LC-MS/MS測定青稞中氨基酸的含量及主成分分析

王猛強(qiáng)，邱 城，張?zhí)苽?，李騰飛，李 壯，王 淼，曹 振，王珊珊，鄭鷺飛，金茂俊，王 靜，邵 華，金 芬，佘永新*

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所，西藏拉薩 850000)

青稞是我國青藏高原的主要糧食作物之一，非常適合種植在青海、西藏、四川、甘肅、云南等高海拔地區(qū)，特定的地理環(huán)境和氣候條件，賦予其獨(dú)特的營養(yǎng)成分，具有良好的經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值。青稞中的氨基酸組成成分較為全面，不同地區(qū)、不同品種的青稞其氨基酸的含量差異較大,因此氨基酸的含量常作為評價(jià)青稞中營養(yǎng)價(jià)值重要的指標(biāo)之一。目前青稞中氨基酸含量的檢測主要有氣相色譜法、液相色譜法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、化學(xué)發(fā)光法、近紅外光譜法、熒光光譜法等方法。張紅漫等利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過對水解液的衍生化，實(shí)現(xiàn)了對沙宛子中氨基酸的定量分析；劉百戰(zhàn)等采用毛細(xì)管氣相色譜法，通過氯甲酸乙酯衍生化，實(shí)現(xiàn)了對卷煙中游離態(tài)氨基酸的定量分析；張國華等采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法，通過異硫氰酸苯酯(PITC)作為柱前衍生化試劑，實(shí)現(xiàn)了對蓮霧中15種游離氨基酸的定量檢測；孔祥虹等利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法，通過異硫氰酸苯酯(PITC)衍生法，實(shí)現(xiàn)了濃縮果汁中20種氨基酸的定性定量分析。這些檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，有些方法其分析時(shí)間較長(在1 h以上)、檢測效率低，或者需要柱前、柱后衍生，檢測步驟較為煩瑣等。利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測氨基酸可以解決檢測時(shí)間長、避免衍生化等問題，因此，建立青稞中氨基酸含量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

主成分分析法(PCA)是目前常用的統(tǒng)計(jì)方法，是一種將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)不相關(guān)綜合指標(biāo)的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，其通過數(shù)據(jù)降維，排除眾多信息的相互重疊部分，能夠盡可能多地表征原數(shù)據(jù)特征而不丟失信息。該試驗(yàn)通過建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法測定不同區(qū)域青稞中氨基酸的含量，并結(jié)合主成分分析，評價(jià)不同品種的青稞氨基酸的組成差異，為青稞品種的適應(yīng)性和品質(zhì)特性提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

青稞材料。來自5個(gè)產(chǎn)地的30個(gè)品種，具體材料信息如表1所示。

試劑。鹽酸，分析純，北京百匯佳興試劑公司；甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，美國Fisher公司。標(biāo)準(zhǔn)品甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸(≥98%)，上海源葉生物有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸(≥99%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

儀器。Agilent1200 液相色譜，美國Agilent公司；AB5000三重四級桿質(zhì)譜，美國SCIEX公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本 EYELA公司；電子天平，美國ScienTific Industries公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

表1 青稞試驗(yàn)材料品種及來源地

標(biāo)準(zhǔn)混合液的配制。適量稱取13種氨基酸化合物標(biāo)準(zhǔn)品，溶解在0.1 mol/L鹽酸水溶液中，配制成1.25 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液，保存在-20 ℃冰箱中。

色譜條件。選擇3種不同的分離色譜柱進(jìn)行分離，分別是XBridgeC(5 μm,2.1 mm×150 mm)、XBridgeHILIC(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)、UItimateHILIC Amphion Ⅱ (3 μm，2.1 mm×100 mm),利用分離結(jié)果選定較好的色譜柱。

流動相的優(yōu)化，即采用水相流動相分別為0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、5 mmol/L甲酸銨水溶液，有機(jī)流動相選擇乙腈分別進(jìn)行優(yōu)化；進(jìn)樣體積2 μL;流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃。

質(zhì)譜條件優(yōu)化。該方法的質(zhì)譜條件選擇帶有三重四極桿的質(zhì)譜儀。檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。離子源溫度設(shè)定為450 ℃，碰撞氣(CAD)壓力設(shè)定68.95 kPa，氣簾氣(CUR)設(shè)為241.32 kPa，霧化氣(GS1)壓力設(shè)定為241.32 kPa；輔助加熱氣(GS2)壓力設(shè)定為206.84 kPa。并對各個(gè)氨基酸的前體離子、產(chǎn)物離子、掃描時(shí)間、碰撞電壓等進(jìn)行了優(yōu)化。氨基酸具體的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

樣品前處理。將青稞樣品進(jìn)行超微粉碎，過55目篩子，用密封袋裝好備用，保存在-20 ℃的冰柜中。精密稱取0.1 g青稞粉碎后全粉樣品，精確到0.000 1 g，放入220 mL的玻璃消解管，再加入體積比為1+1的濃鹽酸10 mL，在渦旋儀上振蕩2 min，超聲10 min，進(jìn)行氮吹除氧，迅速關(guān)上蓋子，放到110 ℃的真空干燥箱中進(jìn)行加熱水解，取出水解液后，采用定量濾紙過濾。吸取1 mL進(jìn)行氮吹(或烘干)，再用純水復(fù)溶，稀釋10倍后，過0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測。

