劉元杰，王團(tuán)結(jié)，王秀麗，張一幟，李 建，張 媛

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

疫苗的安全檢驗(yàn)是指通過(guò)特定劑量接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的反應(yīng)來(lái)確定疫苗是否安全的方法。目前我國(guó)動(dòng)物疫苗的安全檢驗(yàn)采用的是接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法。在常規(guī)的注冊(cè)檢驗(yàn)、復(fù)核檢驗(yàn)和監(jiān)督檢驗(yàn)中，安全檢驗(yàn)只需要按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中安全檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行。而在產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中，針對(duì)特定產(chǎn)品，還需要進(jìn)行特殊項(xiàng)目的安全性評(píng)價(jià)。如對(duì)部分活疫苗，需要評(píng)價(jià)其水平傳播對(duì)其他易感動(dòng)物和環(huán)境的影響；對(duì)于以基因工程技術(shù)研制的動(dòng)物疫苗產(chǎn)品，要按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部有關(guān)規(guī)定，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)等。本文重點(diǎn)闡述常規(guī)安全檢驗(yàn)中涉及的技術(shù)方法。

1 安全檢驗(yàn)概述

1.1 免疫劑量 在細(xì)菌類動(dòng)物疫苗產(chǎn)品安全檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)免疫劑量的敘述中，滅活疫苗主要以體積為計(jì)量單位，如免疫2 mL、3 mL等?；钜呙缍酁閮龈擅?，主要以頭份/羽份數(shù)為計(jì)量單位，同時(shí)規(guī)定稀釋液體積。2020版《中國(guó)獸藥典》中，對(duì)個(gè)別產(chǎn)品進(jìn)行了規(guī)范，如沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)活疫苗(C355株)，從以菌落形成單位為計(jì)量單位變更為體積同時(shí)標(biāo)注頭份數(shù)的方式。雖然計(jì)量單位不同，但安全檢驗(yàn)的接種劑量都與使用劑量遵循一定的比例原則。在使用本動(dòng)物進(jìn)行安全檢驗(yàn)時(shí)，接種劑量一般活疫苗不少于10個(gè)使用劑量，滅活疫苗不少于2個(gè)使用劑量[1]。疫苗研發(fā)安全試驗(yàn)有一次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和一次超劑量接種三個(gè)過(guò)程[2]，而在安全檢驗(yàn)中以一次超劑量接種為主。對(duì)于需要多次接種的產(chǎn)品，安全檢驗(yàn)需要進(jìn)行多次超劑量接種，如豬支原體肺炎滅活疫苗(CJ株)[3]。

