河北中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤二科

范煥芳 閆嬌嬌△ 李國(guó)川△△ 馬 盼 李德輝 韓長(zhǎng)輝 王崢嶸 王 驍 魏莉瑛(石家莊 050011)

提要 目的：建立夏蠣金消顆粒的質(zhì)量控制方法，為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。方法：采用薄層色譜法(TLC)對(duì)顆粒處方中陳皮、黃芪、石見(jiàn)穿、當(dāng)歸、紫菀、甘草進(jìn)行鑒別；高效液相色譜法(HPLC)對(duì)橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定、方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：TLC法分離度高，展開(kāi)效果好，陰性無(wú)干擾；橙皮苷對(duì)照品含量在1.015～5.075 μg之間時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)RSD值均小于2.0%，加樣回收試驗(yàn)RSD值為0.77%，平均回收率為98.17%。3批夏蠣金消顆粒中橙皮苷含量分別為1.37、1.38、1.48，平均RSD值為1.28%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定，重現(xiàn)性高，可為夏蠣金消顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

夏蠣金消顆粒是河北省中醫(yī)院腫瘤二科治療肺癌的中藥復(fù)方制劑，由清半夏、陳皮、茯苓、石見(jiàn)穿、牡蠣、黃芪、沙參、當(dāng)歸、蜜紫菀、蜜款冬花、貓爪草、川貝母、生甘草13味中藥組成，具有化痰解毒、益氣養(yǎng)陰的功效，長(zhǎng)期臨床研究表明，夏蠣金消顆粒能明顯改善肺癌患者咳嗽、咳痰、胸痛等癥狀，并且降低化療后毒副反應(yīng)[1]。夏蠣金消顆粒在臨床應(yīng)用廣泛、療效確切，但目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為了進(jìn)一步明確其中的有效成分、含量，建立全面可靠的質(zhì)量控制方法，本研究除利用薄層色譜法(TLC)對(duì)顆粒處方中陳皮、黃芪、石見(jiàn)穿、當(dāng)歸、紫菀、甘草進(jìn)行定性鑒別外，還采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)顆粒中含量豐富、專屬性強(qiáng)的指標(biāo)性成分橙皮苷進(jìn)行定量分析，為夏蠣金消顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 KQ2200E型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，ZF-90型暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，F(xiàn)A2104N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，LC-15C島津液相色譜儀(蘇制05000111號(hào))。

1.2 藥品與試劑 橙皮苷(批號(hào)110721-201014，20 mg)、黃芪甲苷(批號(hào)110781-201717，20 mg)來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。對(duì)照藥材：當(dāng)歸(批號(hào)120927-201617，0.5 g)、紫菀(批號(hào)120956-200504，2 g)、甘草(批號(hào)120904-201620，1 g)、黃芪(批號(hào)120974-201612，1 g)、石見(jiàn)穿(批號(hào)121579-201001，10 g)，均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。夏蠣金消顆粒樣品(批號(hào)：20190305、20190315、20190326)及陰性對(duì)照所用藥材均來(lái)自河北省中醫(yī)院。乙腈、磷酸均為色譜純，水為蒸餾水，乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、甲酸、三氯甲烷、甲苯、正己烷等試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)用薄層板 (1)硅膠G板(青島海洋化工廠)；(2)自制含羧甲基纖維素鈉(CMC)的薄層板：取5 g CMC，緩慢加入盛有1 000 mL蒸餾水的三角瓶中，置于磁力攪拌器上，溫度70 ℃～80 ℃，轉(zhuǎn)速適中，溶解后靜置。按硅膠G∶上述溶液=1∶3的比例，用自動(dòng)薄層制板器制成厚度4 mm，20×10 cm的薄層板，晾干，于105 ℃烘干，放置干燥箱中；(3)自制含1%氫氧化鈉的薄層板：取上述(2)中制備好的溶液100 mL，加入1%氫氧化鈉，溶解后，其余方式同(2)。

