劉文雙，魏秀麗，趙云亭，劉寶濤，鄒明

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省飼料獸醫(yī)質(zhì)量檢驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250022；3.萊州市文昌路畜牧獸醫(yī)站，山東 萊州 261400)

大腸桿菌病(Colibacillosis)作為畜禽養(yǎng)殖中的常見疾病，隨著耐藥性致病菌株的擴(kuò)散和感染，給獸醫(yī)臨床抗感染治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。隨著人們生活水平的不斷提高，雞蛋作為高蛋白營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)來(lái)源之一，越來(lái)越成為生活中必不可少的食品，隨著需求的不斷增加，我國(guó)蛋雞養(yǎng)殖行業(yè)迅速發(fā)展，經(jīng)營(yíng)規(guī)模也不斷擴(kuò)大，大腸桿菌感染情況頻發(fā)，一方面易造成蛋雞出現(xiàn)急性敗血癥和腹腔腹膜炎，嚴(yán)重降低蛋雞的健康狀態(tài)和產(chǎn)蛋性能[2]，另一方面抗生素的濫用造成大量耐藥大腸桿菌在生物系統(tǒng)中通過(guò)食物鏈廣泛傳播，不僅給動(dòng)物生產(chǎn)造成損失，還大大提高了人體感染細(xì)菌疾病的治療難度。

近年研究表明，攜帶blaCTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥基因的大腸桿菌的耐藥程度不斷提高，多藥耐藥情況也較為嚴(yán)重。blaCTX-M是最為常見的可以通過(guò)質(zhì)?；蛘呖寺鞑ゲ?duì)人類造成危害的基因型。近年來(lái)，不斷有研究報(bào)道從動(dòng)物及人源中分離出攜帶blaCTX-M耐藥基因的大腸桿菌的情況。張立偉等[3]對(duì)河北省56株雞源大腸桿菌的blaCTX-M耐藥基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明blaCTX-M-9占48.78%、blaCTX-M-1占43.90%，并呈現(xiàn)多重耐藥性。孫文萱等[4]選取69株2014—2016年從醫(yī)院細(xì)菌室分離的大腸桿菌，其中36株blaCTX-M型基因，占52.2%；趙東霞[5]研究表明，92株人源大腸桿菌中86株為blaCTX-M陽(yáng)性菌株，占93.5%?？梢?，blaCTX-M型基因的流行傳播情況非常嚴(yán)峻。blaCTX-M基因由質(zhì)粒攜帶進(jìn)行水平傳播，通過(guò)食物鏈在全球范圍內(nèi)迅速擴(kuò)散[6]。目前報(bào)道中很少有專門針對(duì)蛋雞源大腸桿菌的研究，因此，本試驗(yàn)對(duì)山東地區(qū)蛋雞源攜帶blaCTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺耐藥基因的大腸桿菌耐藥情況及水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)查，以期為指導(dǎo)合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年從山東省濟(jì)南市(60份)、青島市(75份)、日照市(49份)、德州市(60份)、濰坊市(76份)5個(gè)蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)采集糞便樣本，共計(jì)320份。

1.2 主要試驗(yàn)材料

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯、LB肉湯、細(xì)菌生化微量鑒定管，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR Buffer、dNTP、Taq酶、DNA Marker，購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

藥敏試驗(yàn)原藥:頭孢噻肟(cefotaxime sodium，CTX)、阿米卡星(amikacin，AMK)、安普霉素(apramycin，APR)、大 觀 霉 素(spectinomycin，SPE)、阿莫西林(amoxicillin，AMX)、頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)，購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；頭孢噻呋(ceftiofur，CTF)、氨芐西林(ampicillin，AMP)、鏈霉素(streptomycin，STR)、多粘菌素(colistin，COL)、環(huán) 丙 沙 星(ciprofloxacin，CIP)，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)、慶大霉素(gentamicin，GEN)、卡那霉素(kanamycin，KAN)、萘啶酸(nalidixic acid，NAL)、四環(huán)素(tetracycline，TET)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磷霉素(fosfomycin，F(xiàn)OS)，購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司；氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)FL)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 大腸桿菌的分離鑒定

從采樣管中吸取1 mL糞便樣品加入5 mL LB肉湯中，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18 h，接種于麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)18～20 h后挑選邊緣整齊圓潤(rùn)的粉紅色單菌落，每個(gè)樣本挑選一株，采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行鑒定。采用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[7]擴(kuò)增16S rDNA，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 465 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成。隨機(jī)挑選幾株生化鑒定后的大腸桿菌，PCR擴(kuò)增后測(cè)序，比對(duì)驗(yàn)證結(jié)果。