1.2免疫方法 在細(xì)菌類動(dòng)物疫苗的安全檢驗(yàn)中，免疫方法以皮下注射和肌肉注射為主。部分產(chǎn)品的要求更加細(xì)化，如對(duì)小鼠規(guī)定背部皮下、腿部皮下或腿部肌肉，對(duì)雞規(guī)定頸背部皮下或腿部肌肉等。除皮下注射和肌肉注射以外，在特定產(chǎn)品中還有其他的免疫方法。如沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)活疫苗用腹腔注射的方法接種小鼠，雞毒支原體活疫苗用點(diǎn)眼的方法接種SPF雞，雞毒支原體活疫苗(MG 6/85株)用噴霧方法接種SPF雞[4]，豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(C20株)用口服疫苗稀釋液的方法接種豬。安全檢驗(yàn)的接種方法與疫苗使用方法一致，在安全檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的接種方法操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代 1959年，英國(guó)動(dòng)物學(xué)家William和Rex提出在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(Refinement)三個(gè)原則(簡(jiǎn)稱3R原則)，后來(lái)逐漸成為現(xiàn)今動(dòng)物替代方法的核心內(nèi)容[5]。使用替代動(dòng)物可以從根本上減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)也是保障動(dòng)物福利的重要內(nèi)容。但隨著疫苗產(chǎn)品安全標(biāo)準(zhǔn)不斷提高，不使用替代動(dòng)物成為一種趨勢(shì)。美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)第九卷(9CFR)中對(duì)于動(dòng)物疫苗安全檢驗(yàn)要求必須使用本動(dòng)物進(jìn)行，部分對(duì)小鼠有天然毒性的疫苗還需要以小鼠進(jìn)行安全檢驗(yàn)[6]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2006年發(fā)布的《獸用生物制品實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》也在這方面進(jìn)行了補(bǔ)充，要求禽類制品安全檢驗(yàn)使用本動(dòng)物，其他制品除了使用靶動(dòng)物以外，還須用敏感小動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，從本動(dòng)物和小動(dòng)物兩個(gè)不同的角度把控疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用中，禽類要求為SPF級(jí)，小鼠、大鼠為清潔級(jí)，兔、豚鼠要求為普通級(jí)。SPF豬飼養(yǎng)成本較高，且目前在國(guó)內(nèi)尚未形成完整的質(zhì)量控制體系，在實(shí)際中很少應(yīng)用。大動(dòng)物在實(shí)際應(yīng)用中通常使用普通級(jí)，所以需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行篩選。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中帶有“健康易感”的則認(rèn)為需要進(jìn)行篩選，部分產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有附加具體的動(dòng)物篩選方法，需要根據(jù)抗原或抗體特性選取合適的方法進(jìn)行篩選。篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般以抗原或抗體陰性為原則，具體有以下幾種方法：

1.4.1 背景追溯 背景追溯是篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本方法。具體要求為未使用過(guò)同種類型的疫苗產(chǎn)品，無(wú)相關(guān)病史。背景追溯是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行初篩的最簡(jiǎn)單、有效的方法，但只能從動(dòng)物的飼養(yǎng)歷史上進(jìn)行初步判斷。無(wú)清潔級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選都要進(jìn)行背景追溯，但多數(shù)產(chǎn)品還需要輔以其他篩選方法。

1.4.2 凝集反應(yīng) 凝集反應(yīng)分為平板凝集、試管凝集和微量凝集。三種凝集方法的原理本質(zhì)上都是抗原抗體產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。平板凝集只需要2～4 min即可根據(jù)凝集情況判定結(jié)果，代表產(chǎn)品有副豬嗜血桿菌病二價(jià)滅活疫苗(1型LC株+5型LZ株)等[7]。試管凝集與微量凝集方法的區(qū)別在于反應(yīng)體系的大小，均需要反應(yīng)6 h以上，但是靈敏性要高于平板凝集方法。試管凝集在近幾年的產(chǎn)品中已經(jīng)很少應(yīng)用，以微量凝集為主。微量凝集可以對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行批量篩選，提高工作效率。如仔豬大腸桿菌病基因工程滅活疫苗(GE-3株)就是使用微量凝集的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選[8]。

1.4.3 間接血凝(IHA) 間接血凝是將可溶性抗原或抗體吸附在具有載體和指示功能的紅細(xì)胞上，借助抗原抗體反應(yīng)將紅細(xì)胞凝集進(jìn)行觀察的方法。同凝集方法相比，間接血凝的靈敏度更高，如豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)就是采用的間接血凝的方法來(lái)篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[9]。

1.4.4 ELISA ELISA是目前應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選方法，以檢測(cè)抗體為主。ELISA方法的敏感性高于凝集反應(yīng)和IHA。通過(guò)借助酶標(biāo)儀對(duì)反應(yīng)結(jié)果OD值進(jìn)行讀數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果，可以減少因人為觀察所造成的誤差。

