劉 冬，胡九龍，李坤緣，李 萍，高智謀,2*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036；3. 安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系，安慶 246003)

大豆疫霉可引起大豆根和莖稈腐爛，給大豆種植業(yè)造成巨大風(fēng)險(xiǎn)。在我國多個(gè)省份，如福建、黑龍江和安徽等地均有大豆疫霉根腐病和莖腐病的報(bào)道[1-2]。目前，大豆疫霉菌的防治主要采用化學(xué)藥劑防治[3]，但較長時(shí)間且不當(dāng)使用藥劑致使大豆疫霉產(chǎn)生抗藥性，防治效果下降。為解決病原菌對藥劑的抗性，生物防治技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。一些芽孢桿菌[4]和假單胞菌[5-6]等被用來抑制大豆疫霉且效果良好，生物防治制劑在市場上也有銷售。韓祥東[5]和Wagner[6]等發(fā)現(xiàn)假單胞菌可以防治大豆疫霉，而且可以在大豆根系定殖，具有較好的應(yīng)用前景。芽孢桿菌防治大豆疫病也有報(bào)道，它們分別是高地芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌[4,7]。解淀粉芽孢桿菌FZB42共含11 個(gè)基因簇，占基因組的9%以上，用于合成抗菌代謝產(chǎn)物[7-9]。大量的體外研究普遍認(rèn)為抗真菌活性是由于環(huán)形脂肽桿菌霉素D 和豐原素[7]，同時(shí)其抗菌活性還與非核糖體合成的聚酮類化合物和溶桿菌素[8]等物質(zhì)緊密相關(guān)[9]。目前，以大豆疫霉抑制生物制劑防治大豆疫病的相關(guān)研究仍較少。本研究從健康大豆根際分離鑒定生防菌，并評(píng)價(jià)其抑菌能力和防治效果，以期利用生物防治技術(shù)控制大豆疫病，為降低大豆疫霉造成的經(jīng)濟(jì)損失提供幫助。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

抑菌譜測試所用菌株包括6 株：大豆疫霉（P.sojae）、細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、尖孢鐮孢西瓜專化型（Fusarium oxysporumf. sp.niveum）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）和小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces gramini），均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌學(xué)及植物真菌病害實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的分離 取土壤100 g 左右置于一次性自封袋中，做好標(biāo)記備用。參考Lu 等描述的方法[4]處理樣品，以無菌水媒介完成10 倍稀釋。在生物安全柜中接種，以固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種量為每個(gè)培養(yǎng)皿0.1 mL[5]。以10% V8 培養(yǎng)基評(píng)價(jià)生防菌抑制大豆疫霉的能力，挑取長勢良好的菌株對稱接種于大豆疫霉菌落四周并標(biāo)記生防菌菌株編號(hào)，25 ℃培養(yǎng)3～5 d 觀察結(jié)果并復(fù)篩驗(yàn)證。

1.2.2 生防菌復(fù)篩與抑菌評(píng)價(jià) 以平板對峙法測試

生防菌抑菌能力，于V8 培養(yǎng)基平板中線接種待測生防菌（未接種的為對照組），距離細(xì)菌2.0 cm 處兩邊分別接種大豆疫霉，設(shè)3 個(gè)重復(fù)。大豆疫霉的抑制效果的評(píng)價(jià)參考武自強(qiáng)等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行，計(jì)算公式如下：

另外，抑菌譜抑菌率的測定也按照公式（1）（2）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 發(fā)酵液對大豆疫霉的作用 以離體葉片接種法評(píng)價(jià)發(fā)酵液對大豆疫霉的防治效果[11]。在葉齡相同和大小均勻的大豆葉上噴灑細(xì)菌JDF3 發(fā)酵液原液，每片葉片噴灑量為0.1 mL，以無菌LB 培養(yǎng)基為空白對照。在邊緣打取6 mm 的大豆疫霉菌碟接種于大豆（每組30 個(gè)）葉脈一側(cè)，參考Lu 等[4]報(bào)道的方法評(píng)估防治效果。

1.2.4 大豆疫病防治能力測定 以蛭石為基質(zhì)加適量水拌勻分裝到塑料盆內(nèi)，播撒大豆Willmas 小種，參考Wagner 等[6]的方法種植大豆，并進(jìn)行大豆疫病溫室盆栽生物防治試驗(yàn)，每隔2 d 按每盆灌根細(xì)菌JDF3 20 mL（濃度為1.1×108cfu·mL-1）及發(fā)酵液原液。設(shè)10 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，對照組灌根等量的液體LB 培養(yǎng)基。灌根3 次后，按照每棵1×106mL-1的比例接種大豆疫霉游動(dòng)孢子，觀察和記載嚴(yán)重度，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[4,11-12]。

