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(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟南 250100；2.山東省家禽育種工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250100；3.山東益嘉種禽有限公司，山東 臨沂 276000)

鹽皮質(zhì)激素受體(MR，NR3C2)是核受體超家族的一員，該超家族是一類配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，在多細(xì)胞生物中是含量最豐富的幾大類轉(zhuǎn)錄因子超家族之一[1]。核受體的一般途徑為配體與相應(yīng)核受體結(jié)合誘導(dǎo)受體的二聚化并增強其與特定DNA序列的結(jié)合[2]，從而激活或抑制下游基因的表達(dá)。NR3C2基因的表達(dá)范圍很廣，在腎臟極化的緊密上皮、人類和鼠的大腸、氣道、汗腺、唾液腺、肝臟、內(nèi)皮的上皮組織[3]、脂肪組織[4]及單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、番鴨的肝、腎、腦、腿、膽和胸[5]中均有表達(dá)。NR3C2分布的廣泛性揭示了其功能的多樣性，目前研究最多的是與人類疫病相關(guān)的功能，比如腎細(xì)胞癌[6]、胰腺癌[7]、肝癌[8]等腫瘤發(fā)生、高血壓[9]、1型假性醛固酮減少癥[10]、高原肺水腫[11]、慢性中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變[12]等。此外NR3C2還被發(fā)現(xiàn)與人的行為異常[13]及精神分裂[14，15]等有關(guān)，近來也有研究表明NR3C2參與脂類代謝，在脂肪性肥胖[16]中發(fā)揮作用。在動物中的研究表明，NR3C2的表達(dá)水平在番鴨不同行為狀態(tài)下存在差異[5]；其單核苷酸變異與豬的肥胖相關(guān)[17]；對內(nèi)洛爾牛進(jìn)行研究表明，其單倍型與肉色、烹飪損失、肌肉糖原含量和血漿促腎上腺皮質(zhì)激素濃度等肉質(zhì)性狀相關(guān)[18]；在雞上目前未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)研究報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NR3C2基因在雞卵巢顆粒細(xì)胞中高表達(dá)(未發(fā)表)，因此猜測該基因在雞繁殖性能中可能發(fā)揮重要作用。

雞NR3C2基因位于4號染色體，共有8個外顯子組成，編碼981個氨基酸。本研究以山東地方雞種和高產(chǎn)蛋雞為素材，采用直接測序和PCRRFLP技術(shù)對該基因進(jìn)行SNP掃描，分析多態(tài)位點與雞繁殖性狀的相關(guān)性，以期挖掘該基因與山東地方雞繁殖性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記，為地方雞種遺傳改良和創(chuàng)新利用奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

濟寧百日雞396只、汶上蘆花雞522只、萊蕪黑雞392只、海蘭褐蛋雞206只，均來自山東省地方雞品種資源活體基因庫。所有試驗群體均為同批入孵，飼養(yǎng)條件一致，隨機采樣，翅靜脈采血，ACD抗凝，-20℃保存。采用常規(guī)酚/氯仿法提取雞血液DNA。萊蕪黑雞單籠飼養(yǎng)，專人負(fù)責(zé)個體產(chǎn)蛋記錄。

1.2 突變位點及引物信息

根據(jù)雞NR3C2基因(GenBank登錄號NC_052535)的DNA序列，設(shè)計1對引物，引物序列為F:5′-AGACAGACAGGGATAG-3′，R:5′-GAGGACACTGAGTTAA-3′，擴增目的片段長度771 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 PCR擴增與PCR-RFLP分析

PCR反應(yīng)體系(15 μL):2×TaqPCR MasterMix 7.5 μL，ddH2O 5.6 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.45 μL，基因組DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR擴增程序:94℃3 min；94℃30 s，48.1℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃4 min。

PCR-RFLP反應(yīng)體系(15 μL):TaqⅠ(10U/μL)0.5 μL，10×BufferTaqⅠ1 μL，PCR產(chǎn)物8 μL，ddH2O 5.5 μL，65℃水浴過夜。

酶切產(chǎn)物檢測:120 V、1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，分析酶切產(chǎn)物基因型。

1.4 序列分析

每個基因型取兩個不同個體的PCR產(chǎn)物于濟南力戈科技有限公司進(jìn)行克隆測序。

1.5 關(guān)聯(lián)分析

采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件包的GLM程序進(jìn)行基因型與性狀(產(chǎn)蛋數(shù)、開產(chǎn)日齡)的關(guān)聯(lián)分析。統(tǒng)計分析模型為yi＝μ+Gi+ei，其中yi代表性狀表型值，μ為性狀群體均值，Gi代表基因型效應(yīng)值，ei為隨機殘差。

不同基因型間的比較分析用最小二乘法，試驗數(shù)據(jù)用最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(LSM±SE)表示，顯著水平設(shè)定P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型判定

