張林亞，徐然，周旭，楊文震，朱為

1. 上海生物制品研究所有限責任公司研發(fā)部第三研究室，上海 200051； 2. 上海生物制品研究所有限責任公司，上海 201400

麻疹是由麻疹病毒(measles virus，MV)引起的一種急性呼吸道傳染性疾病，通過呼吸道分泌物傳播，好發(fā)于兒童，多見于冬春季，人群普遍易感。2019年，全球麻疹病例激增至 869 770 例，創(chuàng)23年來最高紀錄；死亡人數超過 207 500 例，較2016年上升了50%[1]。預防麻疹的最有效手段是接種麻疹減毒活疫苗，而麻疹減毒活疫苗生產用細胞基質為原代雞胚細胞。2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)規(guī)定，原代細胞經原始培養(yǎng)或傳代少數幾代內(一般不超過5代)的細胞可用于病毒性疫苗的生產[2]。原代雞胚細胞在原代培養(yǎng)及早期傳代培養(yǎng)過程中成纖維細胞和上皮細胞同時出現，利用成纖維細胞和上皮細胞對胰蛋白酶的耐受性差異，將原代雞胚細胞進行傳代培養(yǎng)，可達到純化成纖維細胞的目的，提高疫苗用細胞基質的均一性[3]。另外，將原代雞胚細胞進行傳代可增加細胞外源因子的檢測次數，提高外源病毒的檢出率[4]，有利于實現對疫苗安全性的控制。

本研究將原代雞胚細胞進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，采用不同代次雞胚細胞培養(yǎng)麻疹病毒滬191(Shanghai-191，S-191)株，并對病毒收獲物進行滴度檢測和基因序列測定，為傳代培養(yǎng)的雞胚細胞用于病毒性疫苗生產提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞MRC-5細胞(人胚肺成纖維細胞)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，A549細胞(人非小細胞肺癌細胞)由上海生物制品研究所有限責任公司保存。

1.1.2 毒種麻疹病毒S-191株由上海生物制品研究所有限責任公司第三研究室保存。

1.1.3 實驗動物無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雞胚蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-002；4～6周齡BALB/c雌性裸鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2014-0016。

1.1.4 主要試劑及儀器M199培養(yǎng)液、青-鏈霉素、臺盼藍和0.25%胰蛋白酶均購自Gibco公司(美國)；新生牛血清購自上海慧人生物科技工程研究所；歐氏液由上海生物制品研究所有限責任公司提供；0.1%苯扎溴銨購自上海運佳黃浦制藥有限公司；RNA抽提試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0及反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMII 1 st Strand cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa公司(日本)。Countstar自動細胞計數儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀購自Eppendorf公司(德國)。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)取9～11日齡SPF級雞胚蛋，用0.1%苯扎溴銨消毒后，取出雞胚，斷頸去頭，刮除內臟，收獲軀干部，用胰蛋白酶消化，制備成細胞懸液，接種至細胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%體積分數CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 傳代培養(yǎng)待原代雞胚細胞長至致密單層，用胰蛋白酶消化分散，進行傳代培養(yǎng)。將原代細胞代次記為P0，傳代1次后記為P1，依此類推。P0傳代比率為1∶4，P1～P9傳代比率為 1∶2。用自動細胞計數儀測定3批次傳代培養(yǎng)細胞的收獲數量，計算群體倍增水平(population doubling level，PDL)。

1.2.3 細胞增殖動力學分別將P3、P5和P10共3個代次的雞胚細胞密度調整至(2.0±0.5)×105個/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每隔24 h取樣并計數，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 細胞凍存及復蘇后傳代P1代次雞胚細胞長至致密單層后，收獲P1代次細胞并凍存，采用臺盼藍拒染法測定細胞凍存前及復蘇后的活率，并將復蘇后的細胞按照1∶2的傳代比率進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，用自動細胞計數儀測定各代次細胞的收獲數量，計算PDL。

1.2.5 細胞染色體檢查參照2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)中關于染色體檢查的要求，采用G顯帶技術，對P5代次雞胚細胞進行染色體檢查和核型分析。

1.2.6 細胞成瘤性檢查參照2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)中關于成瘤性檢查的要求，用4～6周齡BALB/c雌性裸鼠對P8代次雞胚細胞進行成瘤性檢查。同時設立A549細胞作為陽性對照，MRC-5細胞作為陰性對照。

