畜禽肌纖維發(fā)育規(guī)律及相關(guān)基因研究進展

侯任達，張 潤，侯欣華，王立賢，張龍超

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

人們對于骨骼肌的研究可以追溯到十九世紀中期，即顯微鏡發(fā)明后人們才逐漸認識到骨骼肌的結(jié)構(gòu)。不斷深入的研究為骨骼肌形成和調(diào)控機制的探討奠定了基礎(chǔ)，并遍布生理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。骨骼肌起源于中胚層，來源于胚胎發(fā)育過程中的體節(jié)。體節(jié)分化成皮肌節(jié)和生骨節(jié)，分別形成骨骼肌和骨骼。許多因子影響著骨骼肌的發(fā)育，比如由周圍環(huán)境分泌的細胞外信號分子Wnt與Shh，或是在肌源性分化中起關(guān)鍵作用的MRF家族。畜牧場的首要目標(biāo)是用最少的投入生產(chǎn)出盡可能多的優(yōu)質(zhì)肌肉。過去的幾十年里在這方面取得了巨大的進步，這要歸功于那些有利于提高瘦肉率的分子調(diào)控機制及生長促進劑。它們促進了畜禽的肌肉組成，并使得其健康狀況、遺傳及營養(yǎng)水平得到改善。最近幾年人們對于畜禽肉產(chǎn)品的需求也在日益上漲，肌肉產(chǎn)量的增加主要靠肌細胞體積增大，而肌纖維的類型和數(shù)量又直接影響肉質(zhì)，因此了解肌纖維的發(fā)育規(guī)律及其分子機制是很有必要的。本文擬以1987—2022年的肌纖維研究文獻為材料，對肌纖維的發(fā)育過程、類型及基因調(diào)控研究進展進行綜述，為畜禽育種及肉質(zhì)改善提供思路。

1 肌纖維的結(jié)構(gòu)與發(fā)育過程

骨骼肌的基本組成單位為肌纖維。肌纖維是由成肌細胞融合形成的多核細胞，占肌肉總體積的75%～90%，其長度一般在1～40 mm,直徑一般在10～100 μm。肌纖維的數(shù)目在出生前就已經(jīng)決定，出生后數(shù)目不會再發(fā)生變化，但其體積和類型會隨年齡的增長而發(fā)生變化。

肌纖維由肌原纖維平行排列組成。肌原纖維是與肌纖維長軸平行的圓柱形長棒，直徑為1～2 μm，約占肌纖維的60%～70%，每根肌纖維中含有約2 500根肌原纖維。肌漿為肌纖維的細胞質(zhì)，其內(nèi)含有大量的水溶性蛋白質(zhì)、糖元、ATP和酶，主要發(fā)揮儲存釋放和隔離鈣的作用。肌節(jié)是肌原纖維的基本單位，也是肌肉收縮和舒張的最小運動單元。它位于肌原纖維兩條相鄰Z線之間，其含有的肌球蛋白和肌動蛋白對保持骨骼肌的收縮特性非常重要并且也為其他參與信號傳導(dǎo)或能量代謝的蛋白的結(jié)合提供了支架。

脊椎動物骨骼肌的形成與發(fā)育起源于近軸中胚層。在神經(jīng)胚階段的胚胎中，中胚層被細分為4個區(qū)域:脊索中胚層、近軸中胚層、間介中胚層和側(cè)中胚層。脊索中胚層產(chǎn)生脊索，脊索參與神經(jīng)管的形成和前后軸的建立。近軸中胚層位于神經(jīng)管的兩側(cè)，它在顱區(qū)形成顱中胚層，顱中胚層是骨骼、骨骼肌以及面部和顱骨結(jié)締組織的來源。脊索兩側(cè)的背部中胚層生成體節(jié)板，隨后形成體節(jié)。體節(jié)分為腹側(cè)體節(jié)和背側(cè)體節(jié)，腹側(cè)體節(jié)分化形成的生骨節(jié)會生成脊椎和肋骨的軟骨以及骨骼和軀干肌腱；背側(cè)體節(jié)會發(fā)育為生皮肌節(jié)，生皮肌節(jié)上可形成背部肌肉、膈肌、四肢肌肉以及衛(wèi)星細胞。小鼠在胚胎第8天開始形成肌節(jié)，雞從胚胎第2.5天開始形成肌節(jié)。隨后將產(chǎn)生的祖細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖毎?/p>