1.4.4 PCR PCR方法一般用來(lái)檢測(cè)抗原，如副豬嗜血桿菌病二價(jià)滅活疫苗(4型JS株+5型ZJ株) 是進(jìn)行鼻拭子采樣后通過(guò)PCR方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選[10]。在目前已有的檢測(cè)方法中，PCR的敏感性最高。但是PCR方法操作相對(duì)復(fù)雜，在采樣后需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后離心將菌體重懸作為模板，按規(guī)定體系反應(yīng)后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定結(jié)果。且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需用到PCR儀、搖床、電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件設(shè)施要求較高。

在實(shí)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選的過(guò)程中，有時(shí)也會(huì)同時(shí)用到多種篩選方法。如副豬嗜血桿菌病三價(jià)滅活疫苗(4型SH株+5型GD株+12型JS株)[11]，由于篩選要求需要抗原抗體雙陰性，所以同時(shí)采用了PCR和凝集兩種方法。

1.4.5 群體篩選 上述幾種方法均為針對(duì)動(dòng)物個(gè)體進(jìn)行篩選。除個(gè)體篩選以外，部分產(chǎn)品也會(huì)應(yīng)用到群體篩選方法。在豬萎縮性鼻炎滅活疫苗(TK-MB6株+TK-MD8株)安全檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選過(guò)程中，選取3～5頭符合標(biāo)準(zhǔn)的豬進(jìn)行剖檢，觀察肺部和鼻甲骨，以此來(lái)確定備選豬群是否符合要求[12]。鴨傳染性漿膜炎三價(jià)滅活疫苗(1型 YBRA01株+2型 YBRA02株+4型 YBRA04株)以不低于使用鴨數(shù)量20%的比例對(duì)鴨群抽樣，通過(guò)采取收集血清篩選合格后來(lái)確定本批鴨是否符合要求，最后選取未采血鴨作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[13]。

產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚未明確“群體篩選”這一概念，只在實(shí)際應(yīng)用中以樣品代表群體。在進(jìn)行群體篩選的過(guò)程中，應(yīng)注意檢測(cè)樣品背景和來(lái)源相同，如多個(gè)來(lái)源，應(yīng)對(duì)不同來(lái)源背景的動(dòng)物群體分別抽樣進(jìn)行篩選。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察 在接種疫苗前，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行為期1～3 d的觀察，使其充分適應(yīng)新環(huán)境。在接種疫苗后需觀察6～21 d，以10 d、14 d居多。觀察6 d的如布氏桿菌活疫苗，21 d的如仔豬副傷寒活疫苗。2020版《中國(guó)獸藥典》中對(duì)免疫后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察時(shí)間做了規(guī)定，如小鼠、豚鼠、兔等觀察時(shí)間不低于6 d，禽類和大動(dòng)物觀察時(shí)間不低于7 d。大部分產(chǎn)品觀察指標(biāo)為健活，即動(dòng)物存活且保持健康。健活的具體要求包括“注射部位無(wú)炎癥”、“未出現(xiàn)疫苗引起的局部或全身不良反應(yīng)”等?！敖』睢笔亲罨竞?jiǎn)便的觀察指標(biāo)，對(duì)于部分以本動(dòng)物進(jìn)行安全檢驗(yàn)的產(chǎn)品，還需要用到其他方法。

1.5.1 剖檢法 剖檢法多數(shù)針對(duì)不致死但感染動(dòng)物特定部位的病原，通過(guò)剖檢后觀察病原感染部位的病變程度來(lái)確定產(chǎn)品是否安全。如雞毒支原體活疫苗安全檢驗(yàn)，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)雞氣囊進(jìn)行剖檢，應(yīng)無(wú)臨床損傷。剖檢法有時(shí)候還需要輔以記分法，根據(jù)分值進(jìn)行更精確的判定。