1.4 藥敏試驗(yàn)

選擇大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌，采用瓊脂稀釋法(CLSI，2015，M100-S25)檢測(cè)大腸桿菌對(duì)COL、KAN、GEN、AMK、APR、CTX、CTF、AMP、FFL、NAL、CIP、ENR、CAZ、AMX、TET、SPE、STR、FOS共18種抗菌藥的敏感性。

(1)菌株準(zhǔn)備:將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922和試驗(yàn)菌株接種于MH瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～20 h后挑取單菌落接種于MH肉湯。(2)藥物稀釋:在一次性培養(yǎng)皿上標(biāo)注好藥物名稱及稀釋濃度，梯度稀釋藥物至相應(yīng)濃度并使終體積為1 mL。(3)含藥培養(yǎng)基的制備:19 mL MH瓊脂加入含藥培養(yǎng)皿(磷霉素含藥培養(yǎng)皿每毫升瓊脂中加入25 μL 6-磷酸葡萄糖)，輕輕晃勻后放置凝固晾干；以不含藥瓊脂板作為空白對(duì)照。(4)菌液的接種:吸取50 μL菌液加入5 mL MH肉湯中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)4 h。96孔板中每孔加入247.5 μL MH肉湯和2.5 μL菌液(ATCC 25922為對(duì)照)。用滅菌印章蘸取菌液至含藥瓊脂板上，靜置，待菌液完全吸收后，37℃培養(yǎng)18 h左右。(5)結(jié)果判讀:統(tǒng)計(jì)各藥物的MIC值，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5 blaCTX-M耐藥基因的檢測(cè)

采取 水 煮 法 提 取DNA。合 成blaCTX-M、blaCTX-M-1G、blaCTX-M-9G耐藥基因引物序列參考Liu[8]、Bri?as[9]等。反應(yīng)體系(15 μL):ddH2O 10.55 μL，10×PCR Buffer 1.5 μL，dNTP 1.2 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq酶0.15 μL，模板DNA 1μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，凝膠成像儀觀察并保存。

1.6 攜帶blaCTX-M基因大腸桿菌的接合試驗(yàn)

(1)供體菌(blaCTX-M陽(yáng)性大腸桿菌)和受體菌(C600)分別于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，37℃搖床振蕩培養(yǎng)4～6 h。(2)取100 μL受體菌和供體菌分別加到3 mL LB肉湯中，受體菌37℃搖床振蕩培養(yǎng)4～4.5 h，供體菌培養(yǎng)3～3.5 h，供受體菌1∶4混合，恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)6 h左右。(3)混合菌液5 000 r/min離心4 min，棄上清，每管加0.5 mL高壓滅菌生理鹽水。(4)吸取100 μL菌液于 聯(lián) 合 藥 板(CTX:2 μg/mL，STR:1 000μg/mL)上，均勻涂布至干澀，靜置30 min至1 h，37℃培養(yǎng)20 h左右。(5)疑似接合子純化后，PCR鑒定，挑取blaCTX-M陽(yáng)性接合子。(6)藥敏試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)是否接合成功。30%甘油肉湯保菌，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 接合子復(fù)制子分型

參考Carattoli[10]、Chen[11]、Johnson[12]等的方法進(jìn)行質(zhì)粒分型，具體引物序列及片段大小見表1。

表1 質(zhì)粒復(fù)制子分型的引物序列

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞源大腸桿菌的分離與鑒定

本研究采集樣本數(shù)為320份，為探究同一樣本分離的不同菌株是否存在同一克隆，濟(jì)南、德州地區(qū)每份樣品分離兩株大腸桿菌，經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基篩選及細(xì)菌微量生化鑒定，共獲得440株大腸桿菌，樣本分離率為100%。分離得到142株攜帶blaCTX-M基因的大腸桿菌，檢出率為32.3%。其中含blaCTX-M-9G基 因 的 有89株(20.2%)，含blaCTX-M-1G基因的有62株(14.1%，表2)。

