葉建新，陳星宇，張成宇，趙 雙，李昭龍，王冠男，程曉薇，于忠娜，于 雷

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200)

奶牛乳房炎是危害全世界奶牛的主要疾病之一[1]，也是影響奶牛健康和乳制品安全的關(guān)鍵因素[2]。乳房內(nèi)細(xì)菌性感染被認(rèn)為是奶牛乳房炎的主要原因。其中，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要傳染性病原體之一[3]，也是一種常見的食源性致病微生物。奶牛感染金黃色葡萄球菌引發(fā)的乳房炎通常是慢性感染[4]，雖然不會(huì)導(dǎo)致奶牛的異?；蛩劳觯稍摼a(chǎn)生的降解酶和毒素會(huì)不可逆地?fù)p害乳房組織[5]，最終降低產(chǎn)奶量。目前，應(yīng)用抗生素仍是奶牛乳房炎的主要治療策略[6]。但使用抗生素治療由金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染，會(huì)使該菌產(chǎn)生生物膜并適應(yīng)宿主環(huán)境[7-8]，產(chǎn)生耐藥性[9]，從而增加治療難度。此外抗生素會(huì)在奶牛體內(nèi)產(chǎn)生不同程度的藥物殘留，這不僅制約了我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展，也將危害人們的日常飲食健康[10]。

我國中草藥資源豐富，且中草藥具有毒副作用小、藥物殘留少等優(yōu)點(diǎn)，且中草藥的活性物質(zhì)具有抗菌、消炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。使用中草藥代替抗生素在如今的無抗時(shí)代是大勢所趨，可以從根本上提高牛奶品質(zhì)，提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[11]。試驗(yàn)選取并研究了22味中草藥及其復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，為進(jìn)一步研發(fā)防治金黃色葡萄球菌引起的乳房炎中草藥制劑及實(shí)際臨床應(yīng)用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌，分離自山東省煙臺(tái)市某奶牛場患乳房炎奶樣，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存并贈(zèng)送。

1.2 試驗(yàn)藥物 黃芩、鉤藤、王不留行、菊花、神曲、紅花、白頭翁、金銀花、獨(dú)活、大黃、山藥、桃仁、黃柏、丹皮、藿香、甘草、柴胡、白術(shù)、黃芪、蒲公英、地榆、厚樸共22味中藥，均購自于山東省萊陽市棗行藥店。

1.3 試劑和儀器 LB培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(WJ-3-160),購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD),購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫?fù)u床(SHAKE SCS-24)，購自上海市離心機(jī)械研究所有限公司；常規(guī)儀器與試劑,均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 菌液活化及濃度的測定 金黃色葡萄球菌的分離活化，參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行，將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取單個(gè)菌落接種至5 mL液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)16 h。每隔2 h用分光光度計(jì)在600 nm測定OD值，確定細(xì)菌的對(duì)數(shù)期，參考文獻(xiàn)[13]的方法，利用平板計(jì)數(shù)法測定菌落數(shù)，調(diào)整菌液的濃度為2x109CFU·mL-1。

1.5 中藥的制備 稱取各中藥20 g置于燒杯中加入300 mL蒸餾水，浸泡1 h后，倒入鍋中武火加熱至沸騰，隨后文火加熱50 min。加熱后用8層紗布過濾，取出藥渣，再加入300 mL蒸餾水，倒入鍋中，步驟同上。合并兩次濾液，加熱濃縮至1 g·mL-1，室溫放置12 h，6 000 r·min-1離心5 min，取上清液，高壓滅菌，在4 ℃冰箱中保存。

1.6 藥敏片的處理 參考文獻(xiàn)[14]的方法，取22味中藥提取液各1 mL于1.5 mL離心管中，分別放入10片藥敏片，充分浸泡24 h后，轉(zhuǎn)移至玻璃平皿中并將藥敏片不重疊的擺平分開。放入37 ℃恒溫箱烘干24 h后做好標(biāo)記，放入4 ℃冰箱備用。