1.5.2 測(cè)溫法 測(cè)溫法一般需要在接種疫苗前3～5 d進(jìn)行體溫測(cè)定，取其平均值作為基礎(chǔ)體溫。然后在疫苗接種后進(jìn)行體溫測(cè)定。一般體溫升高不超過(guò)一定值或者升高后在規(guī)定天數(shù)內(nèi)恢復(fù)即為正常。不同產(chǎn)品的體溫具體觀測(cè)方法略有不同，如豬敗血性鏈球菌病活疫苗(ST171株)是在14～21 d進(jìn)行觀察，體溫超過(guò)正常1 ℃不應(yīng)超過(guò)3 d。而豬鏈球菌病滅活疫苗(馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型)則是在前三日進(jìn)行觀察，體溫不超過(guò)1 ℃。測(cè)溫法可以根據(jù)動(dòng)物的體溫反應(yīng)來(lái)確定疫苗的安全性，一般以本動(dòng)物、大動(dòng)物為主。

1.5.3 記分法 記分法是根據(jù)動(dòng)物接種疫苗后反應(yīng)或剖檢后感染部位的病變程度來(lái)賦予分值，根據(jù)分值來(lái)確定動(dòng)物是否符合要求。如豬大腸桿菌病、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病、諾維氏梭菌病三聯(lián)滅活疫苗就是根據(jù)動(dòng)物的臨床反應(yīng)判定分值，進(jìn)而確定產(chǎn)品是否符合要求[14]。在動(dòng)物剖檢觀察方面，應(yīng)用記分法較多的是寄生蟲(chóng)類產(chǎn)品。如雞球蟲(chóng)病四價(jià)活疫苗，在接種疫苗后剖檢，分別在幾種寄生蟲(chóng)適宜寄生部位進(jìn)行觀察記分，根據(jù)分值來(lái)確定產(chǎn)品是否符合要求。

2 歐美相關(guān)法規(guī)概述

美國(guó)9CFR中，對(duì)細(xì)菌類動(dòng)物疫苗安全檢驗(yàn)免疫劑量的規(guī)定與《中國(guó)獸藥典》略有不同，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制定安全檢驗(yàn)方法。對(duì)于小鼠和豚鼠等替代動(dòng)物，以體積為單位進(jìn)行免疫；對(duì)于非替代動(dòng)物，按一倍或多倍使用劑量進(jìn)行免疫。禽用疫苗的安全檢驗(yàn)則是與效力檢驗(yàn)合并進(jìn)行，通過(guò)觀察效力檢驗(yàn)接種后動(dòng)物的反應(yīng)來(lái)檢驗(yàn)疫苗的安全性[15]。美國(guó)9CFR還對(duì)細(xì)菌類疫苗和病毒類疫苗的免疫劑量上加以區(qū)分，如豬和綿羊安全檢驗(yàn)，細(xì)菌疫苗接種2頭份，病毒疫苗接種10頭份，但對(duì)活疫苗和滅活疫苗并沒(méi)有明確接種劑量的不同。

針對(duì)國(guó)內(nèi)外差異，可在后期的修訂工作中有針對(duì)地進(jìn)行研究論證。比如，以小鼠動(dòng)物替代豬等大動(dòng)物時(shí)，由于動(dòng)物體重相差巨大，以豬的使用劑量做為接種小鼠的參考單位是否具有實(shí)際意義。美國(guó)9CFR禽用疫苗安全檢驗(yàn)效力檢驗(yàn)合并，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，但是在安全檢驗(yàn)免疫劑量即使用劑量的前提下。對(duì)于安全檢驗(yàn)高于使用劑量的接種劑量對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量控制的必要性論證，也可以作為一個(gè)研究方向。值得注意的是，《歐洲藥典》在對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求中規(guī)定了最小使用日齡[16]，而《中國(guó)獸藥典》在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中規(guī)定了日齡或體重范圍，卻沒(méi)有明確規(guī)定使用最小使用日齡或體重的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。針對(duì)這方面的差異，也可作為后期藥典修訂工作中的一個(gè)研究方向。