表2 耐藥基因型攜帶情況

2.2 不同地區(qū)攜帶blaCTX-M基因大腸桿菌的分型情況

如圖1所示，青島、濰坊、日照、德州樣品中blaCTX-M-9G的檢出率分別為13.40%、5.63%、2.11%、22.50%，blaCTX-M-1G的 檢 出 率 分 別 為7.75%、13.40%、1.41%、39.40%。德州樣品中blaCTX-M-9G、blaCTX-M-1G的檢出率均最高。濟(jì)南樣品中均未檢測(cè)出blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G。本試驗(yàn)并未檢測(cè)出其他blaCTX-M型ESBLs編碼基因。

圖1 各地區(qū)blaCTX-M基因型檢出情況

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，β-內(nèi)酰胺耐藥基因blaCTX-M耐藥菌株對(duì)氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、四環(huán)素(TET)耐藥率較高，達(dá)90%以上；對(duì)頭孢菌素類藥物[頭孢噻呋(CTF)和頭孢噻肟(CTX)]的耐藥率分別為86.6%、85.9%；對(duì)喹諾酮類藥物[萘啶酸(NAL)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)]的耐藥率分別為86.6%、83.1%、73.2%；對(duì)氨基糖苷類藥物[卡那霉素(KAN)、慶大霉素(GEN)、大觀霉素(SPE)、安普霉素(APR)]的耐藥率分別為68.3%、59.9%、55.6%、52.1%；對(duì)氟苯尼考(FFL)的耐藥率達(dá)82.4%；對(duì)多粘菌素(COL，30.3%)、頭孢他啶(CAZ，31.7%)、磷霉素(FOS，50.7%)均表現(xiàn)出較高耐藥性；對(duì)阿米卡星(AMK)的耐藥率最低，僅為2.8%。

表3 142株blaCTX-M陽(yáng)性大腸桿菌對(duì)18種常用抗菌藥的耐藥率

2.4 接合試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)PCR鑒定，條帶為540 bp可初步判定接合轉(zhuǎn)移成功(圖2)。142株攜帶blaCTX-M基因的菌株中，有139株接合成功，接合率為97.9%。

圖2 blaCTX-M基因型接合子PCR鑒定

2.5 blaCTX-M接合子藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，blaCTX-M陽(yáng)性大腸桿菌接合子對(duì)頭孢菌素類[頭孢噻呋(CTF)、頭孢噻肟(CTX)、鏈霉素(STR)]全部耐藥；對(duì)氨基糖苷類[慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、安普霉素(APR)、大觀霉素(SPE)]、喹諾酮類[萘啶酸(NAL)、恩諾沙星(ENR)]、青霉素類[阿莫西林(AMX)、氨芐西林(AMP)]、多粘菌素(COL)、四環(huán)素(TET)、磷霉素(FOS)、氟苯尼考(FFL)的耐藥率介于0.72%～15.11%之間；對(duì)阿米卡星(AMK)、頭孢他啶(CAZ)、環(huán)丙沙星(CIP)不耐藥。接合子耐藥率較供體菌菌株顯著降低。

表4 139株攜帶blaCTX-M基因接合子的耐藥情況

2.6 blaCTX-M接合子復(fù)制子分型結(jié)果

為追蹤具有耐藥性的質(zhì)粒在流行病學(xué)上的重要性，對(duì)腸桿菌科主要質(zhì)粒不親和性組的復(fù)制子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別識(shí)別FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F、FIIA、IncI2、IncX3和IncX4型，來(lái)追蹤特異性耐藥質(zhì)粒在不同環(huán)境下的擴(kuò)散。試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，在blaCTX-M陽(yáng)性接合子復(fù)制子分型中，F(xiàn)型質(zhì)粒占比最高，為82.0%。僅個(gè)別菌株質(zhì)粒型為HI2、I1、B/O、N、FIA、FIB型。因此，F(xiàn)型為攜帶blaCTX-M基因大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒類型，可以促進(jìn)耐藥基因的水平傳播。

表5 blaCTX-M陽(yáng)性接合子復(fù)制子分型

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌(Escherichia coli)又名大腸埃希氏菌，20世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出病原性，大腸桿菌中一些特殊血清型的菌株會(huì)致使人和動(dòng)物患嚴(yán)重腹瀉甚至敗血癥。目前，大腸桿菌感染通常使用抗菌素治療，臨床治療對(duì)抗生素的依賴性以及抗生素使用的不規(guī)范性，導(dǎo)致耐藥情況日趨嚴(yán)峻，加大了疾病防控難度[13]。本試驗(yàn)對(duì)山東地區(qū)5個(gè)蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便樣品進(jìn)行分離鑒定，獲得了440株蛋雞源大腸桿菌，樣品分離率達(dá)100%。本試驗(yàn)結(jié)果高于張召興等[14]2018—2019年對(duì)河北地區(qū)蛋雞源病料組織的分離率(69.4%)；與李貴蕭等[15]對(duì)山東聊城活禽市場(chǎng)雞糞源大腸桿菌的分離率(100%)一致。