1.2.5 菌落形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn) 在LB 培養(yǎng)基上（37±1）℃培養(yǎng)24 h 記錄菌落特征，以革蘭氏染色結(jié)合顯微鏡觀察其形態(tài)特征[4]。菌株JDF3 的生理生化試驗(yàn)按照《常見細(xì)菌鑒定手冊》記錄的步驟執(zhí)行[13]。

1.2.6 拮抗細(xì)菌JDF3 分子鑒定 以CTAB 法[14]提取JDF3 基因組DNA，用引物27f 和1492（16S rDNA）[15]以及gyrB 上下游(gyrase subunit B) 引物進(jìn)行擴(kuò)增[16]。體系為50 μL，擴(kuò)增體系成分添加及PCR 溫度條件參考CWBIO 試劑盒說明書。電泳、回收目標(biāo)片段，連接到PMD-19 載體測序[14]，與GenBank 中序列比對，以MEGA5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆疫霉拮抗細(xì)菌篩選

從發(fā)病嚴(yán)重田塊的健康大豆根際土壤分離獲得細(xì)菌JDF3，其與大豆疫霉對峙培養(yǎng)結(jié)果顯示（圖1）大豆疫霉生長受到抑制，抑制率為71.4% ± 2.6%。

圖1 細(xì)菌抑制大豆疫霉生長Figure 1 Bacterial inhibition growth of Phytophthora sojae

2.2 細(xì)菌JDF3 的抑菌譜

細(xì)菌JDF3 對6 種植物病原菌株的抑制結(jié)果見圖2 和表1。細(xì)菌JDF3 對A. tenuissima、G. gramini和C. orbiculare的抑制率在71.25%～77.78%范圍內(nèi)，對其他2 種病原菌的抑制率在58.82% ～ 64.71%之間，表明JDF3 具有廣譜抑菌活性。

表1 細(xì)菌JDF3 的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effects of Bacillus JDF3

圖2 細(xì)菌 JDF3 的抑菌譜Figure 2 Bacteriostasis of Bacillus JDF3

2.3 發(fā)酵液抑制大豆疫霉產(chǎn)生孢子囊

對照大豆疫霉（CK）在誘導(dǎo)下產(chǎn)生大量孢子囊，而發(fā)酵液脅迫的大豆疫霉在誘導(dǎo)下幾乎未產(chǎn)生孢子囊（圖3），這表明發(fā)酵液脅迫可以抑制孢子囊的產(chǎn)生，且抑制率92.8% ± 3.2%。

圖3 發(fā)酵液抑制大豆疫霉產(chǎn)生孢子囊Figure 3 Sporangium production by Phytophthora sojae inhibited by fermentation broth

2.4 發(fā)酵液抑制大豆疫霉侵染

以離體葉片測定細(xì)菌發(fā)酵液對大豆疫霉的防治效果，對照葉片被大豆疫霉侵染，出現(xiàn)明顯的水漬黃褐色病斑（圖4），而噴灑JDF3 發(fā)酵液的大豆葉片未見上述發(fā)病癥狀。即表明菌株JDF3 具有良好的防治大豆疫病的潛力。

圖4 發(fā)酵液抑制大豆疫霉侵染Figure 4 Infection of Phytophthora sojae inhibited by fermentation broth

2.5 菌株JDF3 及其發(fā)酵液對大豆疫病的防治效果

菌株 JDF3 及其發(fā)酵液對大豆疫病溫室盆栽防治效果（圖5）顯示：CK1 和CK2 大豆盆栽苗出現(xiàn)明顯的病斑，感病嚴(yán)重的大豆苗下胚軸處和根莖處呈現(xiàn)棕褐色至黑色，莖稈和葉片干枯脫水，而輕度感病的盆栽大豆苗下胚軸出現(xiàn)黃萎表型，莖基部和主根有輕度棕色病斑，另外也有部分大豆苗未出現(xiàn)病狀。CK1 和CK2 盆栽大豆苗發(fā)病嚴(yán)重度等級(jí)分布在1～4 級(jí)，而菌株JDF3 及其發(fā)酵液處理僅有小部分大豆苗下胚軸出現(xiàn)黃萎或棕黑點(diǎn)，根莖有輕度病斑，發(fā)病嚴(yán)重度大多數(shù)分布在0～1 級(jí)，少數(shù)分布在2 級(jí)。對10 盆大豆苗發(fā)病指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2），對照組1 和2 病情指數(shù)為87.8 和86.1，處理組病情指數(shù)在25.7～35.4 范圍內(nèi)，顯著（P＜ 0.01）低于對照。菌株JDF3 及其發(fā)酵液（BAFB）防治效果分別為70.7%和61.4%。