2 薄層鑒別方法及結(jié)果

2.1 夏蠣金消顆粒的制備 夏蠣金消顆粒采用的是傳統(tǒng)濕法制粒，生藥加8倍水，煎煮2次，每次2 h，藥液濃縮后經(jīng)60%乙醇沉淀、噴霧干燥，加輔料糊精、潤(rùn)濕、過(guò)篩即得[2]。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 陳皮的薄層色譜鑒別[3]：取3批次顆粒細(xì)粉各5 g，加甲醇50 mL，充分震蕩使其混勻，放置水浴上加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干后，加入5 mL甲醇溶解殘?jiān)?，制備供試品溶液；取不含陳皮的陰性藥材，同法制成陰性?duì)照溶液；另稱取0.407 5 g橙皮苷對(duì)照品，加1 mL甲醇，制成濃度為0.407 5 mg/mL的對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液2 μL、陰性對(duì)照溶液2 μL、對(duì)照品溶液3 μL，在硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1.5∶1)，展距約7 cm，晾干后噴三氧化鋁顯色劑，放置于紫外線(365 nm)下檢視，對(duì)照品色譜、供試品色譜在相同位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

注：1～3.三批次供試品；4.陰性對(duì)照；5.橙皮苷對(duì)照?qǐng)D1 陳皮薄層色譜圖

2.2.2 黃芪的薄層色譜鑒別[4]:取3批次顆粒細(xì)粉各5 g，加入30 mL 50%甲醇，30 min超聲處理，紗布濾過(guò)，濾液蒸干，以50 mL水溶解殘?jiān)?，移入分液漏斗中，用水飽和的正丁醇溶?0 mL萃取2次，合并萃取液，用50 mL氨試液洗滌2次，取正丁醇液，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作供試品溶液；取不含黃芪的陰性藥材、黃芪對(duì)照藥材5 g，參照供試品溶液配制方法制成陰性對(duì)照溶液、對(duì)照藥材溶液。另取黃芪甲苷2 mg，加甲醇2 mL，制成濃度1 mg/mL的對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液5 μL、陰性對(duì)照溶液2 μL、對(duì)照藥材溶液3 μL、黃芪甲苷對(duì)照品溶液10 μL，在自制的以羧甲基纖維素鈉(CMC)為黏合劑的硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為氯仿∶甲醇∶水(14∶5∶1)的下層溶液，展距約9 cm，顯色劑為10%硫酸乙醇，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，后置于紫外線(365 nm)下檢視，供試品色譜在與黃芪對(duì)照藥材、黃芪甲苷對(duì)照品色譜相同位置上，顯示顏色相同的主斑點(diǎn)，陰性無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

注：1～3.三批次供試品；4.陰性對(duì)照；5.黃芪對(duì)照藥材；6黃芪甲苷?qǐng)D2 黃芪薄層色譜圖

2.2.3 石見(jiàn)穿的薄層色譜鑒別[5]:取3批次顆粒細(xì)粉各5 g，加30 mL 75%甲醇，置水浴加熱回流1 h，濾過(guò)，蒸干濾液，殘?jiān)尤? mL 75%甲醇溶解，作供試品溶液；取不含石見(jiàn)穿的陰性藥材、石見(jiàn)穿對(duì)照藥材5 g，按照上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液2 μL，在硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為乙酸乙酯-三氯甲烷-甲苯-甲醇-甲酸(5∶3∶2∶1∶2)，展距約10 cm，顯色劑為三氯化鐵-鐵氰化鉀試液，于日光下進(jìn)行檢視，供試品色譜在與石見(jiàn)穿對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯示顏色相同的主斑點(diǎn)，陰性無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

2.2.4 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別[6]:取3批次顆粒細(xì)粉各5 g，加入30 mL正己烷，30 min超聲處理，濾過(guò)，將濾液濃縮到2 mL，作供試品溶液；取不包含當(dāng)歸的陰性藥材、當(dāng)歸對(duì)照藥材0.25 g，參照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液30 μL、陰性對(duì)照溶液2 μL、對(duì)照品溶液2 μL，在硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為正己烷-乙酸乙酯(8∶1)，展距約7 cm，放置于紫外線(365 nm)下檢視，供試品色譜在與當(dāng)歸對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯示顏色相同的斑點(diǎn)，陰性無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

注：1～3.三批次供試品；4.陰性對(duì)照；5.石見(jiàn)穿對(duì)照藥材圖3 石見(jiàn)穿薄層色譜圖

注：1～3.三批次供試品；4.陰性對(duì)照；5.當(dāng)歸對(duì)照藥圖4 當(dāng)歸薄層色譜圖

2.2.5 紫菀的薄層色譜鑒別[7]:取3批次顆粒細(xì)粉各5 g，加25 mL甲醇，超聲處理30 min，濾過(guò)、濾液蒸干，殘?jiān)尤? mL乙酸乙酯溶解，作供試品溶液；取不含紫菀的陰性藥材、紫菀對(duì)照藥材0.25 g，按供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液15 μL、陰性對(duì)照溶液15 μL、對(duì)照品溶液5 μL，在自制的以CMC為黏合劑的硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展距約9 cm，噴10%硫酸乙醇顯色劑，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，放置于紫外線(365 nm)下檢視，供試品色譜在與紫菀對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯示顏色相同的主斑點(diǎn)，陰性無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖5。