我國(guó)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中流行的主要基因型是blaCTX-M[16]。本研究中，山東地區(qū)blaCTX-M基因型攜帶率為32.3%。楊承霖等[17]在對(duì)四川省食品動(dòng)物源大腸桿菌的研究中，blaCTX-M基因檢出率為27.7%，可見不同地區(qū)、不同時(shí)間blaCTX-M基因的攜帶情況存在一定差異。楊守深等[6]研究表明，閩南地區(qū)大腸桿菌blaCTX-M-9G基因型的攜帶率為19.4%，與本試驗(yàn)結(jié)果(20.2%)相差不大。

抗生素大量廣泛的使用使大腸桿菌總體耐藥情況較為嚴(yán)重。其中氨芐西林、四環(huán)素耐藥率達(dá)90%以上，與傅學(xué)聰[18]得出的禽蛋表面耐藥菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率(98.7%～99.6%)相近；邵志勇等[19]研究結(jié)果表明氨芐西林耐藥率達(dá)100%。本研究中阿莫西林耐藥率為95.8%，與李蘊(yùn)玉等[20]報(bào)道的阿莫西林耐藥率相近。本研究中對(duì)頭孢菌素類藥物耐藥率為31.7%～86.6%，宋立等[21]2005年報(bào)道的頭孢菌素類藥物耐藥率僅為0～19.5%；李赫[22]2013年報(bào)道的遼寧省盤錦地區(qū)動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)頭孢菌素類藥物耐藥率已經(jīng)升高到37%～52%；王慧真等[23]2018年報(bào)道的河北地區(qū)雞源大腸桿菌對(duì)頭孢菌素類藥物耐藥率為41%～70%。從2005年開始頭孢菌素類藥物耐藥性急劇上升，與我國(guó)從2005開始產(chǎn)ESBLs分離株檢出率升高的情況相對(duì)應(yīng)。綜合來(lái)看，blaCTX-M基因型的存在與頭孢菌素類藥物耐藥情況密切相關(guān)。

質(zhì)粒能夠增加細(xì)菌的遺傳多樣性，并可以通過(guò)接合在細(xì)菌群體之間進(jìn)行水平交換[24]。質(zhì)粒同時(shí)可能攜帶控制抗菌耐藥性必需的基因或其他附屬基因[25]。質(zhì)粒分型有助于了解基因在菌株間水平轉(zhuǎn)移過(guò)程，這對(duì)于掌握質(zhì)粒在菌株間的傳播路徑具有重要價(jià)值。本研究通過(guò)21對(duì)復(fù)制子引物的PCR擴(kuò)增，對(duì)139株blaCTX-M陽(yáng)性接合子進(jìn)行復(fù)制子分型。其中，blaCTX-M陽(yáng)性菌株接合子復(fù)制子分型主要為F型，占82.0%，與趙世玉[26]對(duì)多重耐藥大腸桿菌blaCTX-M基因擴(kuò)散機(jī)制研究結(jié)果一致。Sunde等[27]的研究發(fā)現(xiàn)所有分離株都含有F型質(zhì)粒，大多數(shù)菌株都含有可自我移動(dòng)的質(zhì)粒。山東地區(qū)蛋雞源blaCTX-M基因陽(yáng)性大腸桿菌通過(guò)質(zhì)粒水平傳播，造成blaCTX-M基因的攜帶率不斷提高，促使耐藥大腸桿菌的流行率進(jìn)一步升高。

山東地區(qū)攜帶blaCTX-M基因的蛋雞源大腸桿菌檢出率較高，耐藥情況較為嚴(yán)重，耐藥基因可通過(guò)水平轉(zhuǎn)移在細(xì)菌之間傳播，造成多藥耐藥，也可通過(guò)食物鏈傳播給人類或其他動(dòng)物，為醫(yī)療和公共衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。對(duì)此我們需更加嚴(yán)密的監(jiān)控?cái)y帶blaCTX-M基因的大腸桿菌的流行情況。本研究可對(duì)蛋雞源耐藥大腸桿菌的流行情況、傳播機(jī)制以及抗生素的合理應(yīng)用提供一定的參考。