王 廣， 鄒家浩， 張永濤， 李德嫻， 袁宇欣， 余夢琦， 陳 璐， 陳 偉， 李 廣*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，奶羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.陜西省榆林市定邊縣安邊區(qū)域農(nóng)牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，陜西 定邊 718600)

精液冷凍保存技術(shù)的研究與利用，有利于動物遺傳資源保護(hù)，可使精液不受時間、地域的限制，便于開展種畜資源共享和交流，提高優(yōu)良種畜的利用率和延長公畜精子的使用時限。精液保存時，需要添加精液稀釋液保護(hù)精子，尤其是在降溫、冷凍解凍過程中，稀釋液的成分可在一定程度上減輕低溫對精子的損傷[1]，精子的長期保存效果與稀釋液生理參數(shù)(滲透壓和pH值)具有重要的關(guān)系。目前對于山羊冷凍精液的研究主要集中在稀釋液的優(yōu)化組合上，關(guān)于不同pH值、滲透壓的稀釋液對關(guān)中奶山羊精液品質(zhì)及其冷凍效果的方面的研究較少。為此試驗(yàn)設(shè)置了不同pH值、滲透壓的稀釋液探究其對關(guān)中奶山羊精子質(zhì)量的影響，從而為奶山羊精液的冷凍保存技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

關(guān)中奶山羊種公羊：選擇陜西省三原縣某種羊場3只1.5歲齡正常采精種公羊，平均年齡、膘情、體重等組間差異不顯著(P>0.05)，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。

1.2 稀釋液組成

基礎(chǔ)配方第Ⅰ液：葡萄糖3.1 g、乳糖2.8 g、檸檬酸鈉1.8 g、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)0.01 g、檸檬酸0.028 g、雙蒸水100 mL；第Ⅱ液：在第Ⅰ液基礎(chǔ)上加青霉素10萬單位、鏈霉素10萬單位、甘油5 mL、卵黃20 mL。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)在基礎(chǔ)液的基礎(chǔ)上，pH值設(shè)計4個不同的處理組(A1、A2、A3、A4)，其pH值依次為6.7，7.0，7.3，7.6；滲透壓設(shè)計4個不同的處理組(B1、B2、B3、B4)，其滲透壓依次為△0.526 ℃，△0.682 ℃，△0.754 ℃，△0.893 ℃。

1.4 精液采集與處理

運(yùn)用假陰道法采集3只公羊的精液后，立即送至實(shí)驗(yàn)室，在38 ℃下通過顯微檢查，對精子樣本進(jìn)行精子密度和精子活力評估。精子形態(tài)正常，畸形率小于5%，精子活力在0.75以上，密度大于15億/mL的精液可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將合格的精液用的稀釋劑等溫稀釋，放入4 ℃冰箱冷藏2 h。第1次平衡完成后，在4 ℃操作臺內(nèi)進(jìn)行第2次等溫稀釋，然后繼續(xù)在4 ℃冰箱中平衡2 h。平衡完成后，將精液裝入0.25 mL的細(xì)管中，按照特定的冷凍程序?qū)囟葟? ℃降到-140 ℃。然后將細(xì)管浸入-196 ℃的液氮中以完成冷凍過程；解凍時將樣品在38 ℃水浴中解凍35 s，取樣進(jìn)行精子檢測。

1.5 精子品質(zhì)檢測

對降溫前、平衡后與解凍后的精子的活率、復(fù)蘇率、精子頂體完整率、精子畸形率及精子凍后存活時間等指標(biāo)進(jìn)行顯微檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行分類統(tǒng)計，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異顯著性。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值對關(guān)中奶山羊精液保存及冷凍效果的影響

2.1.1 不同pH值對關(guān)中奶山羊精子不同階段活率比較 由表1可見，pH值為7.3時的為平衡后與解凍后的活率最高。

表1 不同pH值處理間精子不同階段活率比較 %

2.1.2 不同pH值對關(guān)中奶山羊凍后活力、復(fù)蘇率和解凍后頂體完整率比較 由表2可見，pH值為7.3時對精子的凍后活率、復(fù)蘇率及解凍后頂體完整率有一定的影響，試驗(yàn)組A3的滲透壓對精子的保護(hù)作用最好。

表2 不同pH值處理間對精子的凍后活力、復(fù)蘇率和解凍后頂體完整率比較 %

2.1.3 不同pH值對不同階段精子存活時間和解凍后保存效果的影響 由表3可見，不同pH值對精子存活時間和凍后室溫存活時間有一定的差異，其中試驗(yàn)組A3凍后室溫存活時間最長，凍后8 h活率最高。

表3 不同pH值對精子存活時間和凍后室溫活率比較

2.2 不同滲透壓對關(guān)中奶山羊精液保存及冷凍效果的影響

2.2.1 不同滲透壓對關(guān)中奶山羊精子不同階段活率比較 由表4可見，試驗(yàn)組B3的滲透壓為△0.754 ℃時，精子平衡后與解凍后的活率最高。

表4 不同滲透壓處理間精子不同階段活率比較 %

2.2.2 不同滲透壓對精子的凍后活力、復(fù)蘇率和解凍后頂體完整率的影響 由表5可見，滲透壓對精子的凍后活率、復(fù)蘇率及解凍后頂體完整率有一定的影響，試驗(yàn)組B3的滲透壓對精子的保護(hù)作用最好。

