李晶梅，張飛雁，王煥君，柏 嬌，于義娟，王碧群，朱 薇，鄭良益，李婷婷，馮 釗，石寶蘭，漆世華，謝紅玲

(國藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司，武漢 430075)

陽性血清是免疫學(xué)方法鑒定病原體的重要生物材料，可應(yīng)用陽性血清建立中和實(shí)驗(yàn)、瓊擴(kuò)、血凝、ELISA、膠體金等方法鑒定病原體并診斷疫病[1]。陽性血清還是獸用生物制品質(zhì)量控制所需的重要生物材料。用陽性血清中和毒種、活疫苗中的活病毒，再接種生物組織，從而對(duì)毒種、活疫苗做鑒別檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)，監(jiān)控疫苗產(chǎn)品質(zhì)量。豬病種類多，僅病毒病就包括豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥、豬偽狂犬、豬圓環(huán)、豬口蹄疫、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉等，針對(duì)不同疫病需制備相應(yīng)的陽性血清用于疫苗質(zhì)量控制。

雖然科研人員常用豬[2-4]、羊[5-6]、兔[7-9]制備豬病陽性血清，但趙華娥用雞制備豬流感陽性血清也獲得了成功[10]，并且用雞制備雞病陽性血清[11-13]有諸多成功經(jīng)驗(yàn)可供借鑒。本研究嘗試用SPF雞制備豬丁型冠狀病毒(PDCoV)陽性血清，為雞制備豬病陽性血清積累經(jīng)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 毒種、細(xì)胞 豬丁型冠狀病毒(PDCoV)、PK1細(xì)胞，由國藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4周齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，為BI公司產(chǎn)品；胰液素(3.75 mg/mL)、BEA、FITC標(biāo)記的兔抗雞抗體，為SIGMA公司產(chǎn)品；胰酶，為Solarbio 公司產(chǎn)品；注射用白油，為道達(dá)爾公司產(chǎn)品；司本-80，吐溫-80，購自上海浩鼎貿(mào)易有限公司。

1.4 疫苗制備

1.4.1 PDCoV抗原制備 用細(xì)胞生長液(DMEM培養(yǎng)基+7%胎牛血清+終濃度100單位雙抗)將PK1細(xì)胞培養(yǎng)至單層。換病毒維持液(DMEM培養(yǎng)基+終濃度10 μg/mL胰酶、1%胰液素、100單位雙抗)，接種PDCoV，當(dāng)出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，超濾濃縮至原體積的1/10，加入終濃度5 mmol/L的二乙烯亞胺(BEI，BEA加NaOH環(huán)化獲得)37 ℃滅活24 h，無菌檢驗(yàn)、滅活檢驗(yàn)合格后備用。

1.4.2 水相制備 取PDCoV抗原96份，向其中加入滅菌吐溫-80 4份，充分?jǐn)嚢?，直到吐?80完全溶解。

1.4.3 油相制備 取注射用白油94份，向其中加司本-80 6份，加熱、攪拌至混合均勻，高壓滅菌。

1.4.4 疫苗制備 水相與油相1∶2混合，在剪切機(jī)中以10000 r/min乳化10 min，制備成油包水型疫苗。

1.4.5 檢驗(yàn) 參考《中華人民共和國獸藥典》2020年版三部附錄[14]方法對(duì)疫苗的外觀、劑型、黏度、穩(wěn)定性、純凈性(無菌)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格備用。

1.5 免疫、采血 疫苗免疫3～4周齡SPF雞10只，0.5 mL/只。每間隔2周或適當(dāng)時(shí)長加強(qiáng)免疫一次，劑量同首次免疫。頸背部皮下、胸部肌肉、腿部肌肉交替接種疫苗。收集免疫前的雞血清，一免、二免、三免…后14 d或適當(dāng)時(shí)長的每只雞的血清，作為被檢血清。

1.6 檢測(cè) 按1.7項(xiàng)方法分別檢測(cè)被檢血清中和效價(jià)，計(jì)算雞血清中和抗體的幾何平均值。選擇中和效價(jià)較高的血清混合，作為陽性血清；免疫前的雞血清混合，作為陰性血清。按1.8項(xiàng)的IFA方法將血清用于檢測(cè)PDCoV；檢測(cè)陽性血清對(duì)豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉中和效價(jià)；IFA方法檢測(cè)陽性血清與豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥、豬偽狂犬、豬圓環(huán)、豬細(xì)小、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉是否存在特異性結(jié)合。

