低共熔溶劑協(xié)同酸性二氧六環(huán)預(yù)處理楊木及其酶水解特性的探究

徐春燕，熊鳳，陳德明，單玉蓉，張林，王揮

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410000；2.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410000； 3.湖南省木質(zhì)資源定向轉(zhuǎn)化國際聯(lián)合實驗室，湖南 長沙 410000)

木質(zhì)纖維是一種豐富的可再生資源，可通過酶的水解糖化進一步轉(zhuǎn)化為生物燃料和糖基化學(xué)品[1]。楊木作為一種速生豐產(chǎn)樹種，是一種極具潛力的生物質(zhì)能源[2]。但楊木中緊密的三維結(jié)構(gòu)阻礙了對纖維素的利用，因此需在水解之前對其進行一定的預(yù)處理[3-4]。

低共熔溶劑(DES)作為離子液體的一種相似溶劑，具有來源廣泛、易于回收、環(huán)境友好等優(yōu)點[5-8]。在1，4-二氧六環(huán)溶液中加入酸催化劑，H+可以裂解生物質(zhì)內(nèi)部的分子鍵，對生物質(zhì)預(yù)處理有著良好的效果[9]。本研究采用DES協(xié)同酸性二氧六環(huán)對楊木進行預(yù)處理，優(yōu)化了協(xié)同預(yù)處理楊木的工藝條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

楊木碎屑(80目)；纖維素酶(濾紙酶活為 50 FPU/g)，由白銀賽諾生物科技有限公司提供；氯化膽堿、1，4-二氧六環(huán)、乙酸、鹽酸均為分析純。

KF-20流水式粉碎機；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；760R恒溫搖床；Bruker D8 Advance X射線衍射儀；Thermo Scientific Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀；Zeiss Sigma 300掃描電鏡；TGA5500熱重分析儀；Thermo Scientific K-Alpha XPS能譜儀；LC-16C高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 氯化膽堿/乙酸DES的制備 常溫下分別稱取一定量的氯化膽堿和乙酸(氯化膽堿與乙酸的摩爾比為1∶2)于厚壁耐壓瓶中，密封的耐壓瓶，置于油浴鍋中，不斷攪拌，加熱至80 ℃，保溫2 h，直至形成混合均一的透明液體。冷卻至室溫后，放入真空干燥箱內(nèi)保存待用。

1.2.2 楊木預(yù)處理 250 mL三頸燒瓶中加入楊木5 g，濃度1%的HCl溶液，50 mL的DES溶液和 50 mL 的1，4-二氧六環(huán)溶液，混合均勻，磁力攪拌，油浴加熱，反應(yīng)儀器配備冷凝減壓裝置。在120 ℃反應(yīng) 80 min。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，真空抽濾，用無水乙醇與去離子水的混合溶液(1∶2體積比)洗滌，直至濾液澄清無色，干燥后封存于密封袋中備用。

濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分離回收液體；保存分離出DES后上層黏液部分，用于后續(xù)循環(huán)使用。

1.2.3 纖維素酶水解 分別稱取1 g楊木原料和預(yù)處理后的楊木殘渣于100 mL錐形瓶中，各加入50 mL的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)和纖維素酶(用量30 FPU/g)，搖勻，置于恒溫搖床中，在溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下酶解72 h。

1.3 分析測定

1.3.1 物料組分測定 參照美國可再生能源實驗室(NREL)的分析方法測定楊木原料和預(yù)處理后楊木殘渣中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量。固體得率、纖維素保留率、半纖維脫除率和木質(zhì)素脫除率分別按式(1)～式(4)計算。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中M1——預(yù)處理后殘渣質(zhì)量，g；

M0——預(yù)處理前物料質(zhì)量，g；

WC0、WH0和WL0——分別為預(yù)處理前物料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)，%；

WC1、WH1和WL1——分別為預(yù)處理后殘渣中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)，%。

1.3.2 糖含量測定 采用高效液相色譜儀分析酶水解液中葡萄糖含量，配備Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)。進樣量為20 μL，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為45 ℃，采用示差折光檢測器。葡萄糖水解得率按式(5)計算。

(5)