表5 不同滲透壓對精子的凍后活力、復(fù)蘇率和解凍后頂體完整率比較 %

2.2.3 不同滲透壓對不同階段精子存活時間和解凍后保存效果的影響 由表6可見，不同pH值對精子存活時間和凍后室溫存活時間有一定的差異，其中試驗(yàn)組B3凍后室溫存活時間最長。

表6 不同滲透壓對精子存活時間和凍后室溫活率比較

3 討 論

在關(guān)中奶山羊細(xì)管凍精制作過程中，精子代謝很強(qiáng)烈，能量消耗快，同時代謝產(chǎn)物的積累也會改變環(huán)境pH，導(dǎo)致某些酶的活性被抑制，致使精子喪失受精能力，因此稀釋液pH的控制很重要，精液的pH值可因精子代謝或其它原因而發(fā)生變化，當(dāng)精液pH值降低時，精子的代謝活動減弱，反之，pH上升時，代謝活動增強(qiáng)，能量迅速耗竭，存活時間減少[2]。精液正常pH值是滲透壓，酶系統(tǒng)，電離度趨于穩(wěn)定水平的標(biāo)志，pH值發(fā)生變化就意味著精液受到污染，代謝物積累時pH值降低，造成滲透壓改變，電離度增高，加速精子死亡[3]。為了維持正常代謝活動，精子需要一個適宜的pH值[4]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)稀釋液pH值在7.3時有較高的精子活力。本試驗(yàn)通過調(diào)節(jié)稀釋液中pH值對關(guān)中奶山羊精液進(jìn)行冷凍，發(fā)現(xiàn)不同pH值對精子活力影響較大，從試驗(yàn)結(jié)果來看，精液冷凍過后，pH值為7.3的試驗(yàn)組解凍活力較高，建議在制作凍精時稀釋液的pH值應(yīng)控制在7.3左右。此結(jié)論與祝發(fā)明等[5]對波爾山羊凍精的研究結(jié)果相似，最佳pH值應(yīng)該控制在7.2～7.4.之間，但與Buckrell等[6]建議的羊凍精pH保持在6.8左右有所不同。目前，國內(nèi)對羊冷凍精液pH值相關(guān)研究較少。馬英玉等[7]建議羊凍精稀釋液pH值應(yīng)控制在6.8～7.2之間；丁瑜[8]認(rèn)為pH值過高會影響冷凍精液的保存。當(dāng)稀釋液酸度增大時，精細(xì)胞膜表面的親水基團(tuán)的中心原子，便趨向于形成帶正電荷的陽離子。隨著陽離子半徑的變小，有效核電荷數(shù)增大，親水基團(tuán)的水合作用加強(qiáng)，相應(yīng)穩(wěn)定了精細(xì)胞膜表面的結(jié)合水，在液相結(jié)冰水分子重組時，便可對精細(xì)胞膜起到保護(hù)作用[9]。本試驗(yàn)中基礎(chǔ)液pH值7.3效果最好，這可能是由于精子在pH值6.6～6.8運(yùn)動比較旺盛，能量消耗過快，導(dǎo)致平衡后、解凍后活力較低；另一方面是pH值的調(diào)整引起滲透壓相應(yīng)的變化，導(dǎo)致凍后活力和凍后頂體完整率受影響。從試驗(yàn)可見稀釋液滲透壓稍高對精液保存有利[10]。Tris(三羥甲基氨基甲烷)其pH緩沖范圍在7～9，Tris能使精液的pH值在一定程度上傾向于堿性，從而有利于提高精子活力。多數(shù)稀釋液的pH值為弱堿性，因?yàn)榫涸诒４孢^程中會產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，堿性稀釋液能夠中和一部分酸性物質(zhì)，防止pH值過酸造成精子死亡[11]。在動物的生殖系統(tǒng)中，副性腺的分泌物為偏堿性，剛排出的精子是弱酸性，處于“休眠”狀態(tài)，精子的弱酸性在陰道中被分泌物中和后，精子會解除休眠狀態(tài)，活力增加[12]；分泌物是精子天然的緩沖液，可以抵抗陰道中的酸性物質(zhì)，使精子在陰道內(nèi)部運(yùn)輸、貯存時維持較好的活性和受精能力[13]。在本試驗(yàn)配方中添加了一定量的Tris液，精子的凍后活率及凍后室溫保存8 h后活率較高；檸檬酸是一種有機(jī)酸，具有一定的緩沖作用，在機(jī)體內(nèi)參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝，在本試驗(yàn)配方中添加了一定量的檸檬酸，精子的凍后活率及凍后室溫保存8 h后活率最高，這可能是羊原精中鈉的含量較高[14]，精液中的鈉與稀釋液中檸檬酸結(jié)合，維持精液的pH值與滲透壓，有利于提高活力。

精子的頂體是完成受精過程的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)，頂體完整率越高，存活指數(shù)越大，精子的存活時間越長[15]。精子畸形率高，對受精能力的影響就大。稀釋液的滲透壓對精子的影響很大，過高和過低都會產(chǎn)生不良的影響。在一定范圍內(nèi)，精子對不同滲透壓的稀釋液有逐漸適應(yīng)的能力，但精子對低滲比高滲較為敏感[15-17]。本試驗(yàn)中的精子稀釋液滲透壓為△0.754 ℃時，凍后精子頂體完整率最高、畸形率最低，所以，在配制稀釋液時要特別注意稀釋液的滲透壓調(diào)整。