2 肌纖維的分類與轉(zhuǎn)化規(guī)律

哺乳動物的骨骼肌被分為收縮速度緩慢的暗紅色肌肉和收縮速度快的淺白色肌肉。基于肌球蛋白ATP酶活性對不同pH孵育敏感性的差異可將肌纖維分為Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纖維。隨后Schiaffino等通過免疫印跡和單克隆抗體確定了ⅡX型肌纖維。其中，7、2、1和4基因分別編碼MyHCⅠ型、ⅡA型、ⅡX型和ⅡB型。這4種不同MyHC亞型肌纖維的收縮速度及所使用的能量代謝類型也有所不同，根據(jù)氧化代謝能力依次降低及收縮速度依次增大的順序可分為慢速氧化型(Ⅰ型)、快速氧化型(ⅡA型)、中間型(ⅡX型)和快速酵解型(ⅡB型)。Ⅰ型纖維主要依靠氧化代謝產(chǎn)生ATP，而ⅡX和ⅡB型纖維主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP，其中ⅡB型纖維的糖酵解作用最強。ⅡA型纖維表現(xiàn)出介于Ⅰ型和ⅡB型之間的性質(zhì)。家畜中主要表達4種MyHC異構(gòu)體，即Ⅰ型、ⅡA型、ⅡX型和ⅡB型。但在家禽中主要將肌纖維分為Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型。

不同類型的肌纖維在各種生理特性方面具有顯著差異。Ⅰ型纖維一般直徑較小，外觀較紅，更耐疲勞，有更多的線粒體，且產(chǎn)生比Ⅱ型纖維更小的收縮力。Ⅰ型纖維在冷凍解凍方面也比ⅡA或ⅡX型纖維更穩(wěn)定。酵解型肌纖維比例增加通常伴隨著肌肉品質(zhì)的下降，酵解型肌纖維比氧化型肌纖維更易產(chǎn)生PSE肉(蒼白、柔軟、滲水)。Mashima等研究發(fā)現(xiàn)，在日本黑牛中高含量的MyHCⅠ會導(dǎo)致肌肉中的游離氨基酸含量升高，而這種游離氨基酸會導(dǎo)致肉的味道更加濃郁。反觀口味相對較差的鴨胸肉則全部由快肌纖維組成。

肌纖維類型在畜禽的生長發(fā)育過程中具有相互轉(zhuǎn)化的特性，且這種轉(zhuǎn)化處于動態(tài)平衡中。肌纖維可在多種因素(如年齡、激素、環(huán)境、分子調(diào)控)下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化以適應(yīng)外界環(huán)境。畜禽在剛出生時肌纖維中大部分都為氧化型肌纖維，隨著生長發(fā)育，氧化型肌纖維會逐步轉(zhuǎn)化為酵解型肌纖維。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，膳食補充L-茶氨酸可促進骨骼肌纖維從Ⅱ型向Ⅰ型轉(zhuǎn)變。Yu等研究表明，1C可以直接和MYH1B相互作用，提高其蛋白穩(wěn)定性，從而影響成肌細胞的增殖和分化，并調(diào)節(jié)骨骼肌纖維類型的轉(zhuǎn)變。牛出生后0～12月內(nèi)伴隨著ⅡA型纖維百分比的減少和ⅡX型纖維百分比的增加，12個月后ⅡX纖維百分比降低，Ⅰ型和ⅡA型纖維的百分比增加。Jiang和Ge通過對比公牛和閹公牛的肌纖維性狀進行研究發(fā)現(xiàn)，雄激素可增加肌纖維的平均橫截面積，這種特性與ⅡA型纖維向ⅡX型纖維的轉(zhuǎn)化效率隨年齡的增長而減慢有關(guān)。在禽類中也有關(guān)于肌纖維類型轉(zhuǎn)化的研究，如3基因是調(diào)控雞肌纖維類型組成的重要節(jié)點基因，它的表達與Ⅰ型肌纖維呈顯著負相關(guān)。另外，6在雞胚發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，且能夠促進快肌纖維的表達并抑制慢肌纖維的表達。