1.2.7 病毒培養(yǎng)將麻疹病毒S-191株毒種按照感染復數(multiplicity of infection，MOI)為0.02～0.2分別接種至P0、P3和P5代次雞胚細胞進行培養(yǎng)，每隔24 h收獲病毒。采用半數細胞培養(yǎng)感染量(50% cell culture infective dose，CCID50)法檢測3批次病毒收獲液的滴度，繪制病毒增殖曲線，比較不同代次雞胚細胞的產毒水平。

1.2.8 病毒基因序列測定根據美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立的DNA序列數據庫GenBank中錄入的麻疹病毒S-191株(登錄號：FJ416067.1)的基因序列，分別針對編碼病毒核蛋白(nucleoprotein，N)的基因序列(位于108～1 685，共 1 578 bp)和血凝素蛋白(hemagglutinin，H)的基因序列(位于 7 271～9 124，共 1 854 bp)設計引物，引物序列如表1所示。對 P0、P3和P5代次雞胚細胞培養(yǎng)的麻疹病毒的N基因和H基因進行PCR擴增，擴增產物送至BioSune公司進行Sanger法測序。

表1 N、H基因PCR擴增及序列測定引物

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22. 0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用配對 t 檢驗進行病毒滴度比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)

將 P0代次雞胚細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至P10代次，在顯微鏡下觀察各代次的細胞形態(tài)。P0代次多數為成纖維狀細胞，混雜有少量上皮細胞及少部分因消化不完全形成的細胞團塊(見圖1A)。經過傳代篩選，細胞均一性趨于良好，形態(tài)飽滿、修長，呈紡錘狀整齊排列(見圖1B、1C)。

A: P0 chicken embryo cells. B: P5 chicken embryo cells. C: P10 chicken embryo cells.

2.2 細胞增殖動力學

將P3、P5和P10代次雞胚細胞接種至24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每隔24 h計數，繪制生長曲線。3個代次的雞胚細胞生長趨勢相似，整體呈“S”形，第4天達到平臺期，平臺期的細胞數為(5.0～6.0)×105個/mL(見圖2)。

圖2 不同代次雞胚細胞生長曲線

2.3 細胞傳代培養(yǎng)

將P1代次雞胚細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至P10代次，3 d左右可長至致密單層，各代次平均細胞收獲數量為(4.85±0.31)×105個/mL，平均PDL為0.98±0.05(見圖3)。

圖3 不同代次雞胚細胞的收獲數量和PDL

2.4 細胞的凍存及復蘇后傳代培養(yǎng)

將P1代次雞胚細胞凍存，復蘇后進行連續(xù)傳代培養(yǎng)。臺盼藍拒染法測定細胞凍存前活率為93.76%～97.09%，復蘇后活率為91.56%～95.97%。復蘇后傳代培養(yǎng)的各代次平均細胞收獲數量為(4.76±0.30)×105個/mL，平均PDL為0.96±0.07(見圖4)。

圖4 凍存復蘇后傳代培養(yǎng)的雞胚細胞的收獲數量和PDL

2.5 細胞染色體檢查

采用G顯帶技術對P5代次雞胚細胞進行染色體檢查，結果為正常染色體核型，染色體數目78條，包括9對大染色體和30對微小染色體，大染色體中未發(fā)現染色體缺失及多倍體等異常染色體(見圖5)。

圖5 P5代次雞胚細胞染色體核型

2.6 細胞成瘤性檢查

對P8代次雞胚細胞進行成瘤性檢查，結果顯示實驗組(P8代次雞胚細胞)注射部位組織病理切片正常，無腫瘤樣細胞。陽性對照組(A549細胞)于第7天注射部位全部出現結節(jié)，組織病理學檢查為腫瘤細胞。陰性對照組(MRC-5細胞)注射部位未見結節(jié)形成，組織病理學檢查無腫瘤樣細胞(見圖6)。

A: A549 cells. B: MRC-5 cells. C: Chicken embryo cells.