圖5 細(xì)菌 JDF3 及其發(fā)酵液大豆疫病防治效果Figure 5 Bacillus JDF3 and its fermentation broth control effect of soybean blight

表2 大豆疫病防治效果統(tǒng)計(jì)Table 2 Control effects of soybean blight

2.6 菌株JDF3 的鑒定

菌株JDF3 菌落為淡黃色，表面光滑(圖6A)；革蘭氏陽性，桿狀，其大小1～2 μm × 2～4 μm (圖6B)。15 項(xiàng)生理生化測定結(jié)果陽性（表3，“＋”代表陽性，“-”代表陰性）；結(jié)合菌落形態(tài)特征初步鑒定為芽孢桿菌屬。

表3 菌株JDF3 的生理生化結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemical experiments of the strain JDF3

圖6 菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色結(jié)果（B）Figure 6 Colony morphology (A) and gram staining result (B)of bacteria JDF3

為了準(zhǔn)確的鑒定菌株JDF3，利用細(xì)菌通用引物對菌株JDF3 基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增和測序，序列與3 株芽孢桿菌（貝萊斯芽孢桿菌CP029473.2、解淀粉芽孢桿菌 HG328253.1 和枯草芽孢桿菌KC146707.1）的同源性為100%，但所比對序列與GenBank 中3 株菌株序列的覆蓋度分別為95.0%、99.8%和94.0%。菌株JDF3 與上述3 株芽孢桿菌的序列仍有所區(qū)別。以芽孢桿菌鑒定常用特異性引物gyrB擴(kuò)增獲得1 個(gè)1 259 bp 的片段。測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫序列比對，并在此基礎(chǔ)上建立系統(tǒng)發(fā)育樹；菌株JDF3 與解淀粉芽孢桿菌處于同一分支（圖7），進(jìn)一步確定菌株JDF3 為解淀粉芽孢桿菌。

圖7 基于gyrB 基因序列菌株JDF3 的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 7 Phylogenetic tree of strain JDF3 based on the gyrB gene sequence

3 討論與結(jié)論

本研究分離獲得1 株能有效的抑制大豆疫霉的細(xì)菌JDF3，其對大豆疫病的防治率為70.7%。它具有廣譜抑菌能力，其對細(xì)極鏈格孢、小麥全蝕病菌和瓜蔞炭疽病菌都有較好的抑制效果?；谛螒B(tài)特征、生理生化和gyrB基因序列結(jié)果，菌株JDF3 被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。16S rRNA 基因序列進(jìn)化分析表明3 種芽孢桿菌親緣關(guān)系密切，序列相似性高達(dá)99%，甚至100%[17]，這很好地解釋了本研究中菌株JDF3 與貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌序列高度相似、僅在覆蓋度上存在差異的現(xiàn)象。僅憑16S rRNA 基因序列分析不能有效區(qū)分解淀粉芽孢桿菌及其相近種[17]，文獻(xiàn)顯示保守基因gyrB可用來進(jìn)一步有效地確定它們的分類地位[18]。

芽孢桿菌是主要生防菌來源[4]，特別是解淀粉芽孢桿菌具有優(yōu)異的生物防治效果[7-9]。芽孢桿菌防治大豆疫病可以避免抗藥性的發(fā)生，且可以促進(jìn)大豆的生長，刺激大豆的獲得性防衛(wèi)反應(yīng)誘導(dǎo)其產(chǎn)生獲得性抗病能力[4-5,19-20]。次級(jí)代謝產(chǎn)物在生物防治作用方面扮演著重要角色[7-9]，苯酚和三甲基苯酚對尖鐮孢有抑制效果，7 種酮類揮發(fā)性代謝物可影響土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量的分布[16]。揮發(fā)性成分2-甲基丁酸、3-甲基丁酸和異丁酸等對香蕉枯萎病菌抑制率在65%以上[21]。次級(jí)代謝物癸醇和己醇濃度在≥50 μg·L-1時(shí)對大豆疫霉具有良好的抑制效果[19]，一些酚類物質(zhì)和有機(jī)酸等物質(zhì)對大豆疫霉的抑制作用有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。而其蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肽、豐原素和表面活性等物質(zhì)也表現(xiàn)出抑菌作用[7-9,20-22]。關(guān)于芽孢桿菌JDF3菌株的對大豆疫病的小區(qū)及大田防治效果尚待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。