3 肌纖維發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因

3.1 MRFs家族

生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)基因家族是肌肉發(fā)生過程中的重要基因家族，涉及肌肉前體細胞的增殖、肌纖維的形成以及出生后的肌肉功能?？刂婆咛ブ泄趋兰〖毎_定和分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的4種核心肌源性調(diào)節(jié)因子為生肌調(diào)節(jié)因子5(myogenic factor 5,5)、生肌決定因子(myogenic determining factor,)、生肌調(diào)節(jié)因子4(muscle regulatory factor 4,4)和肌細胞生成素(myogenin,)。1987年Davis等分離出小鼠的基因，并將一小部分成肌纖維細胞和其他類型的分化細胞轉(zhuǎn)化為骨骼肌系。1989年，被確定為一種使成肌細胞進行肌源性分化的序列，它可使肌細胞退出細胞周期并融合形成多核肌纖維。和的序列同源性隨后使得5和4被發(fā)現(xiàn)。它們都含有一個螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域，并可以識別并結(jié)合E-box序列。其中和5與胚胎期肌細胞的發(fā)育有關(guān)，而和4主要參與肌管的融合，并與肌細胞的終末分化有關(guān)。5、和4被認為是肌源性決定因子，引導(dǎo)祖細胞建立骨骼肌譜系。

在MRFs家族中，5在前體細胞中表達最早，在骨骼肌分化中起關(guān)鍵作用。5占據(jù)肌肉特異性基因的啟動子區(qū)域，在肌節(jié)的形成過程中與其他MRFs協(xié)同表達,從而促進成纖維細胞轉(zhuǎn)化為成肌細胞。此外，它可以穩(wěn)定染色質(zhì)的開放狀態(tài)，促進轉(zhuǎn)錄和的表達。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，犢牛中5僅在肌肉中表達，而成年奶牛中5基因在器官和組織中廣泛表達。位于基因下游的是，它與和4一起激活成肌分化程序。主要參與調(diào)節(jié)肌纖維的融合以及肌細胞的分化,盡管在成年畜禽動物中的表達較低，但它是調(diào)節(jié)骨骼肌有氧和無氧代謝之間能量平衡不可分割的因子，從而促進肌肉的穩(wěn)定性。Ganassi等研究發(fā)現(xiàn)，可通過促進肌細胞融合來平衡纖維的數(shù)量和大小。在增殖的成肌細胞中，的表達受轉(zhuǎn)錄因子3、1/4、3和7的誘導(dǎo)。1as是一種在山羊胚胎中期肌肉中高度表達的circRNA，Li等研究發(fā)現(xiàn)，可加快1as的表達從而促進骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化。4在肌肉譜系的決定和分化中具有雙重作用，表現(xiàn)為雙向表達。在成熟的肌纖維中，和的表達下降，而4繼續(xù)高水平表達，在其中扮演主要的MRFs角色。在體節(jié)早期胚胎骨骼肌的形成過程中，肌祖細胞是從皮肌節(jié)的邊緣衍生出來的，而5和4在祖細胞中起著關(guān)鍵作用。

3.2 Pax3與Pax7

配對盒(paired box, Pax)基因是一個進化保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，在發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和疾病中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)、序列相似性和保守性將基因分為4個亞家族，其中與肌纖維發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子3和7屬于Ⅲ亞家族，他們互為負反饋調(diào)控關(guān)系。3是胚胎骨骼肌早期形成過程中的主要調(diào)節(jié)因子，其在近軸中胚層和上皮性體節(jié)中都有表達，之后局限于皮肌節(jié)。在體節(jié)和肢體中，3和5在肌肉發(fā)生的第一階段調(diào)控的表達。在皮肌節(jié)和遷移到肢體的細胞中，3的表達先于。Der Vartanian等研究表明，3賦予了骨骼肌干細胞對環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)的功能異質(zhì)性。De Morree等研究發(fā)現(xiàn)，不同類型肌肉(比如四肢肌肉和橫膈肌)之間的肌肉干細胞激活率的差異是由3的水平?jīng)Q定的。而7主要表達于中央皮肌節(jié)，在成年后的生長和肌肉再生過程中起主導(dǎo)作用。在老鼠身上，去除這一因子會導(dǎo)致出生后的早期死亡。此外7被證明可以抑制細胞凋亡，敲降7會導(dǎo)致衛(wèi)星細胞和橫紋肌肉瘤細胞死亡率增加。在肌肉損傷時，激活的干細胞表達7和，隨后一部分分化的細胞抑制7的表達并促進表達，從而形成成肌細胞。7的乙?；癄顟B(tài)可調(diào)節(jié)肌肉干細胞的功能和分化潛力從而促進肌肉組織的代謝。Florkowska等研究發(fā)現(xiàn)，7通過調(diào)節(jié)3b和2的表達來平衡細胞周期。7如果缺失，衛(wèi)星細胞和成肌細胞會出現(xiàn)細胞周期的停滯和生肌調(diào)節(jié)因子的失調(diào)。