2.7 麻疹病毒在不同代次雞胚細胞中的增殖

將麻疹病毒S-191株毒種分別接種P0、P3和P5代次雞胚細胞，測定病毒收獲液滴度，結果顯示病毒在3個代次雞胚細胞中的增殖趨勢相似(見圖7)。P0代次雞胚細胞病毒收獲液滴度為(5.87±0.21)lgCCID50/mL；P3代次雞胚細胞病毒收獲液滴度為(6.03±0.15)lgCCID50/mL，高于P0代次雞胚細胞，但無顯著性差異(P>0.05)；P5代次雞胚細胞病毒收獲液滴度為(6.00±0.10)lgCCID50/mL，高于P0代次雞胚細胞，但無顯著性差異(P>0.05)(見圖8)。

圖7 麻疹病毒在不同代次雞胚細胞中的增殖曲線

圖8 麻疹病毒在不同代次雞胚細胞中的產毒水平

2.8 麻疹病毒基因序列測定

對 P0、P3和P5代次雞胚細胞培養(yǎng)的麻疹病毒分別進行N和H基因序列測定，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示條帶N1(900 bp)、N2(1 000 bp)、H1(1 000 bp)、H2(1 200 bp)與理論值N1(902 bp)、N2(995 bp)、H1(992 bp)、H2(1 179 bp)大小相符(見圖9、10)?；驕y序結果顯示，3個代次雞胚細胞培養(yǎng)的麻疹病毒N、H基因序列與S-191株毒種完全一致，未發(fā)生變異。

圖9 麻疹病毒N基因PCR產物電泳圖

圖10 麻疹病毒H基因PCR產物電泳圖

3 討論

原代雞胚細胞可用于多種病毒性疫苗的生產，如麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、狂犬病疫苗、黃熱病疫苗、新城疫疫苗、流感疫苗等[5-8]。原代雞胚細胞獲取容易，對病毒具有廣泛的敏感性，但其也存在固有缺點，如對供體動物需求量大，成本高，制備耗時費力，易污染外源病毒等。原代雞胚細胞傳代5代內可用于病毒性疫苗的生產[2]。

本研究在雞胚細胞原代培養(yǎng)的基礎上，建立了雞胚細胞的傳代培養(yǎng)方法，可將雞胚細胞穩(wěn)定傳至第10代，細胞均一性趨于良好，各代次細胞生長趨勢相似。將第1代雞胚細胞凍存復蘇后進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，可穩(wěn)定傳至第5代，初步為雞胚細胞建庫奠定了基礎。染色體檢查結果顯示，第5代雞胚細胞為正常染色體核型，染色體數目以及9對大染色體結構保持不變，為傳代雞胚細胞用于疫苗生產提供了遺傳穩(wěn)定性數據。但30對微小染色體過于微小，無法進行染色體結構分析。對傳代培養(yǎng)的第8代雞胚細胞進行成瘤性檢查，未見成瘤，表明傳代雞胚細胞安全性良好。將麻疹病毒接種原代、第3代和第5代雞胚細胞，傳代培養(yǎng)的雞胚細胞與原代雞胚細胞的產毒水平無顯著性差異，收獲的病毒經N、H基因測序，發(fā)現基因序列未發(fā)生改變，為傳代培養(yǎng)雞胚細胞替代原代雞胚或原代雞胚細胞生產其他病毒性疫苗提供了數據支撐。

與原代雞胚細胞生產病毒性疫苗相比，傳代培養(yǎng)的雞胚細胞具有明顯的優(yōu)勢。①節(jié)約原代雞胚的使用量，顯著提高了雞胚的利用率，降低生產成本和醫(yī)療廢棄物處理成本。如果使用傳至5代的雞胚細胞，細胞數量至少可擴大30倍，可顯著提高雞胚的疫苗產量。②雞胚細胞經過傳代培養(yǎng)，細胞均一性增加，可避免因來自不同動物個體而造成的細胞質量和敏感性差異[9]，從而提高了疫苗生產用細胞基質的均一性和穩(wěn)定性。③采用傳代培養(yǎng)的雞胚細胞制備病毒性疫苗無須頻繁從雞胚中制備細胞，不僅可降低由細胞制備程序繁瑣費時帶來的污染風險，還可降低雞胚本身可能帶來的潛在外源因子污染風險，從而提高了疫苗用細胞基質的安全性。原代雞胚細胞來源于SPF級雞胚，其安全性與終產品的安全性密切相關。外源因子污染是影響細胞基質安全性的一個重要因素，用于制備雞胚細胞的雞群須經過廣泛的外源性因子檢測[10]。美國Charles River Laboratories International, Inc.(CRL)公司是全球 SPF 級雞和雞胚的最大供應商，其監(jiān)測的病原微生物多達32種[11]，我國國家標準《SPF雞微生物學監(jiān)測總則(GB /T 17999. 1-2008)》中規(guī)定必須對19種病原體進行監(jiān)測[12 ]。本研究對購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司的SPF級雞胚進行了21種細菌和病毒檢測，包括禽流感病毒、馬立克病毒、新城疫病毒等。將雞胚細胞經過多次傳代培養(yǎng)，可增加外源因子的檢測次數，延長外源因子污染的觀察期，提高外源因子的檢出率，繼而降低外源因子污染細胞的概率，保證疫苗的安全性。