由圖1可知，NR3C2基因3 714多態(tài)位點經(jīng)TaqⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后在山東省3個地方雞種和引進(jìn)高產(chǎn)品種中均表現(xiàn)出3種基因型:GG(417、51、303 bp)，AA(468、303 bp)和GA(468、417、303、51 bp)。

圖1 雞NR3C2基因3 714多態(tài)位點酶切結(jié)果

2.2 序列分析

測序結(jié)果表明(圖2)，雞NR3C2基因3 714位點是一個G→A的突變，該突變位點位于外顯子1內(nèi)，包含TaqⅠ限制性內(nèi)切酶的識別序列“T/CGA”，其中“G”不發(fā)生突變即“T/CGA”類型記做“GG”；“G”突變?yōu)椤癆”，即“T/CAA”類型記做“AA”；GA為雜合型。

圖2 雞NR3C2基因3 714多態(tài)位點的序列分析(反向測序)

2.3 NR3C2基因3 714多態(tài)位點等位基因和基因型頻率分布

3 714位點在濟寧百日雞、汶上蘆花雞和萊蕪黑雞3個地方雞種中的優(yōu)勢基因型均為雜合型GA，頻率約為50.00%，等位基因A和G的頻率也接近平均分布。在高產(chǎn)蛋雞海蘭褐中的優(yōu)勢基因型為純合型GG，頻率為88.84%，優(yōu)勢等位基因G頻率為93.93%(表1)。

表1 NR3C2基因3 714多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率

2.4 NR3C2基因3 714多態(tài)位點與產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)分析

在392只萊蕪黑雞群體中，對NR3C2基因3 714位點與4個繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和多重比較，結(jié)果見表2。

表2 NR3C2基因3 714多態(tài)位點各基因型與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

3 714位點與43W產(chǎn)蛋量(P＝0.0467)、44W產(chǎn)蛋量(P＝0.0486)和45W產(chǎn)蛋量(P＝0.0499)均顯著相關(guān)。基因型GG個體的最大產(chǎn)蛋量與基因型GA個體間差異顯著(P＜0.05)，而且該基因型在開產(chǎn)日齡性狀上也表現(xiàn)出優(yōu)勢，GG基因型個體的開產(chǎn)日齡最早，比GA基因型個體平均早1.17 d。

3 討論與結(jié)論

鹽皮質(zhì)激素受體基因功能非常廣泛[3]，不僅維持水鈉平衡，還與心血管重構(gòu)、行為認(rèn)知、脂肪代謝、腦缺血再灌注腦損傷[19]、認(rèn)知障礙[20]、產(chǎn)后抑郁癥[21]等病理生理反應(yīng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)雞NR3C2基因3 714位點GG基因型在低繁殖力的3個山東省地方雞種中表現(xiàn)為劣勢基因型，而在高產(chǎn)蛋雞海蘭褐中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，頻率高達(dá)88.84%，等位基因G頻率高達(dá)93.93%。濟寧百日雞、汶上蘆花雞和萊蕪黑雞均為山東省地方雞種，與國外高產(chǎn)蛋雞品種相比，繁殖力較低，這也是制約地方雞種創(chuàng)新利用的瓶頸因素，而海蘭褐蛋雞是經(jīng)過長期選擇形成的商業(yè)化品系，近年來，基因組育種在其品系育成過程中更是發(fā)揮了重要作用，有益基因經(jīng)過選育在群體內(nèi)大量聚合，因此，結(jié)合品種特點初步推測GG基因型可能與高產(chǎn)蛋性狀有關(guān)。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果也表明該位點與萊蕪黑雞多個時期的產(chǎn)蛋量存在顯著相關(guān)，GG基因型個體在開產(chǎn)日齡、43W產(chǎn)蛋量、44W產(chǎn)蛋量和45W產(chǎn)蛋量性狀中均表現(xiàn)最優(yōu)，且在其中3個性狀上與GA基因型個體間差異顯著，可以推斷GG型與高繁殖性能相關(guān)，可以用于地方雞種的育種。在地方雞種選育過程中，可選擇GG型個體留種，不但可以將開產(chǎn)日齡提前，還能提高總產(chǎn)蛋量，極大提升地方雞種的繁殖性能，促進(jìn)地方雞種的創(chuàng)新利用，提高經(jīng)濟效益。

本研究采用PCR-RFLP方法在汶上蘆花雞、濟寧百日雞、萊蕪黑雞和海蘭褐中檢測到NR3C2基因3 714 nt處發(fā)生點突變G→A，基因型GG在3個地方雞種中表現(xiàn)為劣勢基因型，而在高產(chǎn)蛋雞海蘭褐中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明3 714位點對43W產(chǎn)蛋量(P＝0.0467)、44W產(chǎn)蛋量(P＝0.0486)和45W產(chǎn)蛋量(P＝0.0499)均表現(xiàn)出顯著相關(guān)，且GG基因型個體的開產(chǎn)日齡也最早，比GA基因型個體平均早1.17 d。GG基因型可以作為地方雞種繁殖性狀的分子標(biāo)記。