何宏濤， 王玉虎， 周洪友， 劉 穎， 趙明敏， 鄭紅麗

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019； 2.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017010)

植物根際促生長(zhǎng)細(xì)菌(PGPR)是存在于植物根際并促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌。生物菌肥能促進(jìn)土壤養(yǎng)分的釋放，改善土壤結(jié)構(gòu)，肥沃土壤，在植物根部大量生長(zhǎng)繁殖，成為優(yōu)勢(shì)菌，產(chǎn)生屏障效應(yīng)，增強(qiáng)植物的抗病性和抗逆性。同時(shí)，這些細(xì)菌的一些代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。已有研究表明，一些微生物能產(chǎn)生生長(zhǎng)素(IAA)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶，乙烯生物合成的前體是ACC，ACC可被1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶降解，從而減少乙烯合成，在提高植物對(duì)非生物脅迫方面起到重要作用。 生長(zhǎng)素調(diào)控著植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)光合作用等。還有一類微生物可以將土壤中的難溶性磷分解，轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的可溶性磷，即解磷菌。

細(xì)菌產(chǎn)生長(zhǎng)素功能于1979年首次被發(fā)現(xiàn)，后出現(xiàn)大量的關(guān)于生長(zhǎng)素產(chǎn)生菌的報(bào)道，已有研究中發(fā)現(xiàn)，有多個(gè)菌屬具有產(chǎn)生長(zhǎng)素的特性。近年來(lái)，為了提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，生產(chǎn)者在生產(chǎn)過(guò)程中大量使用化肥和農(nóng)藥，破壞土壤結(jié)構(gòu)，降低土壤肥力，破壞生態(tài)環(huán)境。生物菌肥越來(lái)越受到人們的關(guān)注。植物根際促生菌對(duì)多種植物具有促生作用。劉濤等研究發(fā)現(xiàn)，從番茄組織及根際分離的細(xì)菌能促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)。

本研究用不同培養(yǎng)基從番茄根際土壤中分離得到番茄優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，從中篩選能高效分泌生長(zhǎng)素、具有解磷作用、對(duì)番茄和馬鈴薯具有促生作用的細(xì)菌，以期為研制生物菌肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品于2021年4月21日采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市賀新草莓園(40.663 199°N，111.775 257°E)的番茄大田。采用五點(diǎn)式取樣法，將番茄植株整株拔起，輕輕抖動(dòng)根際土壤，并用毛刷輕輕刷下根表土壤，裝袋、標(biāo)號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離。

1.1.2 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基、阿須貝培養(yǎng)基、蒙金娜無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷卵磷脂培養(yǎng)基、Salkowski顯色液、產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基等的配制詳情可見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11-13]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根際土壤細(xì)菌的分離 根際土壤細(xì)菌的分離純化：稱取5 g土樣置于裝有玻璃珠的三角瓶中，加入45 mL水，在28 ℃160 r/min條件下?lián)u動(dòng) 30 min，靜置10 min，得土懸液母液，分別稀釋成10、10、10、10、10、10、10倍液，選擇10、10、10、10倍液，涂在LB培養(yǎng)基上，每盤50 μL，每個(gè)梯度重復(fù)3次，根據(jù)外觀、形態(tài)在28 ℃培養(yǎng)2～3 d后，挑出具有明顯特征的菌落，純化并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將分離得到的所有來(lái)自番茄土壤中的細(xì)菌置于50%甘油中，于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

用無(wú)菌牙簽挑取平板菌落在阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)5 d觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。

1.2.2 番茄根際土壤產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株的篩選 采用Salkowski比色法，將純化后的細(xì)菌接種于含有-色氨酸(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，在搖床上以28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，取50 μL菌液滴于96孔板上，并添加50 μL Salkowski比色液。同時(shí)加入-色氨酸培養(yǎng)基和無(wú)細(xì)菌比色液作為空白對(duì)照，加入含生長(zhǎng)素的蒸餾水作為陽(yáng)性對(duì)照，在黑暗中靜置30 min。變紅的菌株是產(chǎn)生生長(zhǎng)素的菌株。