式中C——水解液中葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；

V——水解糖液體積，L；

M——原料質(zhì)量，g；

W——原料中纖維素質(zhì)量分數(shù)，%。

1.3.3 固形物的定性分析 通過X射線衍射(XRD)、紅外光譜(FTIR)、掃描電鏡(SEM)和熱重分析(TG)等方法，對楊木原料和最優(yōu)工藝條件下的預(yù)處理殘渣進行分析。

1.3.3.1 XRD分析 通過X射線衍射儀對預(yù)處理前后楊木進行分析，采用Cu靶，測定電壓為40 kV，電流40 mA，掃描范圍10～80°，掃描速率為 10 (°)/min。纖維素結(jié)晶度(CrI)根據(jù)式(6)計算。

(6)

式中I002——在002晶格處的衍射峰強度；

Iam——在無定型區(qū)背景衍射的散射強度。

1.3.3.2 FTIR分析 采用傅里葉變換紅外光譜儀對楊木和預(yù)處理殘渣進行表征，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.3.3 SEM分析 使用掃描電鏡對樣品形貌進行分析，操作電壓為2 kV。

1.3.3.4 TG分析 使用熱重分析儀分析樣品的熱穩(wěn)定性。在氮氣氣氛下，以升溫速率10 ℃/min從30 ℃升溫至800 ℃，觀察樣品質(zhì)量隨溫度的變化情況。

1.3.3.5 XPS分析 采用XPS能譜儀測試樣品的光電子能譜，工作電壓為12 kV，燈絲電流為6 mA。全譜掃描通能為100 eV，步長1 eV；窄譜掃描通能為50 eV，步長0.05 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理單因素實驗

2.1.1 鹽酸濃度對楊木組分及酶解得率的影響 結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸質(zhì)量分數(shù)對楊木預(yù)處理效果的影響Fig.1 Affect of HCl concentration on pretretment effect of poplar

由圖1可知，隨著鹽酸質(zhì)量分數(shù)的增大，半纖維素和木質(zhì)素的脫除率均呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。鹽酸質(zhì)量分數(shù)為1%時，半纖維素的脫除率達到70.27%，木質(zhì)素的脫除率達到50.64%。相對應(yīng)的，葡萄糖得率呈現(xiàn)出先緩慢上升后下降的趨勢，并在鹽酸質(zhì)量分數(shù)為1%時達到最大值。鹽酸在預(yù)處理的反應(yīng)中起到酸性催化劑的作用，H+可以裂解生物質(zhì)大分子中的木質(zhì)素、半纖維素和木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體，使得大量木質(zhì)素和纖維素溶解到反應(yīng)溶液中。這一過程解離了生物質(zhì)原料楊木的致密結(jié)構(gòu)，暴露了纖維素的活性位點，增加了纖維素酶可及的表面積，使纖維素酶的水解更高效[10]。

2.1.2 反應(yīng)溫度對楊木組分及酶解得率的影響 結(jié)果見圖2。

由圖2可知，預(yù)處理溫度對半纖維素和木質(zhì)素的脫除效率影響顯著。當(dāng)反應(yīng)溫度從60 ℃提高至140 ℃，木質(zhì)素脫除率由11.77%升至58.69%，半纖維素的脫除率更是由10.64%升至67.52%。表明適當(dāng)提高預(yù)處理溫度，對木質(zhì)素和半纖維素的脫除有著積極的促進作用。隨著預(yù)處理溫度的升高，葡萄糖得率呈現(xiàn)上升趨勢，在120 ℃條件下葡萄糖得率最高；溫度繼續(xù)升高，葡萄糖得率開始逐漸下降，這可能是由于過高的溫度會破壞楊木中纖維素的結(jié)構(gòu)，使纖維素含量減少[11]。

圖2 溫度對楊木預(yù)處理效果的影響Fig.2 Affect of temperature on pretreatment effect of poplar

2.1.3 反應(yīng)時間對楊木組分及酶解得率的影響 結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)時間對楊木預(yù)處理效果的影響Fig.3 Affect of reaction time on pretreatment effect of poplar

