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      基于近紅外光譜法的綠豆淀粉和蛋白質無損快速檢測

      2022-10-28 06:09:18王富豪郭魯平張曉燕袁星星薛晨晨
      江蘇農(nóng)業(yè)科學 2022年19期
      關鍵詞:決定系數(shù)綠豆預處理

      黃 璐, 王富豪, 郭魯平, 張曉燕, 袁星星, 薛晨晨, 陳 新

      (1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所,江蘇南京 210014; 2.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210095;3.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

      綠豆(L.)又稱青小豆、植豆,起源于亞洲東南部。綠豆是我國主要的雜糧作物,其營養(yǎng)和經(jīng)濟價值較高。在我國栽培歷史長達2 000多年,主產(chǎn)區(qū)在東北、長江下游及黃淮河流域,其適應性廣、抗逆性強的特點,成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)民致富的主要經(jīng)濟作物。綠豆具有清熱、解毒等功效,經(jīng)加工可制成具有藥食同源功效的食材,如綠豆湯、綠豆糕、綠豆餅等,其味道香甜、口感松軟,老少皆宜,同時還具有解毒、降低膽固醇、抗腫瘤和抗炎等生物學功能。綠豆營養(yǎng)豐富,最主要的成分是淀粉,籽粒中淀粉含量約為50%,主要分為抗性淀粉和非抗性淀粉。其中,抗性淀粉可為人類帶來理想的生理健康益處,如降血糖、降低膽固醇和甘油三酯等作用。綠豆淀粉具有熱黏度高、易回生等特性,常被用來制做粉絲、粉皮等。綠豆中蛋白質含量(25%~28%)僅次于淀粉,高于其他常見谷物,是小麥面粉的2.3倍、玉米面的3.0倍、大米的3.2倍、小米的2.7倍,且綠豆蛋白富含賴氨酸、亮氨酸和蘇氨酸3種必需氨基酸,尤其是賴氨酸水平接近雞蛋,是優(yōu)質的植物蛋白來源。

      綠豆中淀粉含量的測定通常采用酶水解法和酸水解法,蛋白質可通過凱氏定氮法、分光光度法或燃燒法進行檢測。常規(guī)化學分析方法用于農(nóng)產(chǎn)品和食品品質檢測通常費時、費力且成本高。近紅外光(NIR)是一種電磁波,其波長介于可見光(VIS)與中紅外光(IR)之間,近紅外譜區(qū)為780~2 500 nm,對C—H、N—H、O—H等基團的振動有強烈的感應。近紅外光譜技術是基于譜區(qū)內所包含的物質信息,快速對有機物質進行定性和定量的物理檢測技術。因其操作簡便、快捷、成本低、無試劑污染等特點而被廣泛研究和應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、石油化工等各個領域。Plans等采用近紅外光譜技術對菜豆皮營養(yǎng)品質性狀進行模型建立,通過模型準確預測豆皮中的膳食纖維、糖醛酸、灰分、鈣和鎂的含量,大大縮短了實驗時間,為育種和品質質量提供了重要的檢測工具。Wang等采用近紅外光譜建立了可快速而準確地預測蠶豆淀粉、蛋白質、油分和多酚含量的模型。此外,近紅外技術已廣泛應用于大豆、油菜、大麥等作物的品質育種中。在美國,近紅外被官方認可用于商業(yè)貿易中分析大豆中主要成分,但對綠豆主要化學成分的預測缺少商業(yè)化模型。

      本研究基于筆者所在課題組保存的大量綠豆資源,參考多年種植的數(shù)據(jù)報告(在省內多點開展種植和農(nóng)藝性狀調查),篩選出100份綠豆核心資源作為試驗材料,利用化學方法測定綠豆淀粉(酸水解法)和蛋白質(凱氏定氮法)含量,基于近紅外技術建立快速檢測模型,用于綠豆育種中蛋白質和淀粉含量的無損檢測,以期為綠豆資源的進一步快速測定和利用提供技術支撐,實現(xiàn)綠豆資源的快速評價,提高育種效率。

      1 材料與方法

      1.1 材料和儀器設備

      試驗材料:供試的綠豆品種(系)由筆者所在實驗室收集并保存,挑選了品質、產(chǎn)地、色澤存在較大差異的100份資源于2020年6月種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院六合實驗基地,2020年9月收獲。2020年10月至2021年5月期間進行綠豆淀粉和蛋白質無損快速檢測研究,試驗地點為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所。本試驗所需試劑均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。