1.7 中和效價(jià)測(cè)定 參考《中華人民共和國獸藥典》2020年版三部中和試驗(yàn)法[14]建立如下PDCoV中和效價(jià)測(cè)定方法。

1.7.1 準(zhǔn)備中和用病毒 將PDCoV用病毒維持液稀釋至100 TCID50/0.1 mL。

1.7.2 準(zhǔn)備被檢樣品 用DMEM培養(yǎng)基將陰性血清、被檢血清4倍系列稀釋。將適宜稀釋度的血清分別與1.7.1項(xiàng)100 TCID50/0.1 mL 的PDCoV等體積混合，37 ℃中和1 h。

1.7.3 稀釋中和用病毒 將1.7.1項(xiàng)PDCoV用維持液做10倍系列稀釋，即100、10-1、10-2、10-3稀釋待用。

1.7.4 測(cè)定 96孔板中長成單層的PK1細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長液。各孔加入0.1 mL DMEM培養(yǎng)基，棄去。1.7.2項(xiàng)各稀釋度被檢樣品接種PK1細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種6孔，0.2 mL/孔；1.7.3項(xiàng)各稀釋度的中和用病毒接種PK1細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種6孔，0.1 mL/孔；同時(shí)設(shè)置正常PK1細(xì)胞對(duì)照6孔，加入維持液，0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，棄去孔內(nèi)溶液，加入維持液0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d判定結(jié)果。

1.7.5 判定結(jié)果 中和用病毒為30～300 TCID50/0.1 mL，正常細(xì)胞對(duì)照健活，試驗(yàn)成立。記錄各稀釋度無細(xì)胞病變孔數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算其半數(shù)保護(hù)量(PD50)，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)PD50的幾何平均數(shù)，PD50幾何平均數(shù)的對(duì)數(shù)為平均中和效價(jià)。

1.8 IFA檢測(cè)PDCoV

1.8.1 準(zhǔn)備細(xì)胞 96孔板中長成單層的PK1細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長液。各孔加入0.1 mL DMEM培養(yǎng)基，棄去。

1.8.2 接毒 將PDCoV用病毒維持液稀釋至50 TCID50/0.1 mL，接種1.8.1的細(xì)胞，0.1 mL/孔。同時(shí)設(shè)置正常PK1細(xì)胞對(duì)照，加入維持液，0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，棄去孔內(nèi)溶液，加入維持液0.1 mL/孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d用于IFA檢測(cè)。

1.8.3 IFA檢測(cè) 陰性、陽性血清用PBS做10倍系列稀釋，陰性血清10-1、10-2，陽性血清10-2、10-3、10-4、10-5稀釋待用。1.8.2項(xiàng)中培養(yǎng)3 d的96孔板，80%丙酮固定，PDCoV感染孔、正常PK1細(xì)胞孔分別加入稀釋的陰性、陽性血清，0.1 mL/孔，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加FITC標(biāo)記的兔抗雞抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，熒光顯微鏡下用藍(lán)色激發(fā)光(波長490 nm)觀察。有完整的細(xì)胞形態(tài)并發(fā)出特異性綠色熒光的視為IFA陽性孔。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原制備及檢測(cè) 用PK1細(xì)胞擴(kuò)繁PDCoV抗原約1 L，經(jīng)測(cè)定其病毒含量為108.3TCID50/mL。將PDCoV抗原超濾濃縮至100 mL，加入0.2 mol/L的BEI 2.5 mL，37 ℃滅活24 h，加入1 mol/L的Na2S2O3溶液0.5 mL中和BEI。將滅活后的抗原接種PK1細(xì)胞并盲傳1代，未見細(xì)胞病變，判定抗原滅活完全；將滅活后的抗原做無菌檢驗(yàn)，各培養(yǎng)基均無菌生長，說明超濾濃縮可保證無菌。

2.2 疫苗制備及檢驗(yàn) 100 mL水相與200 mL油相混合，乳化后獲得300 mL疫苗。疫苗外觀為乳白色乳劑、劑型為油包水型、粘度為65.8 cP、穩(wěn)定性為10 mL疫苗經(jīng)3000 r/min離心15 min未見分層且管底無水相；將疫苗做無菌檢驗(yàn)，各培養(yǎng)基均無菌生長。說明疫苗質(zhì)量合格，可用于免疫實(shí)驗(yàn)雞。