3和7在肌發(fā)生中表現(xiàn)出部分功能重疊，但3并不能彌補衛(wèi)星細胞和成熟肌纖維中7的缺失。就像衛(wèi)星細胞中均有7的表達，但只有一部分衛(wèi)星細胞表達3，而且通常是和7共表達。表達3的衛(wèi)星細胞的比例在不同的肌肉中也有所不同，比如表達3的衛(wèi)星細胞在前肢和膈肌中頻繁出現(xiàn)，但在后肢中并不常見。

3.3 Wnt和Shh信號通路

Wnt是一個信號分子家族，是一種分泌型生長因子，屬于一個保守的富含半胱氨酸的糖蛋白家族，參與胚胎發(fā)生、肌肉的形成、成人組織修復(fù)和癌癥。在與卷曲蛋白(frizzled, Fzd)受體結(jié)合后，Wnts通過典型途徑激活β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物或通過不同的非典型途徑發(fā)揮作用。在受傷后，許多Wnt配體(如Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt7b)從多種來源(主要是肌纖維和活化的衛(wèi)星細胞)表達和分泌。Wnt1、Wnt3a和Wnt4由神經(jīng)管分泌,而外胚層表達Wnt4、Wnt6和Wnt7a。Wnt在肌纖維的生長發(fā)育中發(fā)揮作用，Marcelle等證明了在體節(jié)形成后，Wnt1和Wnt3a驅(qū)動體節(jié)背部皮肌節(jié)的形成。Wnt信號也可通過2誘導(dǎo)肌源性基因的表達，刺激卵泡抑素，抑制肌生長抑制素的分泌并將負調(diào)控因子1轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，從而促進成肌細胞的分化和融合。Wnt蛋白還能夠調(diào)節(jié)MRFs的表達，根據(jù)之前的研究表明Wnt1優(yōu)先激活Myf5從而誘導(dǎo)肌肉的形成，而Wnt6和Wnt7a優(yōu)先促進MyoD的表達。Wnt信號在肌纖維類型中也發(fā)揮作用，Wnt5可增加慢肌纖維的數(shù)量并減少快肌纖維的數(shù)量，而Wnt4和Wnt11可促進快肌纖維的生成從而增加其數(shù)量。綜上所述，Wnt信號在發(fā)育過程中存在驅(qū)動肌纖維多樣化的內(nèi)在和外在機制并在肌纖維類型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。

音猬因子(sonic hedgehog,)是Hedgehog家族的成員，在軟骨發(fā)生、軟骨內(nèi)成骨和骨骼肌發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在軸下肌發(fā)育過程中，Shh信號維持了肢芽中5和的表達。研究發(fā)現(xiàn)，對做基因敲除小鼠則不會表達和5并且也不會形成外軸肌節(jié)。此外，發(fā)育中的斑馬魚如果缺乏Shh信號體節(jié)會促進3和7的表達，但會阻止后續(xù)的肌源性譜系進展。Shh信號中重要的下游因子Gli在促進有絲分裂中起著重要作用。Voronova等研究表明，2轉(zhuǎn)錄因子不僅能結(jié)合基因元件來調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，還能結(jié)合本身來調(diào)節(jié)其誘導(dǎo)骨骼肌發(fā)育的能力。

以上研究表明，Wnt和Shh信號通路在非特定細胞的肌源性測定中起協(xié)同作用。支持這一觀點的是在5增強子中發(fā)現(xiàn)了Gli結(jié)合位點和Tcf/Lef序列，解釋了Shh和Wnt信號通路是如何共同激活5。