      儀器設備:Matrix-I傅立葉紅外變換光譜儀,購自德國BRUKER公司;K-370全自動凱氏定氮儀,購自瑞士BUCHI公司;Grinder-96高通量組織研磨儀,購自騁克儀器(上海)有限公司;Spark 10M純水儀,購自四川優(yōu)普超純有限公司;AR223CN電子天平,購自奧豪斯儀器有限公司。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 綠豆淀粉及蛋白含量測定 淀粉含量根據(jù)GB 5009.9—2016中酸水解方法進行測定,蛋白含量根據(jù)凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)測定。

      1.2.2 樣品近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集 對100份綠豆樣品在波長800~2 500 nm(4 000~12 000 cm)范圍內進行光譜采集,掃描樣品前,將近紅外光譜儀預熱2 h,以儀器內置參比作為背景校正。開啟旋轉樣品臺,將綠豆樣品放入旋轉樣品池,進行綠豆光譜掃描。為降低由取樣所造成的光譜漂移,減小誤差,每份材料重復裝樣3次進行掃描,裝樣時保持樣品的裝載量、表面平整和實密程度一致。樣品掃描溫度為25 ℃,每個樣品掃描64次,分辨率為8 cm。

      1.2.3 近紅外光譜分析模型的建立 根據(jù)3 ∶1的比例,將100份資源分為校正集和驗證集,75份樣用于模型建立,25份樣用于模型精度檢驗。采用偏最小二乘法(PLS)將化學方法所得的化學值與光譜數(shù)據(jù)相關聯(lián),建立綠豆淀粉和蛋白檢測模型。利用不同的預處理方法對數(shù)據(jù)優(yōu)化,模型的預測效果根據(jù)交叉驗證決定系數(shù)、交叉驗證均方根誤差RMSECV、校正決定系數(shù)、校正均方根誤差RMSEE、外部驗證決定系數(shù)和預測均方根誤差RMSEP等指標確定最優(yōu)模型。

      1.3 數(shù)據(jù)分析

      綠豆淀粉和蛋白含量測定單項試驗重復3次,結果表示為“平均值±標準差”。采用OPUS 6.5軟件建立近紅外光譜與標準化學值之間的數(shù)學模型,并通過預測集對近紅外模型的準確度進行評價,同時采用OriginPro 8軟件進行繪圖。

      2 結果與分析

      2.1 綠豆近紅外光譜圖

      100份整粒綠豆樣品的近紅外原始光譜圖,見圖1。由圖1可知,綠豆在波段12 000~4 000 cm范圍內存在多個吸收峰,不同樣品近紅外光譜圖變化趨勢總體一致,但在近紅外的吸光度有較大差異,有利于建模。近紅外譜區(qū)主要包含2 000 cm以上的基團信息,可檢測樣品中的C—H、N—H、O—H、S—H等基團振動及光譜疊加吸收,這些基團是有機物的重要組成元素,如淀粉和蛋白質。

      2.2 綠豆淀粉和蛋白質化學分析結果

      采用傳統(tǒng)化學分析方法對100份綠豆中淀粉(酸水解法)和蛋白質(凱氏定氮法)含量進行分析測定,由表1、表2可知,樣品中淀粉含量范圍為40.88%~53.62%,蛋白質含量范圍為20.17%~27.38%,淀粉和蛋白質含量的平均值分別為47.36%和23.36%。本研究所用的綠豆資源,是通過比較品質、產(chǎn)地、色澤等相關性狀,挑選了存在較大差異的100份資源。淀粉和蛋白的化學測定結果與前人相關報道相比,有更廣泛的區(qū)間,涵蓋了綠豆種質淀粉和蛋白質含量廣泛的分布范圍。品種的多樣性導致蛋白質和淀粉含量的差異性,數(shù)據(jù)具有較寬的變幅,適合用于近紅外分析模型的建立,有較好的適用性。

