周 玲，亞森江·阿布都拉，和 軍，顏景灝，李水學

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院小兒外科，新疆烏魯木齊 830001)

隱睪癥(cryptorchidism)是男性最常見的泌尿生殖系統(tǒng)異常，是由于單側或雙側睪丸下降過程障礙導致睪丸組織停留于陰囊以上的位置所導致，足月兒發(fā)生率2%～4%[1]。這一發(fā)病率在早產兒中更高，尤其合并低體重的患兒[2]。隱睪癥的發(fā)生機制尚不完全明確，不同的因素導致睪丸下降受阻，從而不同程度地影響患側睪丸的發(fā)育和遠期生育能力。抑制素B(inhibin-B，INH-B)與抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)均由睪丸支持細胞產生，其水平與睪丸支持細胞的數量及功能有關[3-4]。本實驗通過建立小鼠隱睪模型，研究其睪丸質量及睪丸組織病理學變化，檢測小鼠血清INH-B、AMH水平，探索兩種激素變化與隱睪睪丸損傷之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 實驗動物正常生長的50只健康美國癌癥研究所(Institate of Cancer Research,ICR)雄性小鼠(20日齡)，體質量25～39 g，利用隨機數字表將小鼠隨機分為3組：即假手術組15只、單側隱睪組15只、雙側隱睪組20只。

1.2 主要儀器與試劑0．3%(體積分數)戊巴比妥鈉、整套手術器械、BS-1105型電子天平(北京賽多科斯天平有限公司)、甲醛、生理鹽水、甲硝唑、不同體積分數(100%、95%、75%)乙醇溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1建立隱睪模型 所有小鼠進行稱重、標號，隨機分為假手術組(15只)、單側隱睪組(15只)及雙側隱睪組(20只)3組。選取單側組小鼠和雙側組小鼠，每只小鼠用體積分數0.3%苯巴比妥(35 mg/kg 腹腔內注射)麻醉，腹部備皮消毒后單側組在左下腹取1.5 cm手術切口、雙側組在下腹正中取2 cm小切口；打開腹腔，輕輕拖出睪丸(單側組取左側睪丸、雙側組取雙側睪丸)，牽拉至腹腔，剪切引帶，縫合固定于腹腔內，單側組右側睪丸不做任何處理，縫合腹部切口關腹(1只雙側組小鼠術中死亡)。假手術組小鼠取左下腹切口，打開腹腔牽拉雙側睪丸組織，但不剪切引帶，也不固定，保持雙側睪丸原位，即假手術組。術后第1、3、5天所有小鼠腹腔注射甲硝唑預防感染。所有小鼠在同樣環(huán)境下飼養(yǎng)，即：12/12 h晝夜交替飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(22±1)℃，濕度為(50±3)%，固定時間給予食物、飲用水。

1.3.2取出標本 分別在造模后第10、20、30天取假手術組小鼠5只、單側組小鼠5只、雙側組小鼠6只(第30天雙側組小鼠7只)，測量記錄每只小鼠體重。用體積分數0.3%苯巴比妥(35 mg/kg 腹腔內注射)麻醉，用正中切口進入腹腔，分離腹主動脈采血約10 mL/只，離心(3 000 r/s 5 min)取上清液保存在-80 ℃冰箱內。取雙側睪丸組織清洗后稱重，測量左右、前后及上下經，用體積分數10%甲醛溶液浸泡保存。

1.3.3測量血清INH-B和AMH水平 實驗中取出血清用小鼠專用ELISA試劑盒酶聯免疫法測量相應指標，定量結果選擇對數-對數立方回歸分析模型。

1.3.4睪丸組織病理學檢查睪丸組織 用常規(guī)石蠟包埋，切片及HE染色，光學顯微鏡下觀察依據Johnsen評分標準(表1)進行評分。

表1 Johnsen評分標準

2 結 果

2.1 實驗小鼠體質量及睪丸相關參數實驗小鼠體質量：在不同時間段(術前及術后10、20、30 d)測量3組小鼠體質量進行比較，各組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P<0.05, 表2)。睪丸質量：單側組小鼠健側睪丸質量與患側睪丸質量比較、雙側組平均睪丸質量與假手術組平均睪丸質量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。睪丸體積：單側組健側睪丸體積與患側睪丸體積比較、雙側組平均睪丸體積與假手術組平均睪丸體積比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表2 各個時間段3組小鼠體質量比較

表3 各組小鼠睪丸質量、體積、Johnsen評分比較

2.2 實驗小鼠睪丸組織病理變化3組睪丸組織HE染色發(fā)現，單側組患側睪丸和雙側組睪丸組織均可見生精細胞凋亡。單側組患側睪丸精子數量明顯少于自身對照健側睪丸組織，這一差距在取材時間與造模時間之間間隔較長的小鼠中更明顯，直至有些患側睪丸生精小管僅可見少數精母細胞。雙側隱睪組的睪丸組織與單側組患側睪丸病理變化大致相似。而假手術組隱睪標本發(fā)育可，可見成熟生精細胞、精子發(fā)生過程，生精小管可見多個精子細胞。

