4有典型的30 kD運(yùn)動(dòng)蛋白家族的特征，且序列上有dsDNA結(jié)合需要的Motif I、滾環(huán)復(fù)制中蛋白質(zhì)構(gòu)象和DNA斷裂的金屬結(jié)合位點(diǎn)域Motif II、DNA切割催化位點(diǎn)域motif III[15]以及核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的重要成分Walker A和Walker B域[16]。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中互補(bǔ)鏈的轉(zhuǎn)錄本為KozoLCV-2互補(bǔ)鏈含有內(nèi)含子提供了證據(jù)，其具有植物U2型內(nèi)含子(U2-type intron)的分支點(diǎn)特征和剪接位點(diǎn)[17]，AU接近高效拼接所需的最小值[18]，表明KozoLCV-2的Rep蛋白表達(dá)可能類似玉米條紋病毒Maize streak virus(MSV)[19]、Beet curly top Iran virus(BCTIV)[20]以及Grapevine red blotch-associated virus(GRBaV)[21]和EcmLV[12]等。

雙生病毒的D-DNA可以通過(guò)病毒基因組的缺失、倒置、重復(fù)、重排及外源DNA的插入形成，為病毒的重組提供了原始材料，豐富了雙生病毒種群多樣性[22]。D-DNA還能干擾輔助病毒的復(fù)制，如非洲木薯花葉病毒[African cassava mosaic virus(ACMV)]的DNA-B缺陷分子和勝紅薊黃脈病毒[Ageratum yellow mosaic virus(AYVV)]的DNA-A缺陷分子[4]，與輔助病毒的基因組DNA共同競(jìng)爭(zhēng)寄主細(xì)胞資源，使病毒誘導(dǎo)的典型病癥減輕。由于缺陷DNA獨(dú)特的抗病毒作用，已被作為疫苗佐劑應(yīng)用于動(dòng)物病毒防治[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然KozoLCV-2和PMLCV-2基因組結(jié)構(gòu)和組成非常相似，但小構(gòu)樹(shù)的KozoLCV-2基因組同時(shí)存在D-DNAs，而Qiu等[5]的研究以及本團(tuán)隊(duì)檢測(cè)患病構(gòu)樹(shù)中均沒(méi)有D-DNA分子(結(jié)果未展示，GenBank登錄號(hào):OL514014～OL514016)，說(shuō)明同種病毒的D-DNA的產(chǎn)生具有宿主差異性。