對(duì)具有產(chǎn)生生長(zhǎng)素功能的菌株進(jìn)行定量測(cè)定。36 h后，通過(guò)分光光度法測(cè)定上清液在450 nm處的吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定上清液中生長(zhǎng)素的含量。采用分析純的生長(zhǎng)素繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 番茄根際土壤細(xì)菌溶磷能力測(cè)定 分別在無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷卵磷脂培養(yǎng)基中接種產(chǎn)生長(zhǎng)素的菌株。每株菌在28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌株周圍是否有1個(gè)透明的圓圈，以判斷其是否具有解磷的能力。并測(cè)量透明環(huán)直徑()和菌落的直徑()，并計(jì)算溶磷指數(shù)()。

1.2.4 產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株對(duì)番茄和馬鈴薯幼苗的促生作用 IAA產(chǎn)生菌對(duì)番茄幼苗促生作用測(cè)定方法：挑選飽滿的種子浸種30 min，將濾紙片浸濕，放入干凈的培養(yǎng)皿中，28 ℃放置1～2 d，挑選出芽的種子進(jìn)行播種。播種后1周，挑選生長(zhǎng)均勻的植株采用灌根法接種產(chǎn)生長(zhǎng)素的7株菌(FQD13、FQD16、FQD32、FQD42、FQD47-2、FQD58-1、FQD59)，每組處理6次重復(fù)，以清水處理為空白對(duì)照，不產(chǎn)生長(zhǎng)素的菌株4FQD6#為陰性對(duì)照。將菌株接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 2 d，進(jìn)行灌根。每株番茄每10 d灌菌液10 mL，共3次。30 d后觀察番茄植株生長(zhǎng)情況，分別測(cè)定其株高、地上部分干質(zhì)量以及鮮質(zhì)量，分析不同產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響。

IAA產(chǎn)生菌對(duì)馬鈴薯幼苗的促生作用測(cè)定方法：以產(chǎn)生長(zhǎng)素濃度高的菌株FQD47-2及FQD13為供試菌株，研究其對(duì)馬鈴薯幼苗的促生作用。馬鈴薯播種于基質(zhì)土中，出苗后7 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)均勻的馬鈴薯采用灌根法接種菌液300 mL(菌液制備與番茄促生研究方法一致)，以清水處理為空白對(duì)照，LB培養(yǎng)基處理為陰性對(duì)照，每個(gè)處理6次重復(fù)，25 d后測(cè)量不同處理組植株的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.5 菌株FQD47-2產(chǎn)蛋白酶能力的測(cè)定 挑取少許菌落接種于蛋白酶篩選培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 1 d 觀察能否產(chǎn)生透明圈。

1.2.6 菌株FQD47-2的形態(tài)觀察及生理生化鑒定 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及已鑒定完成的菌株，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括革蘭氏染色、V—P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、丙酸鹽利用試驗(yàn)、-木糖利用試驗(yàn)、-阿拉伯糖利用試驗(yàn)、-甘露醇利用試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解等生理生化測(cè)定。

1.2.7 菌株FQD47-2的16S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 細(xì)菌全基因組序列提取試劑盒提取細(xì)菌DNA后，采用細(xì)菌通用引物7F-1540R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL)為：r-0.125 μL、dNTP 2 μL、10×buffer 2.5 μL、引物各 1 μL、DNA模板1 μL、ddHO補(bǔ)足，反應(yīng)程序：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 40 s、34個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后，送去北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序后得到拼接序列，通過(guò)與BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(=0.05)，GraphPad Prism 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。顯著性差異采用不同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄根際細(xì)菌的分離

采用間接分離法從番茄品種金妃根際土壤中分離得到79株細(xì)菌。在無(wú)氮培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，64株菌株能生長(zhǎng)正常。