2.3 免疫、采血 結(jié)合中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果確定免疫時(shí)間、免疫次數(shù)、采血時(shí)間，實(shí)際免疫程序見表1。每次免疫后14 d采血，四免后35 d、四免后52 d、五免后44 d采血。

表1 免疫程序Tab 1 Immunization procedure

2.4 血清中和效價(jià) 表2結(jié)果顯示，免疫前血清(陰性血清)有“中和效價(jià)”，平均為14.32，分析是因?yàn)檠逯泻土司S持液中的胰酶、胰液素使PDCoV失去感染細(xì)胞的能力產(chǎn)生了“中和效價(jià)”。免疫前血清最高PD50為2.5 log4，說明PD50>2.5 log4的免疫后血清為特異性中和。血清中和效價(jià)隨免疫次數(shù)增加逐漸增高，四免14 d血清平均中和效價(jià)高于1000，五免后未見顯著增加。四免、五免14 d效價(jià)達(dá)到高峰后下降。

表2 血清中和效價(jià)Tab 2 neutralization titer of the sera

2.5 IFA檢測(cè)PDCoV 四免14 d效價(jià)為4.88 log4～5.16 log4的5份血清混合作為陽性血清用于IFA檢測(cè)PDCoV。陰性血清與PDCoV、PK1細(xì)胞有非特異性反應(yīng)，10-1有淡綠色熒光(圖1A、B)，但10-2無可見熒光(圖1C、D)。PDCoV與PK1細(xì)胞用10-2、10-3、10-4稀釋的陽性血清檢測(cè)，PDCoV明顯比PK1細(xì)胞更亮(圖1E、F、G、I、J、K)，PDCoV是特異性熒光，判為陽性孔；PDCoV與PK1細(xì)胞用10-5稀釋的陽性血清檢測(cè)，均無特異性熒光(圖1H、L)。鑒于10-3陽性血清檢測(cè)PDCoV可見明亮的特異性綠色熒光并完整展現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)，將其定為本批血清IFA檢測(cè)PDCoV的最適稀釋度。

A、B：PDCoV、PK1細(xì)胞，陰性血清10-1稀釋；C、D：PDCoV、PK1細(xì)胞，陰性血清10-2稀釋；E～H：PDCoV，陽性血清10-2～10-5稀釋；I～L：PK1細(xì)胞，陽性血清10-2～10-5稀釋A/B:PDCoV/PK1 cells,10-1diluted negative serum;C/D:PDCoV/PK1 cells,10-2diluted negative serum;E～H:PDCoV,10-2～10-5diluted positive serum;I～L:PK1 cells,10-2～10-5diluted positive serum圖1 IFA檢測(cè)PDCoV(100×)Fig 1 Detection of PDCoV infection by IFA(100×)

2.6 特異性檢驗(yàn) PDCoV陽性血清對(duì)豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉中和效價(jià)，均低于最低檢測(cè)值(<1∶16)。IFA檢測(cè)，PDCoV陽性血清對(duì)豬瘟病毒(CSFV)感染的ST細(xì)胞、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)感染的Marc145細(xì)胞、豬偽狂犬病毒(PRV)感染的ST細(xì)胞、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染的PK15細(xì)胞、豬細(xì)小病毒(PPV)感染的IBRS-2細(xì)胞、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)感染的ST細(xì)胞、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)感染的Vero細(xì)胞無特異性反應(yīng)(圖2)。

3 討論與結(jié)論

3.1 PDCoV陽性血清的應(yīng)用 PDCoV感染可引起仔豬嘔吐、腹瀉等癥狀[15-16]，嚴(yán)重影響豬群的生長發(fā)育。PDCoV陽性血清可在ELISA、IHC、IFA等檢測(cè)方法中應(yīng)用[17-19]，從而建立豬丁型冠狀病毒病的診斷方法。