      表1 綠豆淀粉和蛋白質含量

      表2 綠豆淀粉和蛋白質化學含量分布

      2.3 模型的建立與優(yōu)化

      使用OPUS軟件,通過偏最小二乘法(PLS)統(tǒng)計方法,考察了不同光譜預處理和譜區(qū)范圍對近紅外模型的影響。通過選擇信息相關性最大的譜區(qū),選擇減少光譜基線偏移、漂移、增加信息量、穩(wěn)定可靠的光譜預處理方法,對于綠豆樣品近紅外數(shù)學模型的精確度是非常重要的。利用軟件的功能和大量的譜區(qū)組合選擇,優(yōu)化出所需的最佳光譜預處理方法和譜區(qū)范圍,從對比驗證的統(tǒng)計結果中選擇最優(yōu)的光譜預處理方法和譜區(qū)范圍用于建立模型(表3)。對于綠豆淀粉,采用無光譜預處理,譜區(qū)范圍11 772.2~7 498.4、6 102.1~4 597.8 cm效果最佳。對于綠豆蛋白,采用一階導數(shù)+MSC,譜區(qū)范圍 9 403.9~6 094.4、4 605.5~4 242.9 cm光譜預處理效果最好。由圖2可知,為通過一階導數(shù)+MSC方式處理后的近紅外光譜,與蛋白質相關信息集中在9 403.9~6 094.4和4 605.5~ 4 242.9 cm波數(shù),表明綠豆樣品間的差異主要來源于此范圍內。

      通過交叉驗證,比較不同光譜預處理和譜區(qū)范圍組合的交叉驗證決定系數(shù)、交叉驗證均方根誤差RMSECV等參數(shù),確定綠豆淀粉和蛋白最優(yōu)模型。由圖3和表3可知,對于綠豆淀粉來說,在無光譜預處理條件下,交叉驗證決定系數(shù)為0.926 9,交叉驗證均方根誤差RMSECV為0.658,模型效果最佳。對于綠豆蛋白質來說,采用一階導數(shù)+MSC建立的模型效果最佳,交叉驗證決定系數(shù)為 0.934 1,交叉驗證均方根誤差RMSECV為0.384。不同光譜預處理和譜區(qū)范圍對不同營養(yǎng)成分的信息貢獻不同, 不同成分近紅外模型的最佳光譜預處理方法和譜區(qū)范圍也不同,每一種營養(yǎng)成分近紅外模型的建立都需要單獨分析和單獨優(yōu)化,才能建立合適的近紅外模型。

      表3 綠豆淀粉和蛋白質模型優(yōu)化

      2.4 綠豆淀粉和蛋白質模型外部驗證與評價

      本研究選用的100份綠豆資源中75份樣品為校正集,25份為驗證集。為驗證模型的準確性,采用未用于建模的、完全獨立的且化學值已知的驗證集中的25份資源對所建模型的精確度進行評價。由圖4可知,剩余25份綠豆種質資源對預測模型進行外部驗證的散點圖,發(fā)現(xiàn)淀粉外部驗證決定系數(shù)為0.935 1(圖4-a),預測均方根誤差RMSEP為0.743,蛋白外部驗證決定系數(shù)為0.921 2(圖4-b),預測均方根誤差RMSEP為0.31,模型預測效果較好,近紅外光譜預測值與真實數(shù)值基本一致,滿足檢測結果,能滿足近紅外用于綠豆淀粉和蛋白質的無損快速檢測。

      3 討論與結論

      淀粉和蛋白質是綠豆中主要的營養(yǎng)物質,分別占40.88%~53.62%和20.17%~27.38%,傳統(tǒng)化學分析方法是用來測定綠豆淀粉和蛋白的常用方法,但化學分析方法通常較為耗時,需要昂貴的化學試劑、專門的檢測設備和熟練的分析人員。本研究選用100份綠豆資源用于近紅外數(shù)學模型的建立,按3 ∶1比例劃分為校正集(75份樣品)和驗證集(25份樣品),通過不同的光譜預處理方法對淀粉和蛋白質的數(shù)學模型進行優(yōu)化。采用無光譜預處理和譜區(qū)范圍11 772.2~7 498.4、6 102.1~4 597.8 cm得到最優(yōu)的淀粉數(shù)學模型,交叉驗證均方根誤差為0.658,交叉驗證決定系數(shù)為0.926 9。采用一階導數(shù)+MSC預處理和譜區(qū)范圍9 403.9~6 094.4、4 605.5~4 242.9 cm得到最優(yōu)的蛋白質數(shù)學模型,交叉驗證均方根誤差為0.384,交叉驗證決定系數(shù)為0.934 1。通過外部檢驗方法對綠豆淀粉和蛋白質的光譜模型進行檢驗,淀粉和蛋白外部驗證決定系數(shù)分別為0.935 1和0.921 2,模型預測效果較好。模型涵蓋了綠豆種質淀粉和蛋白質含量的廣泛檢測分布范圍,有較好的適用性。綠豆淀粉和蛋白質近紅外模型的建立可快速完成對育種材料的品質測定與分析,極大地縮短檢測時間,減小了工作量,且結果準確、可靠,可實現(xiàn)對綠豆資源的快速鑒定與評價,對提高育種效率具有一定意義。

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