2.2 番茄根際細(xì)菌產(chǎn)生長(zhǎng)素研究

采用Salkowski比色法測(cè)定64株在阿須貝培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)的細(xì)菌分泌的生長(zhǎng)素含量。結(jié)果表明，64株細(xì)菌中有7株具有分泌生長(zhǎng)素的能力，占總數(shù)的10.9%(圖1)。由圖2可知，不同菌株分泌的生長(zhǎng)素含量不同。供試菌株產(chǎn)生長(zhǎng)素含量在(2.55±0.08)～(15.64±0.14) μg/mL之間。菌株FQD47-2分泌生長(zhǎng)素的能力最強(qiáng)，為(15.64±0.14) μg/mL；菌株FQD58-1分泌生長(zhǎng)素的能力最弱，為(2.55±0.08) μg/mL。

2.3 番茄根際菌株溶磷能力研究

為進(jìn)一步研究番茄根際菌株的溶磷能力，將7株番茄根限細(xì)菌用牙簽點(diǎn)接于有機(jī)磷及無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上，觀察有無(wú)透明圈產(chǎn)生。結(jié)果表明，7株產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上均無(wú)透明圈產(chǎn)生，5株菌株(FQD47-2、FQD13、FQD42、FQD16、FQD59)具有解有機(jī)磷能力(圖3和表1)。

2.4 番茄根際細(xì)菌對(duì)番茄及馬鈴薯幼苗的促生作用

以分泌生長(zhǎng)素的7株番茄根際細(xì)菌為供試菌株，采用溫室盆栽方式，研究其對(duì)番茄幼苗的促生作用。從圖4和圖5可以看出，供試菌株對(duì)番茄幼苗有不同程度的促生作用。與空白對(duì)照相比，處理組FQD16、FQD47-2、FQD32、FQD58-1、FQD59、FQD42的番茄幼苗植株長(zhǎng)勢(shì)較好，顯著高于空白對(duì)照(<0.05)，其增長(zhǎng)率分別為14.92%、16.87%、18.23%、10.05%、9.74%、9.39%。植株鮮質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，7株處理植株都高于對(duì)空白對(duì)照，地上部分鮮質(zhì)量增幅最高的為FQD47-2，達(dá)到了67.14%，菌株FQD32、FQD42的增幅分別為57.44%、23.00%，地下部分鮮質(zhì)量?jī)H有FQD47-2菌株顯著高于空白對(duì)照，增幅為29.58%。

表1 各菌株溶磷能力測(cè)定結(jié)果

以分泌生長(zhǎng)素含量高的菌株FQD47-2和FQD13為供試菌株，采用溫室盆栽灌根法研究其對(duì)馬鈴薯幼苗的促生作用。從圖6和表2可以看出，與空白對(duì)照相比，F(xiàn)QD47-2和FQD13菌株處理對(duì)馬鈴薯幼苗均具有促生作用，地上部分長(zhǎng)度差異達(dá)到顯著水平，分別增長(zhǎng)了21.26%、22.77%。地上部分及地下部分鮮質(zhì)量結(jié)果表明，F(xiàn)QD47-2和FQD13菌株處理均高于空白對(duì)照，地上部分鮮質(zhì)量分別增加17.64%、16.15%，地下部分鮮質(zhì)量分別增加15.26%、5.72%。地上、地下部分干質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，菌株FQD47-2處理的馬鈴薯幼苗都高于空白對(duì)照組，地上部分干質(zhì)量增加了12.71%，地下部分干質(zhì)量增加了15.00%，菌株FQD13處理的馬鈴薯幼苗干質(zhì)量與對(duì)照相比沒(méi)有明顯變化。

表2 番茄根際產(chǎn)生長(zhǎng)素細(xì)菌對(duì)馬鈴薯幼苗的促生作用

2.5 菌株FQD47-2產(chǎn)蛋白酶能力測(cè)定

把菌株FQD47-2接種于蛋白酶篩選培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示，28 ℃培養(yǎng)24 h后有透明圈產(chǎn)生，證明菌株FQD47-2具有產(chǎn)蛋白酶能力(圖7)。