由圖3可知，隨著預(yù)處理時間的延長，半纖維素和木質(zhì)素的脫除率均呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢。在實驗范圍內(nèi)，纖維素的保留率一直保持在70%左右，表明該預(yù)處理方式未導(dǎo)致纖維素過多的損失。葡萄糖得率也隨著預(yù)處理時間的適當(dāng)延長而增加，在 80 min 時，葡萄糖得率達到最大值(64.15%)；溫度繼續(xù)升高，葡萄糖得率開始緩慢下降，這可能是由于隨著預(yù)處理時間的延長，反應(yīng)過程中溶出的木質(zhì)素在該溶劑體系中發(fā)生團聚，從而影響了纖維素酶的可及性，因而導(dǎo)致葡萄糖得率下降[12]。時間因素對葡萄糖得率的影響與纖維素保留率趨勢一致。

在一定范圍內(nèi)，溫度的升高和時間的延長對葡萄糖的得率有明顯的促進作用；但預(yù)處理溫度過高或預(yù)處理時間過長，葡萄糖得率開始減少。這主要是因為半纖維素是雜多糖，在一定條件下(高溫、高酸等)會發(fā)生二次水解，產(chǎn)生糠醛等抑制物，從而對纖維素酶的水解產(chǎn)生抑制作用[13]。

2.2 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗得出的最佳實驗條件，設(shè)計正交實驗對其進行進一步優(yōu)化，結(jié)果見表1。

由表1可知，協(xié)同預(yù)處理楊木的最優(yōu)實驗條件為A2B1C1，即鹽酸質(zhì)量分數(shù)1%，預(yù)處理溫度 110 ℃，預(yù)處理時間70 min。以該條件進行驗證實驗，結(jié)果見表2。

表1 協(xié)同預(yù)處理楊木正交實驗Table 1 Incomplete factorial experimental design of poplar with synergistic pretreatment

楊木酶水解葡萄糖得率達到了69.75%，纖維素保留率為73.66%，木質(zhì)素和半纖維素脫除率分別為48.71%和72.61%。

表2 不同預(yù)處理方法對楊木組分及葡萄糖得率的影響Table 2 Effects of different pretreatment methods on the components and glucose yield of poplar

由表2可知，原料楊木的酶水解得率20.68%，經(jīng)過DES單獨預(yù)處理楊木的葡萄糖得率為 29.24%，僅有較小幅度的提高。采用協(xié)同預(yù)處理，使纖維素酶解得率73.66%得到了大幅度的提升，葡萄糖得率達到了69.75%，表明該協(xié)同預(yù)處理是一種高效的預(yù)處理工藝。

2.3 協(xié)同預(yù)處理對樣品結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

2.3.1 XRD分析 對最佳工藝條件下預(yù)處理的楊木、經(jīng)過酶解之后的樣品和楊木原料進行XRD分析，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，所有樣品的衍射峰型相似，說明預(yù)處理以及酶水解未改變纖維素的晶型，只是導(dǎo)致了特征峰強度的變化。根據(jù)峰高法計算結(jié)晶度可得[14]，原料、預(yù)處理后和酶解后樣品結(jié)晶度分別為34.91%，60.08%和64.40%，預(yù)處理以及酶解后樣品的結(jié)晶度都有了大幅度升高。這說明預(yù)處理脫除了楊木中的部分木質(zhì)素和半纖維素，纖維素組分的含量相對增加，從而使預(yù)處理后的樣品結(jié)晶度增加[6]。經(jīng)過酶水解之后，纖維素結(jié)晶度增加到 64.40%，這是由于纖維素酶打破部分結(jié)晶區(qū)表面分子鏈的致密結(jié)構(gòu)，使得纖維素分子無序性增加，形成新的無定型區(qū)，因此纖維素結(jié)晶度隨著酶水解的進行而增加是合理的[15]。

圖4 不同樣品的XRD圖Fig.4 XRD patterns of samples a.楊木原料；b.預(yù)處理后樣品；c.酶解后樣品 I002是結(jié)晶區(qū)約在2θ=22.5°處峰的強度， Iam是無定型區(qū)域約在2θ=18.0°處峰的強度