利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，采用Excel數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

結(jié)合XBridgeC(5 μm，2.1 mm×150 mm)、XBridgeHILIC(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)、UItimateHILIC Amphion Ⅱ(3 μm,2.1 mm×100 mm)這3個(gè)色譜柱，流動相A選擇0.1%甲酸水、0.2%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B選擇乙腈，分別進(jìn)行分離優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C柱的分離效果較差，在1～3 min分離出色譜峰，色譜柱

表2 質(zhì)譜參數(shù)

接下表

保留能力較差，流動相使用0.1%甲酸水，分離效果較好。最終選擇XBridgeHILIC(3.5 μm,2.1 mm×150 mm)色譜柱，流動相A是0.1%甲酸水，流動相B為乙腈，然后通過調(diào)試流動相洗脫程序，最終確定其梯度洗脫方法如表3所示，能夠較好地分離這13種氨基酸物質(zhì)，其選擇離子色譜圖如圖1所示。

氨基酸的檢測分析主要在將樣品中的多肽和蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行完全水解，使其游離出所有的氨基酸，參照國標(biāo)方法進(jìn)行前處理，確定了水解時(shí)間在12 h、水解溫度在110 ℃時(shí)，氨基酸的水解最為徹底。

表3 梯度洗脫程序

圖1 氨基酸選擇離子色譜圖Fig.1 Selected ion chromatogram of amino acids

取各個(gè)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1 mol/L鹽酸溶解，配制成5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為1.25、2.50、5.00、12.50、65.00 nmol/mL。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。13種氨基酸在1.25～65.00 nmol/mL具有良好的線性關(guān)系，其結(jié)果如表4所示。

表4 13種氨基酸的線性關(guān)系

稱取同一份樣品5次，依據(jù)“..”樣品前處理方法操作，在試驗(yàn)條件下測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表5)，13種氨基酸的方法精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.05%～6.93%，表明該方法有較好的精密度。

表5 精密度試驗(yàn)(n=5)

精密稱取0.1 g樣品9份，分別加入氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為1.25 mmol/mL)20、50、100 μL，結(jié)果表明(表6)，按試樣制備方法處理樣品中13種氨基酸的平均回收率在76.43%～101.39%，RSD≤12.12%。表明該方法有良好的準(zhǔn)確度。

表6 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對30個(gè)青稞品種中氨基酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表7所示，在13種氨基酸中谷氨酸含量最高，對這些青稞樣品中的氨基酸指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，其結(jié)果見表8，主成分分析一共提取出特征根均大于1的5個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別是30.664%、18.933%、13.455%、8.809%、7.937%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為79.798%。由表9可知，主成分1()在甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸上有較多的載荷量，相關(guān)性較大，主成分2()在谷氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸的相關(guān)性較大，主成分3()在丙氨酸、酪氨酸的相關(guān)性較大，主成分4()在苯丙氨酸、亮氨酸的相關(guān)性較大，主成分5()在甘氨酸、蘇氨酸的相關(guān)性較大。

表7 30種青稞中氨基酸的含量

表8 青稞中氨基酸的特征根和方差貢獻(xiàn)率

根據(jù)提取的5個(gè)主成分的成分得分系數(shù)(表10)，利用其特征向量，得到其線性組合如下：

=0107+0076+0204-0011-0237+0001-0036+0209-0224-0002+0153+0131-0013

表9 主成分的載荷系數(shù)

=-0147+0284+0065+0257+0009-0062+0193+0046+0080+0274-0051+0103+0309

=-0167+0125+0129-0091+0037+0504+0362+0024+0051-0013+0210-0196-0176

=0263-0223-0000-0000+0097+0169-0343+0121+0187+0516+0385-0298+0215

=0550-0213+0148+0597+0074+0061+0277-0004+0135+0021-0145+0075-0334

式中，、、、、、、、、、、、、分別代表甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量。

綜合得分是方差貢獻(xiàn)率與成分得分乘積后累加計(jì)算可得，其模型為=0384+0237+0169+0110+0099。由此可以計(jì)算各個(gè)青稞樣品中的綜合得分，并進(jìn)行排序來評價(jià)青稞的氨基酸品質(zhì)。如表11所示，其中西藏品種的藏青2000、喜拉19、藏青16、藏青25、藏青148等綜合得分較高，排名靠前，表明這些青稞品種中氨基酸含量較高，具有很好的適應(yīng)性。

表10 主成分的成分得分系數(shù)

3 結(jié)論

該研究建立了青稞中氨基酸含量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測方法，具有快速便捷、準(zhǔn)確度高、操作簡單等特點(diǎn)，可適用于青稞等谷物中的氨基酸含量分析。結(jié)合主成分分析，評價(jià)了不同地區(qū)青稞品種的氨基酸含量，結(jié)果表明，西藏地區(qū)的藏青2000、喜拉19、藏青16、藏青25、藏青148等品種在不同地區(qū)表現(xiàn)較好，其氨基酸含量較高，具有很好的適應(yīng)性。

表11 不同品種青稞氨基酸的綜合得分和得分排序