Johnsen評分發(fā)現，單側組患側睪丸的評分明顯低于其自身健側，雙側組評分明顯低于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

2.3 各組小鼠血清AMH 、INH-B水平比較所取得血清標本用ELISA酶聯免疫法測量血清AMH和INH-B水平。單側組、雙側組和假手術組血清AMH、INH-B水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表4)，其中假手術組血清兩種激素水平最高、雙側組最低。

表4 各組小鼠血清AMH、INH-B水平比較

3 討 論

1932年，MCCULLAGH 首次從睪丸組織提取某種可抑制腺垂體活動的物質且命名為“抑制素”。抑制素屬于轉化生長因子超家族，其中目前研究較多的INH-B是由α、β兩種亞基組成[6]。而AMH為二聚體糖蛋白，其生理功能是抑制雄性苗勒管的發(fā)育，參與睪丸的分化和發(fā)育[7]。以上兩種激素青春期前均由睪丸支持細胞分泌產生[3-4]。青春期前睪丸生精活動處于靜止狀態(tài)，與成人不同，所以在成人睪丸相關的重要指標，如睪酮、促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)等在兒童時期無法評估睪丸功能，因為在青春期前性腺發(fā)育過程中起到主要作用的是睪丸支持細胞而不是睪丸間質細胞。青春期前血清INH-B和AMH 水平可間接評估睪丸支持細胞的功能即青春期前的睪丸功能[3-4]。但是兒童血清INH-B和AMH水平受不同因素影響，在兒童不同時期水平均不相同，尤其是AMH水平[8]。所以隱睪癥與兩種激素水平的研究中動物實驗更有可信性。

本研究中3組小鼠體質量在各時期變化無差異，說明在同樣環(huán)境中增長無差異性。而睪丸質量及睪丸體積等參數中單側組小鼠患側明顯小于健側，說明在造模成功、造模后患側睪丸因較高溫度環(huán)境的影響發(fā)育比健側睪丸明顯下降，這一差距同樣在雙側組和假手術組的睪丸平均參數中也可得到。形態(tài)學上表現的睪丸萎縮，病理學上是睪丸生殖細胞的凋亡所導致，這一病理改變可直接影響生育功能[9]。為了更好地確定這一病理改變，我們在處死小鼠后取出雙側睪丸組織進行病理評分(johnsen評分)，結果顯示單側組患側睪丸的評分明顯低于其自身對照側，雙側組明顯低于假手術組：說明在單側組患側睪丸及雙側組雙側睪丸組織不僅是體積和質量上與正常發(fā)育的睪丸有差異，在病理改變上也有明顯的差異性，這一差異在取材時間與造模時間之間間隔越長的小鼠中越明顯，睪丸質量和體積的差異性也如此。這一規(guī)律在臨床上也被完全公認，隱睪病史越長的患兒患側睪丸組織萎縮程度越高。WANG等[10]的研究也得出了同樣的結果。

我們在實驗小鼠處死時從腹主動脈取出血液標本進行INH-B和AMH激素水平的檢測，3組小鼠兩種激素水平數據對比后發(fā)現雙側組兩種激素水平最低，假手術組水平最高。這一差異性跟睪丸參數及病理評分完全符合，即睪丸組織受損最嚴重的(睪丸體積和質量最低，病理評分最低)雙側組血清兩種激素水平最低，而睪丸組織發(fā)育沒有受損的假手術組血清兩種激素水平最高，這一差距在隱睪患兒的研究中已被證實[11-12]。不管是小鼠還是人類患兒，單側隱睪病例兩種激素水平高于雙側隱睪者，這可能與單側隱睪組健側睪丸的代償作用有關，但仍達不到正常水平。INH-B和AMH兩種激素均由睪丸支持細胞分泌產生[3-4]，而在本研究中取出睪丸組織病理檢查發(fā)現雙側組中睪丸組織評分非常低，嚴重影響了睪丸的正常發(fā)育，單側組次之，假手術組幾乎是正常發(fā)育狀態(tài)，這可以對應3組血清激素水平的差異性。我們可以得出血清INH-B和AMH激素水平可以間接地標志著睪丸的發(fā)育狀態(tài)，可以評估青春期前隱睪患兒的睪丸功能。

綜上所述，血清INH-B和AMH是一種簡便、準確的血清標志物，可以很好地評估隱睪睪丸組織的功能。雖然睪丸組織的病理檢查是最準確的評估方式，但是隱睪癥患兒無法常規(guī)行睪丸組織活檢，所以需要創(chuàng)傷性小的檢測方式來替代睪丸組織活檢。不幸的是，由于兒童從生長發(fā)育各階段INH-B和AMH水平受到很多因素的影響而不同[13]、無法確定其在某一個時期的正?；虍惓Ｖ捣秶Ｒ虼丝赡苄枰嗟难鍖W、影像學檢查來輔助評估兒童睪丸功能。隱睪患兒睪丸功能血清標志物需要進一步研究并提供準確的激素水平參考范圍，才能改善隱睪癥患兒生育功能等遠期預后。