疫苗的大規(guī)模生產需要大量檢定合格、質量相同、持續(xù)穩(wěn)定的雞胚細胞，基于以上傳代培養(yǎng)的雞胚細胞生產病毒性疫苗的優(yōu)勢，傳代雞胚細胞比原代雞胚細胞更易實現疫苗的規(guī)?；a。因此，可考慮將原代雞胚細胞傳至5代內建立細胞庫，按照2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)中對細胞檢定項目的要求進行檢定，檢定合格后與細胞工廠、微載體、片狀載體、固定床等大規(guī)模生產技術結合[13-14]，用于病毒性疫苗生產?？傊脵z定合格的雞胚細胞庫和大規(guī)模培養(yǎng)技術生產疫苗，多批次的疫苗生產用細胞基質來源于同一細胞庫，不僅可減少不同批次雞胚的細胞質量差異，還可降低細胞外源因子污染的風險，同時可提高生產效率，為疫苗生產提供大量穩(wěn)定、均一、安全的細胞基質，有利于提高疫苗產量與質量。

然而，采用傳代雞胚細胞進行病毒疫苗生產仍然面臨較多挑戰(zhàn)。①傳代雞胚細胞的安全性有待進一步驗證，將雞胚細胞進行傳代培養(yǎng)后，其遺傳物質是否會改變，宿主細胞殘留蛋白(host cell protein，HCP)、宿主細胞殘留DNA是否會因傳代增加，尚不清楚。②雞胚細胞在大規(guī)模培養(yǎng)的介質中能否穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)介質的改變可能需要改變一系列培養(yǎng)條件才能滿足雞胚細胞的正常生長。如果細胞工廠通氣能力有限，常規(guī)實驗室中5% CO2的培養(yǎng)體系可能不再適用，須對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，研究出無需CO2環(huán)境的雞胚細胞培養(yǎng)方法。③采用傳代雞胚細胞生產其他病毒性疫苗，可能會對疫苗病毒的基因組和病毒的生物學特性產生影響。病毒能在雞胚細胞中增殖是因為細胞上有病毒受體。Brandt等[15 ]研究發(fā)現，雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)超強毒株無雞胚成纖維細胞受體，在其傳代致弱過程中，VP2基因的幾處核苷酸改變導致其細胞嗜性改變，致弱后的毒株可在雞胚成纖維細胞中增殖，但致弱毒株與雞胚細胞如何作用及病毒的雞胚細胞受體還未見相關報道。雞胚細胞cDNA文庫的成功構建，為篩選和研究雞胚成纖維細胞上的病毒受體及其細胞嗜性提供了理論基礎，也為研究其他適于雞胚細胞生長的病毒與雞胚細胞的相互作用奠定了基礎[16-17 ]。

本研究建立了原代雞胚細胞的傳代培養(yǎng)方法，傳代培養(yǎng)的第3、5代細胞擴增麻疹病毒的能力與原代細胞無顯著差異，且未觀察到病毒N、H基因序列的變異。然而，采用傳代雞胚細胞進行病毒擴增生產仍面臨諸多挑戰(zhàn)，本文結論對于采用傳代培養(yǎng)雞胚細胞替代原代雞胚或原代雞胚細胞進行病毒疫苗的擴增生產具有重要的參考價值。