2.6 菌株FQD47-2的形態(tài)特征及生理生化鑒定

菌株FQD47-2的菌落形態(tài)特征為表面光滑、濕潤(rùn)、乳白色、邊緣整齊(圖8)。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及已鑒定完成的菌株，選取部分生理生化指標(biāo)對(duì)菌株FQD47-2進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌株FQD47-2的生理生化鑒定結(jié)果

2.7 菌株FQD47-2的16S rDNA基因序列鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

為進(jìn)一步明確菌株FQD47-2的分類地位，通過(guò)7F和1540R引物對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的片段大小符合預(yù)期(圖9)。通過(guò)測(cè)序進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)菌株FQD47-2與阿氏芽孢桿菌()的親緣關(guān)系較近并聚為一支(圖10)，結(jié)合形態(tài)鑒定及生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株FQD47-2是阿氏芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

土壤微生物的豐度和種類反映了土壤狀況的好壞，而自生固氮菌的數(shù)量可以反映土壤肥沃程度。氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，固氮菌能夠產(chǎn)生固氮酶，可以固定空氣中的分子態(tài)氮，還原轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的形態(tài)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。促生菌種類有很多，根據(jù)其來(lái)源分為根際促生菌和植物內(nèi)生促生菌，本試驗(yàn)通過(guò)選擇性培養(yǎng)基，從番茄根際土壤中通過(guò)阿須貝培養(yǎng)基初步篩選得到64株細(xì)菌，已有研究表明，一種促生菌同時(shí)具有多種功能作用。陳陽(yáng)從水稻根系分離得到23株內(nèi)生固氮細(xì)菌，5株擴(kuò)增出基因，平板篩選得到1株具有抑制多種病原菌活性的菌株。

現(xiàn)已有大量關(guān)于固氮菌的分離報(bào)道，研究表明，植物促生菌對(duì)植物的促生效用是多方面的，如固氮、溶磷、分泌生長(zhǎng)素。解磷菌是指能將植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用磷的土壤微生物。崔偉國(guó)等從馬鈴薯根際土壤及葉片中分離得到78株細(xì)菌，采用Salkowski比色液顯色法篩選得到58株產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株，其分泌量在 0.80～40.2 μg/mL之間。本研究從64株細(xì)菌中篩選得到7株分泌生長(zhǎng)素的細(xì)菌，36 h后分泌量在(2.55±0.08)～(15.64±0.14) μg/mL之間，低于其他文獻(xiàn)報(bào)道的菌株分泌量。7株分泌生長(zhǎng)素菌株中的5株具有降解有機(jī)磷的能力。根際促生菌分泌生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物生物產(chǎn)量。邢芳芳等從番茄根際土壤中分離得到12株產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株，復(fù)篩得到1株高產(chǎn)生長(zhǎng)素菌株，通過(guò)發(fā)酵液盆栽灌根，結(jié)果表明，HB-1處理組的葉綠素含量和葉片數(shù)均高于清水對(duì)照組，鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均比空白對(duì)照增加，鮮質(zhì)量增幅達(dá)1.16%和13.55%，差異達(dá)到顯著水平，干質(zhì)量增幅達(dá)到2.97%和14.92%。本試驗(yàn)通過(guò)盆栽灌根法研究菌株FQD47-2對(duì)番茄和馬鈴薯幼苗的促生效果，結(jié)果表明，菌株FQD47-2對(duì)番茄和馬鈴薯的株高、根長(zhǎng)、地下部分鮮質(zhì)量和地上部分鮮質(zhì)量具有顯著的促生長(zhǎng)作用。說(shuō)明菌株FQD47-2具有良好的促生潛力，本試驗(yàn)結(jié)果可為生物肥料的研制提供參考。