A：CSFV-CSFV單抗；B：CSFV-PDCoV陽性血清；C：PRRSV-PRRSV單抗；D：PRRSV-PDCoV陽性血清；E：PRV-PRV單抗；F：PRV-PDCoV陽性血清；G：PCV2-PCV2單抗；H：PCV2-PDCoV陽性血清；I：PPV-PPV單抗；J：PPV-PDCoV陽性血清；K：TGEV-TGEV單抗；L：TGEV-PDCoV陽性血清；M：PEDV-PEDV單抗；N：PEDV-PDCoV陽性血清A:CSFV- McAb of CSFV;B:CSFV- positive serum of PDCoV;C:PRRSV- McAb of PRRSV；D:PRRSV- positive serum of PDCoV;E:PRV- McAb of PRV；F:PRV- positive serum of PDCoV;G:PCV2- McAb of PCV2；H:PCV2- positive serum of PDCoV;I:PPV- McAb of PPV；J:PPV- positive serum of PDCoV;K:TGEV- McAb of TGEV;L:TGEV- positive serum of PDCoV;M:PEDV- McAb of PEDV;N:PEDV- positive serum of PDCoV圖2 IFA檢測(cè)PDCoV陽性血清的特異性(100×)Fig 2 Specificity of PDCoV positive serum detected by IFA(100×)

陽性血清還可用于毒種和活疫苗的鑒別檢驗(yàn)、純凈性檢驗(yàn)，從而進(jìn)行疫苗的質(zhì)量控制。PDCoV在無胰酶、胰液素時(shí)，在ST、Vero、PK15等細(xì)胞上不產(chǎn)生細(xì)胞病變[20-21]，根據(jù)2020版獸藥典，具有此特性的PDCoV毒種做外源病毒檢驗(yàn)可不進(jìn)行中和，但仍需制備陽性血清用于毒種鑒別檢驗(yàn)[14]。

3.2 用雞制備豬病陽性血清的優(yōu)勢(shì)和可行性 ①用豬制備豬病陽性血清，需篩選抗原、抗體陰性豬，雞不感染豬病毒病，血清中不含各種豬病的抗體，還有供應(yīng)充足、來源穩(wěn)定的商品化SPF雞可用；②雞屬于小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，飼養(yǎng)于隔離器中便于控制疫病感染，飼養(yǎng)管理比豬、羊更有優(yōu)勢(shì)；③礦物油佐劑制備的油包水型疫苗免疫動(dòng)物后產(chǎn)生比其他佐劑疫苗更高的抗體[22-24]，但哺乳動(dòng)物對(duì)礦物油副反應(yīng)大[22，25-26]，雞可耐受礦物油佐劑，可使用油包水型疫苗免疫[14]，從而獲得高效價(jià)抗體。

3.3 技術(shù)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)分析 BEI屬于烷化劑類滅活劑，這類滅活劑能破壞病毒核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而又不損害其蛋白衣殼、保留其保護(hù)性抗原[27]，因而比甲醛滅活制備的疫苗免疫原性更好，抗體效價(jià)更高。所以免疫用的PDCoV疫苗的抗原使用了BEI滅活。

PDCoV抗體效價(jià)在4次免疫后達(dá)到高峰，隨后下降較快，加免后效價(jià)再次達(dá)到高峰。分析原因，可能是雞非PDCoV的自然宿主，不能快速產(chǎn)生特異性抗體且效價(jià)下降較快。

3.4 成果及展望 本研究用SPF雞制備出PDCoV陽性血清，最高平均中和效價(jià)大于1000。1000倍稀釋的陽性血清用于IFA檢測(cè)PDCoV，感染PDCoV的細(xì)胞熒光顯微鏡下顯示特異性亮綠色熒光。陽性血清不與PDCoV外的主要豬病病原體反應(yīng)，特異性良好。所以，制備的PDCoV陽性血清可用于中和法、IFA鑒別檢驗(yàn)PDCoV，為疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究為制備方法的前期研究，陽性血清保存條件、保存期等尚需深入研究。

豬病疫苗是生物制品企業(yè)的主要產(chǎn)品，企業(yè)對(duì)各種豬病陽性血清均有需求。豬病陽性血清屬于標(biāo)準(zhǔn)品，與疫苗、診斷制品相比，其用量少、經(jīng)濟(jì)價(jià)值低，暫無穩(wěn)定、批量供應(yīng)各類豬病陽性血清的生產(chǎn)企業(yè)。如需使用，多為生物制品企業(yè)自行制備，或研究機(jī)構(gòu)少量提供。所以，如能建立通用、簡(jiǎn)易、可操作性強(qiáng)、質(zhì)量穩(wěn)定的豬病陽性血清制備方法，將降低豬用疫苗生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)控成本、提高質(zhì)控質(zhì)量。用雞制備PDCoV陽性血清方法成立，用雞制備其他豬病的陽性血清也有成功的可能，可對(duì)不同疫病做針對(duì)性、細(xì)致研究，以期將雞應(yīng)用于更多豬病血清的制備。