1.7 中藥抑菌試驗(yàn)及復(fù)方的抑菌試驗(yàn)

1.7.1 單味中藥的抑菌試驗(yàn) 取20 μL稀釋后的菌液(2x108CFU·mL-1)于培養(yǎng)皿中，用涂布棒均勻涂布，用鑷子在酒精燈火焰上消毒后，夾取處理過的藥敏片放入培養(yǎng)皿中，按平按實(shí)，并在平板底部做好標(biāo)記。用封口膜對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行封口處理，倒置平板，放入恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24 h。每種藥物3個(gè)重復(fù)，取平均值。參照文獻(xiàn)[15]的測定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈大于15 mm時(shí)判定為高敏，介于10～15 mm時(shí)判定為中敏；小于10 mm時(shí)判定為低敏。

1.7.2 中藥復(fù)方的篩選及抑菌試驗(yàn) 把地榆、黃芩、白術(shù)、丹皮提取液按2∶2∶2∶1、4∶4∶4∶1、2∶2∶1∶2、4∶4∶1∶4、2∶1∶2∶2、4∶1∶4∶4、1∶2∶2∶2、1∶4∶4∶4的比例配伍，制備復(fù)方中藥的水提液，并依次命名為復(fù)方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ，各復(fù)方藥物濃度均為1 g·mL-1，6000 r·min-1離心5 min，過濾后高壓滅菌，置于4 ℃保存。中藥復(fù)方的藥敏片處理與1.5相同；復(fù)方中藥的抑菌試驗(yàn)與1.6.1相同。

1.7.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 參照文獻(xiàn)[16]在1～7號(hào)管和9號(hào)管各加入0.1 mL稀釋好的菌液(2x108CFU·mL-1)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，具體步驟見表1，24 h后將制備好的菌液涂布于培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱18 h，以菌落分散生長的視為有抑菌效果，此時(shí)最低藥物濃度值為其MIC值;以肉眼觀察無菌落生長的為100 %被殺滅，此時(shí)最低藥物濃度值為MBC。

表1 二倍稀釋法Tab 1 Double dilution method

2 結(jié)果與分析

2.1 單味中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表2可見，22味中藥中篩選出對(duì)奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌有抑菌作用的有13種，其中黃芩和地榆的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑分別為18.30±1.02 mm和18.32±1.00 mm，均屬于高度敏感；黃柏、丹皮、甘草、白術(shù)、獨(dú)活共5味中藥均屬中度敏感，抑菌圈直徑分別為11.88±0.36 mm、13.34±0.56 mm、10.60±0.26 mm、14.48±0.66 mm和11.30±0.58 mm；藿香、柴胡、黃芪、蒲公英、菊花、金銀花共6味中藥屬低度敏感；其余9種無抑菌效果。

表2 單味中藥抑菌結(jié)果(mm)Tab 2 Antibacterial test results of single traditional Chinese medicine(mm)

2.2 復(fù)方中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表3可見，所有復(fù)方對(duì)奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出一定的抑菌效果，且均為高度敏感。

表3 復(fù)方中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果(mm)Tab 3 Antibacterial test results of compound traditional Chinese medicine(mm)

2.3 單味中藥MIC和MBC測定結(jié)果 22味中藥中，地榆的MIC值為31.25 mg·mL-1，MBC值為31.25 mg·mL-1，抑菌和殺菌效果較其他單味中藥強(qiáng)，其次是黃芩和白術(shù)。具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 單味中藥MIC和MBC測定結(jié)果(mg·mL-1)Tab 4 Determination results of MIC and MBC of single traditional Chinese medicine(mg·mL-1)

2.4 中藥復(fù)方MIC和MBC測定結(jié)果 八種中藥復(fù)方制劑中復(fù)方Ⅱ和復(fù)方Ⅶ的抗菌和殺菌能力較強(qiáng)，其MIC和MBC均為31.25 mg·mL-1；其余中藥復(fù)方也有一定抑菌效果。具體數(shù)據(jù)見表6。