3.4 其他相關(guān)基因

肌生長抑制素(myostatin,)，又稱生長分化因子8(-8)，是肌細胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，也是骨骼肌生長的高度負調(diào)節(jié)因子。首先在肌節(jié)的體節(jié)中表達，隨后在發(fā)育完全的骨骼肌中表達。如果在胎兒時期缺失功能性則會通過肌纖維的增生和肥大導(dǎo)致肌肉質(zhì)量的顯著增加?？梢哉{(diào)節(jié)肌纖維類型的組成，在成年動物中Ⅱ型纖維比Ⅰ型纖維含有更高水平的。有研究表明，在牛中突變會導(dǎo)致“雙肌肉化”表型，即在胎兒時期的肌纖維高度增生，大約是纖維總數(shù)的兩倍，且增生的纖維是ⅡA型和ⅡX型纖維。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，在鴿子胸肌中的表達最為豐富，表現(xiàn)為隨著日齡的增加而增加且與肌纖維橫截面積呈顯著正相關(guān)。

同源盒轉(zhuǎn)錄因子Six家族在脊椎動物中高度保守，共有6個成員(Six1～6)，是軀干和頭部骨骼肌中的上游調(diào)控因子，在肌肉的發(fā)生過程中起主要作用。Grifone等研究發(fā)現(xiàn)，在1/4突變的小鼠在軀體和肢體的肌肉前體細胞中的表達減少。5在肢芽中的表達也是由1通過調(diào)控MEF3位點直接控制的。1對于快肌纖維的生成也有關(guān)鍵作用，Wu等研究發(fā)現(xiàn)，1在Ⅱ型纖維的表達水平顯著高于Ⅰ型。配對樣同源域轉(zhuǎn)錄因子2(paired-like homeodomain transcription factor 2,2)是調(diào)節(jié)頭部和軀干的另一個調(diào)控因子。在肢體和肌節(jié)中，2與5、4協(xié)同調(diào)節(jié)的表達。而在頭部和眼外肌中，它作用于5和4的上游。有研究表明，2和1基因與豬的肉品質(zhì)有關(guān)。Cao等研究也發(fā)現(xiàn)，這兩個基因與雞的胴體體型顯著相關(guān)。

血清應(yīng)答因子(serum response factor,)是MADS box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在骨骼肌、心肌和平滑肌的形成中發(fā)揮作用。在骨骼肌中，它不是胚胎表達和肌生成所必需的，但在成年肌肉穩(wěn)態(tài)中起作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育的過程中，中胚層的形成需要,從而證明了是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Lahoute等通過建立基因敲除模型發(fā)現(xiàn)，突變小鼠逐漸出現(xiàn)ⅡB型肌纖維特異性萎縮，肌肉脂質(zhì)堆積、肌節(jié)組織紊亂和纖維化等問題,在肌肉損傷后突變肌肉會表現(xiàn)出再生纖維變小和持續(xù)性纖維化，而這些特征都與骨骼肌老化所表現(xiàn)出的特征相同，且在小鼠和人類肌肉中的表達隨著年齡而下降?？偟膩碚f，突變會加速骨骼肌的衰老過程。

4 展 望

綜上所述，肌纖維的生長發(fā)育、類型的確立及轉(zhuǎn)換機制相當(dāng)復(fù)雜，涉及很多的通路及生物信號，而多數(shù)信號基因之間又相互影響。雖然已經(jīng)探索出了許多因子及其機制，但還有很多等待我們?nèi)ネ诰颉１热缭谥?，核心增強子和遠端調(diào)節(jié)區(qū)如何相互溝通來精確驅(qū)動的表達，相對貢獻又是如何？再比如許多研究表明轉(zhuǎn)錄因子與表觀遺傳之間存在相關(guān)性，但是哪一個是優(yōu)先的，它們之間的相互作用還沒得到充分的探索。而現(xiàn)有的認知并不能夠全面解釋這些問題，所以還需加強肌纖維基因及信號通路相關(guān)的研究，并將其應(yīng)用到畜禽育種和生產(chǎn)中，提高肉品質(zhì)和產(chǎn)肉量，從而促進畜牧業(yè)的健康發(fā)展。