3 安全檢驗(yàn)中存在的問(wèn)題

3.1 替代動(dòng)物的使用 在安全檢驗(yàn)過(guò)程中，小鼠操作簡(jiǎn)便且成本較低，是優(yōu)先考慮的替代動(dòng)物。但因替代動(dòng)物與本動(dòng)物易感性和體重差異巨大，建立對(duì)比關(guān)系難以準(zhǔn)確把握。豬丹毒活疫苗G4T10株是經(jīng)歷市場(chǎng)考驗(yàn)的經(jīng)典產(chǎn)品，但在近些年的安全檢驗(yàn)項(xiàng)目中，以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不合格率較高。由于使用豬進(jìn)行安全檢驗(yàn)結(jié)果合格，故推斷當(dāng)前小鼠的集約化飼養(yǎng)方式可能導(dǎo)致了小鼠敏感性的變化，具體原因還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選方法有待進(jìn)一步研究和規(guī)范 近些年通過(guò)新獸藥注冊(cè)的產(chǎn)品一般附加了詳細(xì)的動(dòng)物篩選方法，但對(duì)于同種產(chǎn)品，不同研發(fā)單位的篩選方法不同，評(píng)價(jià)方法也不同，缺少針對(duì)同類產(chǎn)品的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。部分收錄在《中國(guó)獸藥典》中的產(chǎn)品，沒(méi)有明確動(dòng)物篩選方法。根據(jù)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行抗原或抗體的檢測(cè)雖然可以達(dá)到篩選目的，但缺少具體依據(jù)。應(yīng)不斷規(guī)范和完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選方法，針對(duì)同類產(chǎn)品，建立統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為安全檢驗(yàn)結(jié)果提供依據(jù)。

3.3 檢測(cè)技術(shù)有待進(jìn)一步加強(qiáng) 目前企業(yè)自主研發(fā)的疫苗產(chǎn)品，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告。在監(jiān)管過(guò)程中，缺少現(xiàn)實(shí)可行的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，依賴企業(yè)提供的菌毒種、試劑和方法等。特別是對(duì)于進(jìn)口產(chǎn)品，難以做到有效監(jiān)管。針對(duì)這種情況，應(yīng)對(duì)特定病原加強(qiáng)通用檢驗(yàn)方法研究，完善質(zhì)量控制方法，為實(shí)際監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

4 展 望

在養(yǎng)殖業(yè)中，針對(duì)細(xì)菌感染，往往使用抗生素即可達(dá)到治療的目的，這使細(xì)菌類動(dòng)物疫苗在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)占國(guó)內(nèi)市場(chǎng)比重不大。但是，近年來(lái)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大力推進(jìn)獸藥“減抗”，細(xì)菌類動(dòng)物疫苗的重要性在一定程度上有所提升。同時(shí)，這也對(duì)細(xì)菌類動(dòng)物疫苗的技術(shù)評(píng)價(jià)和監(jiān)管提出了新的要求。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，獸用生物制品領(lǐng)域技術(shù)也是日新月異。疫苗在生產(chǎn)、檢驗(yàn)過(guò)程中涉及的原輔材料工藝不斷更新的同時(shí)對(duì)疫苗本身和檢驗(yàn)過(guò)程可能有潛在影響，從而影響最終檢驗(yàn)結(jié)果。一些歷經(jīng)考驗(yàn)的經(jīng)典產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)是上一代獸醫(yī)學(xué)者留下的寶貴財(cái)富，應(yīng)不斷研究和完善，使其可以適應(yīng)新的技術(shù)環(huán)境。

雖然在動(dòng)物疫苗安全檢驗(yàn)中還存在諸多問(wèn)題，但是隨著獸藥質(zhì)量控制體系的不斷完善，安全檢驗(yàn)整體在不斷往規(guī)范化前進(jìn)。在檢驗(yàn)技術(shù)的不斷提高和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善的背景下，相信動(dòng)物疫苗安全檢驗(yàn)的標(biāo)尺會(huì)在產(chǎn)品質(zhì)控中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。