2.3.2 FTIR分析 圖5是三種樣品的紅外光譜圖。

圖5 不同樣品的FTIR圖Fig.5 FTIR patterns of samples a.楊木原料；b.預(yù)處理后樣品；c.酶解后樣品

2.3.3 熱重(TG)分析 不同樣品的熱重分析結(jié)果見圖6。

由圖6可知，預(yù)處理及酶解過程會使原料的熱穩(wěn)定性發(fā)生改變。當(dāng)溫度<200 ℃時，主要是樣品內(nèi)部的水分蒸發(fā)，未發(fā)生明顯的熱失重變化。在200～400 ℃間，原料和預(yù)處理后的樣品開始迅速分解，此階段主要是纖維素和半纖維素的熱解。木質(zhì)素的熱降解始于400 ℃以后[17]。預(yù)處理后的樣品在380 ℃降解速率緩慢，且逐漸接近恒定質(zhì)量，固體殘留質(zhì)量高于相同溫度下原料對應(yīng)的殘留質(zhì)量。這是由于本實驗選用鹽酸作為酸性催化劑，反應(yīng)過程中容易使楊木原料發(fā)生碳化，所以最終的殘?zhí)己扛摺Ｃ附夂髽悠返臒崾е厍€發(fā)生了較為明顯的變化，說明酶水解顯著破壞了生物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。

圖6 不同樣品的TG圖Fig.6 TG patterns of samples a.楊木原料；b.預(yù)處理后樣品；c.酶解后樣品

2.3.4 SEM分析 預(yù)處理前后以及酶解后楊木的掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖7。

圖7 不同樣品的掃描電鏡圖Fig.7 SEM patterns of samples a.楊木原料；b.預(yù)處理后樣品；c.酶解后樣品

由圖7可知，楊木原料表面光滑，生物結(jié)構(gòu)排列整齊。經(jīng)過協(xié)同預(yù)處理后，楊木表面出現(xiàn)裂縫和碎片，表面變得粗糙。樣品表面變得更加疏松，使得更多的纖維素暴露在外，這能夠為后續(xù)的酶解反應(yīng)提供更多的反應(yīng)位點，增加了纖維素酶對楊木原料中纖維素的可及性[18]。值得注意的是，楊木表面出現(xiàn)的大量凹陷和裂痕在一定程度上提高了樣品的比表面積。這些因素共同促進了纖維素酶的酶解反應(yīng)，因而提高了葡萄糖得率。

2.3.5 X射線光電子能譜分析[19]不同楊木樣品的XPS圖譜見圖8。

圖8 不同樣品的XPS圖譜分析Fig.8 XPS analysis of different samples a.楊木原料；b.預(yù)處理后樣品；c.酶解后樣品

由圖8可知，通過高斯-洛倫茲擬合將XPS-C 1s區(qū)分為三個小峰，分別代表了木質(zhì)生物質(zhì)中與不同原子或原子團結(jié)合的碳；C1主要來源于木質(zhì)素和抽提物，C2主要來源于半纖維素和纖維素中的羥基基團，C3主要存在于半纖維素和木質(zhì)素中的羰基基團[20]。

表3為不同樣品的O/C原子比以及C1～C3峰的相對含量。通常來說，O/C原子比越高，表明樣品中的纖維素或半纖維素比例越高，而O/C原子比低則表明樣品木質(zhì)素含量較高。

表3 不同樣品的氧碳原子比及C 1s峰的解析Table 3 Atomic O/C ratios and C 1s peak deconvolution of different samples

由表3可知，楊木經(jīng)過預(yù)處理之后，C1峰值強度由16.93%升至46.91%，C3峰值強度由55.01%降至9.62%，這說明樣品中的半纖維素被去除[21]。預(yù)處理后O/C原子比值為0.37，略低于原料(0.40)，這可能是由于隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)溶出的木質(zhì)素在樣品表面再沉積所致[22]。酶解后O/C原子比值分別都高于原料和預(yù)處理后的樣品，說明此時樣品木質(zhì)素含量較低，纖維素含量較多，這是由于在酶水解過程中去除了樣品表面沉積的木質(zhì)素，進一步證實了協(xié)同預(yù)處理對木質(zhì)素和半纖維素的脫除作用。

3 結(jié)論

以楊木為原料，采用低共熔溶劑協(xié)同酸性二氧六環(huán)預(yù)處理的最佳條件為：鹽酸質(zhì)量分數(shù)為1%，預(yù)處理溫度為110 ℃，預(yù)處理時間為70 min。在最佳預(yù)處理條件下，纖維素保留率為73.66%，木質(zhì)素和半纖維素脫除率分別為48.71%和72.61%；楊木的酶解得率可達69.75%。