2.2.6 甘草的薄層色譜鑒別[8]:取3批次顆粒細(xì)粉各5 g，加入25 mL乙醚，置水浴上加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)尤? mL甲醇溶解，作供試品溶液；取不含甘草的陰性、甘草對(duì)照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液30 μL、陰性對(duì)照溶液8 μL、對(duì)照品溶液5 μL，在自制的含1%氫氧化鈉的硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展開(kāi)劑為醋酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水(15∶1∶1∶2)，充分飽和15 min，展距約8 cm，以10%硫酸乙醇為顯色劑，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，放置于紫外線(365 nm)下檢視，供試品色譜在與甘草對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯示顏色相同的斑點(diǎn)，陰性無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

注：1～3.三批次供試品；4.陰性對(duì)照；5.紫菀對(duì)照藥材圖5 紫菀薄層色譜圖

注：1～3.三批次供試品；4.陰性對(duì)照；5.甘草對(duì)照藥材圖6 甘草薄層色譜圖

3 含量測(cè)定方法及結(jié)果

3.1 色譜條件 色譜柱：C18柱(5 μm，4.6×200 mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(20%∶80%)；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 溶液制備 (1)對(duì)照品溶液：稱取適量橙皮苷對(duì)照品，放置于容量瓶中，加適量甲醇，超聲5 min，加甲醇定容至10 mL，過(guò)水濾膜，制成質(zhì)量濃度為0.14 mg/mL的對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液：取供試品顆粒，研磨后過(guò)80目篩，取細(xì)粉1 g，加水適量，超聲5 min，定容至25 mL，取上清液，過(guò)水濾膜，即得。(3)陰性對(duì)照溶液：取不含陳皮的陰性對(duì)照，陰性對(duì)照溶液制備方法參照上述供試品溶液。

3.3 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，陰性對(duì)照色譜圖中顯示，在與對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖的橙皮苷峰相應(yīng)位置處無(wú)相同吸收峰，結(jié)果表明專屬性良好，結(jié)果見(jiàn)圖7。

注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；1.橙皮苷?qǐng)D7 HPLC圖

3.4 線性關(guān)系考察 取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容至10 mL，配制濃度為203 μg/ mL的橙皮苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定分別進(jìn)樣5、10、15、20、25 μL，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：y=336 353.62x-20 388.7(r=0.999 9) ，說(shuō)明在對(duì)照品含量在1.015～5.075 μg之間，與峰面積線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表1、圖8。

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果

圖8 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.5 精密度試驗(yàn) 取濃度為0.14 mg/mL的同一對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為10 μL，重復(fù)測(cè)6次，計(jì)算峰面積，最終得到橙皮苷峰面積的RSD值為0.798%，結(jié)果表明，設(shè)備精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性考察 稱取同一批次顆粒細(xì)粉1 g，加水超聲處理，定容至25 mL，于0、2、4、8、12 h分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積，計(jì)算出RSD值為1.351 8%(n=5)，結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性考察 稱取同一批次顆粒細(xì)粉1 g，加水超聲處理，定容至25 mL，平行6份，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算橙皮苷峰面積，得出RSD值為0.85%(n=6)，結(jié)果表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

3.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批次顆粒細(xì)粉9份，每份約0.25 g，每份樣品加入適量橙皮苷對(duì)照品溶液，加水定容至5 mL，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表2，平均回收率為0.981 7%，RSD值0.77%(n=9)，加樣回收率符合要求，該方法回收率良好。

3.9 3批樣品含量測(cè)定 取3批次樣品顆粒，按“3.2溶液制備”方法配制供試品溶液，對(duì)3批次供試品溶液中(批號(hào)：20190305、20190315、20190326)橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。從3批次橙皮苷含量可見(jiàn)，每克樣品顆粒中橙皮苷含量在1.37～1.48 mg，含量相對(duì)穩(wěn)定，但考慮到制備工藝、藥品存放時(shí)間等因素的影響，按含量下降幅度20%計(jì)算，每克樣品中橙皮苷含量不得低于1.09 mg。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (mg)