表5 中藥復(fù)方MIC和MBC測定結(jié)果(mg·mL-1)Tab 5 Determination results of MIC and MBC of traditional Chinese medicine compound(mg·mL-1)

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)單味中藥中黃芩和地榆水提液對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌呈高度敏感，左國營等人[17]的結(jié)果也顯示地榆、黃芩兩種藥物對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。研究證實(shí)，黃芩的主要抑菌成分是黃芩苷和黃芩素，其中黃芩素能夠抑制細(xì)菌形成生物保護(hù)膜，削弱細(xì)菌的自我保護(hù)能力，并通過干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和抑制三羧酸循環(huán)達(dá)到抑菌作用，黃芩不僅作為單味藥發(fā)揮抑菌作用明顯，與其它中藥配伍時(shí)還能起到良好的協(xié)同作用[18]。鞣質(zhì)、酚酸類、皂苷類及黃酮類成分是地榆發(fā)揮其抑菌效果的主要活性成分[19]。地榆可能是通過提高金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)菌整體的穩(wěn)定性和完整性，利于鞣質(zhì)等抑菌成分進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，從而發(fā)揮抑菌作用。本試驗(yàn)中白術(shù)、丹皮對(duì)金黃色葡萄球菌也具有較好的抑菌效果，這與前人[20-21]的研究結(jié)果一致。白術(shù)主要是通過揮發(fā)性油和多糖類成分進(jìn)行抑菌，白術(shù)揮發(fā)油對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌和草綠色鏈球菌的抑菌作用明顯[22]。本試驗(yàn)采用水煎法熬制中藥，無法獲得白術(shù)揮發(fā)油，證實(shí)白術(shù)水提液對(duì)金黃色葡萄球菌也具有較好的抑菌作用，但其抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)采用二煎法水煎的方式熬制提取中藥，但是各類中藥性狀、結(jié)構(gòu)不同，僅用傳統(tǒng)水煎方法提取出的中藥有效成分有所差異，水溶性成分并不是所有中藥的有效抑菌成分，采取水煎法所提取的藥液并不能完全發(fā)揮出所選取中藥的真正抑菌效果，可能得到的水提藥液中僅是一般化學(xué)成分，或是活性成分的前體成分，其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在不同程度的影響。本試驗(yàn)中所得的中藥抑菌圈直徑與相關(guān)文獻(xiàn)[23-25]有一定差異，可能是菌株的來源不同、中藥的提取方法不同、抑菌試驗(yàn)采用的方法不同而造成結(jié)果上的差異。此外，本研究中單味中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果測定結(jié)果多為低敏或不敏感，可能是單味中藥藥敏試驗(yàn)中所選的濃度過低所致，還需要調(diào)整藥液濃度進(jìn)一步研究，篩選出對(duì)病原菌有抑菌效果的藥液濃度。

研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方藥的抑菌效果普遍強(qiáng)于單味藥，可能是所選中藥之間發(fā)揮協(xié)同抑菌作用；但復(fù)方藥中也存在抑菌效果弱于單味藥，可能是復(fù)方藥中僅單味中藥發(fā)揮抑菌作用或某幾種中藥出現(xiàn)拮抗抑菌作用。各類中藥對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制各不相同，從而產(chǎn)生的抑菌效果也存在差異。因此挑選合適的，具有高效抑菌的中藥具有非常重要的臨床價(jià)值。而通過組合、配伍將不同的單味藥形成副作用小、抑菌效果好的復(fù)方中藥仍然需要不懈的深入研究，在當(dāng)今國家嚴(yán)格管控抗生素使用的背景下，本試驗(yàn)為臨床上研究防治奶牛乳房炎致病菌中金黃色葡萄球菌的中藥復(fù)方提供參考。由于中藥種類較多，有效成分復(fù)雜，其復(fù)方的配比和復(fù)方之間抑菌作用的相互影響還有待進(jìn)一步研究。