表3 3批樣品含量測(cè)定 (mg/g)

4 討論

4.1 薄層色譜法(TLC) TLC在《中華人民共和國(guó)藥典》中應(yīng)用普遍且逐漸完善，在中藥質(zhì)量控制中直觀、顯著、分離速度快，占據(jù)重要位置[9]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版中有陳皮、黃芪、當(dāng)歸、紫菀、甘草的薄層鑒別方法，但因劑型、制備工藝及藥物相互作用的影響，操作步驟也不能單純套用，本方法在薄層板的選擇、點(diǎn)樣方式、展開(kāi)劑選擇方面進(jìn)行改良，最終得到了分離度高、重現(xiàn)性好的薄層色譜。

在黃芪、紫菀、甘草的薄層鑒別中，初期色譜均出現(xiàn)拖尾，展出效果差，結(jié)合薄層板硅膠性質(zhì)、黏合劑、pH值的差異，最終選用自制含CMC的硅膠G板、1%氫氧化鈉的硅膠G板，結(jié)果斑點(diǎn)清晰。在黃芪、紫菀薄層鑒別中，點(diǎn)樣方式根據(jù)多次顯色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，由圓點(diǎn)點(diǎn)樣改為橫線少量多次點(diǎn)樣，此方法分離度高，斑點(diǎn)清晰，無(wú)明顯拖尾[10]。當(dāng)歸的薄層鑒別時(shí)，將極易揮發(fā)的乙醚改為用正己烷超聲提取，正己烷-乙酸乙酯為展開(kāi)劑，在此條件下，斑點(diǎn)分離清晰，無(wú)陰性干擾。黃芪展開(kāi)劑選擇氯仿∶甲醇∶水的下層溶液，展開(kāi)劑比例13∶7∶2，存在斑點(diǎn)重疊現(xiàn)象，最終調(diào)整為14∶5∶1，最終發(fā)現(xiàn)在此條件下，斑點(diǎn)分離度好，無(wú)陰性干擾。

4.2 高效液相色譜法(HPLC) 陳皮、半夏之二陳湯，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，為治痰之代表方劑，也被廣泛作為基礎(chǔ)方化裁，應(yīng)用于肺癌的基礎(chǔ)及臨床研究中[11-13]。陳皮中含有多種豐富的化學(xué)成分，如黃酮類、萜類與揮發(fā)油、生物堿類等，有減少炎癥損傷，改善微循環(huán)，保護(hù)肺組織細(xì)胞等作用[14]。陳皮中指標(biāo)成分橙皮苷含量極高，其有抗癌、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[15]。在前期制粒工藝實(shí)驗(yàn)中，就以橙皮苷為考察指標(biāo)，在保證出干膏率同時(shí)最大程度兼顧到夏蠣金消顆粒中的有效成分[2]。測(cè)定證實(shí)，陳皮的指標(biāo)成分橙皮苷提取工藝簡(jiǎn)便，專屬性高、含量穩(wěn)定且無(wú)陰性成分的干擾，能有效確保顆粒中有效成分達(dá)標(biāo)、質(zhì)量穩(wěn)定。

色譜條件選擇：在200～400 nm波長(zhǎng)段對(duì)橙皮苷對(duì)照品、供試品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)合相關(guān)研究[16]，橙皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm時(shí)有最大吸收。流動(dòng)相參考《中國(guó)藥典》及有關(guān)文獻(xiàn)研究，考察甲醇-水、乙腈-磷酸、乙腈-水等系統(tǒng)，最終發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(20%∶80%)時(shí)，分離效果良好，峰形對(duì)稱[17]。

提取溶液選擇：HPLC進(jìn)行橙皮苷的含量測(cè)定時(shí)，分別采用50%甲醇、水2種方式對(duì)樣品進(jìn)行處理，對(duì)比發(fā)現(xiàn)水比50%甲醇溶解性好，兩者所測(cè)得積分面積差異不大，考慮到顆粒本為水溶性物質(zhì)，又處于安全性的考慮，故采用水提取的方式，經(jīng)驗(yàn)證，本研究所建立方法，專屬性強(qiáng)，線性關(guān)系及重復(fù)性良好，精密度、穩(wěn)定性良好。

綜上所述，本研究利用TLC、HPLC對(duì)夏蠣金消顆粒進(jìn)行定性、定量分析，該方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好、應(yīng)用廣泛，可為夏蠣金消顆粒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。