豬SNP液相芯片10K～50K基因型填充效果研究

陳 宇，邱 奧，張梓鵬，都鶴鶴，白俊艷，王貴江，羅文學(xué)，倪俊卿，李 凱，丁向東*

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471000； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院畜禽育種國家工程實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.河北省畜牧良種工作總站，石家莊 050061； 4.河南省畜牧總站，鄭州 450008)

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是基因組上最常見的一種遺傳變異，是由單個核苷酸突變引起，占所有已知多態(tài)性的90%以上，廣泛存在于基因組中。其具有密度高、分布范圍廣、遺傳穩(wěn)定、分型簡單、可自動化檢測等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是目前最佳的分子標(biāo)記。已廣泛應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study)和基因組選擇(genomic selection)等遺傳分析和育種應(yīng)用。尤其是基因組選擇，高通量基因型檢測是其實(shí)施的前提，正是由于2006年高通量SNP芯片的推出，基因組選擇才正式應(yīng)用于育種實(shí)踐。SNP芯片標(biāo)記密度對基因組選擇準(zhǔn)確性十分重要，然而高密度SNP芯片在大群體上的應(yīng)用成本很高，為了降低成本，低密度SNP芯片應(yīng)運(yùn)而生，可通過基因型填充將其填充至高密度SNP芯片甚至測序數(shù)據(jù)，兼顧基因型檢測成本和分子育種效率。在基因組選擇育種實(shí)踐中,通過基因型填充技術(shù)，能有效地將低密度芯片填充到高密度水平，并保持相當(dāng)高的填充準(zhǔn)確率，不影響基因組選擇準(zhǔn)確性，從而大大提高了低密度芯片的使用價值和育種效果。

基因型填充技術(shù)就是利用已有的分型信息對實(shí)際未分型的位點(diǎn)進(jìn)行基因型預(yù)測。目前，已經(jīng)發(fā)展了很多基因型填充方法。根據(jù)是否利用家系信息分為兩種，一種是利用群體連鎖不平衡信息構(gòu)建單倍型，相應(yīng)的軟件有FAMHAP、fastPHASE、IMPUTE2、Beagle、PLINK等；另一種是利用系譜信息和標(biāo)記連鎖信息構(gòu)建單倍型，相應(yīng)的軟件有Find-hap、Fimpute、AlphaImpute、PEDIMPUTE等。其中Beagle主要利用隱性馬爾科夫鏈技術(shù)，填充準(zhǔn)確性高，應(yīng)用廣泛。本試驗(yàn)使用Beagle 4.1軟件進(jìn)行填充。

液相芯片是繼凝膠電泳、熒光檢測、固相芯片之后的新型分子檢測技術(shù)，該技術(shù)基于靶向測序基因型檢測(GBTS)技術(shù)，因其能夠使目標(biāo)探針與靶向序列互補(bǔ)結(jié)合從而進(jìn)行定點(diǎn)捕獲，且能夠在液相中同時快速完成成千上萬個探針雜交反應(yīng)的試劑盒，形象稱之為液相芯片。與傳統(tǒng)的基因型檢測技術(shù)和固相芯片相比，液相芯片具有平臺廣適性、標(biāo)記靈活性、檢測高效性、信息可加性、支撐便捷性和應(yīng)用廣譜性等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)先后開發(fā)了豬低密度SNP芯片(專利號：ZL201711190317.6)和豬50K液相芯片(專利申請?zhí)枺?02110359470.7)，用于豬性狀遺傳解析和基因組選擇。雖然從低密度SNP填充至高密度的研究很多，但主要以固相芯片為主，目前液相芯片基因型填充的研究并不多見。為此本研究利用中國農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的豬10K和50K液相芯片，研究液相芯片從10K到50K的基因型填充效果，為其他畜禽相關(guān)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)

本研究中3 761頭豬只均來自河北大好河山養(yǎng)豬科技有限公司的健康大白群體，出生日期在2018—2021年間，日齡160 d左右，體重110 kg左右，采全血后，使用由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的液相50K芯片(包含52 000個SNPs標(biāo)記)進(jìn)行基因型測定。

1.2 基因型質(zhì)量控制

采用 PLINK 軟件對所有個體基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除性染色體和位置未知的位點(diǎn)及位點(diǎn)檢出率(call rate)<90%的SNP，剔除檢出率<90%的個體。質(zhì)量控制后，保留47 890個標(biāo)記和全部個體。

1.3 基因型填充

本試驗(yàn)使用Beagle4.1軟件進(jìn)行基因型填充。填充的流程如下：從質(zhì)控后群體中隨機(jī)抽取100頭大白豬，從50K芯片中抽取標(biāo)記生成10K芯片，作為填充群體。再從剩余群體中分別隨機(jī)抽取800、2 000、3 600個個體作為參考群體，對100頭填充群體進(jìn)行基因型填充。相同流程重復(fù)10次。

基因型填充準(zhǔn)確性是檢驗(yàn)填充效率的一個重要指標(biāo)。本研究用100頭填充群體基因型填充后與原始50K基因型的一致性和相關(guān)系數(shù)衡量填充效果?；蛐鸵恢滦允侵刚_填充的基因型占需要進(jìn)行填充的基因型的比例?；蛐拖嚓P(guān)系數(shù)(Cor)是指推斷的基因型和原始基因型之間的相關(guān)系數(shù)。此外，Beagle 4.1軟件計(jì)算出的理論填充準(zhǔn)確性(DR)也可作為參考。

2 結(jié) 果

2.1 10K和50K芯片的描述性統(tǒng)計(jì)

表1列出了質(zhì)控后2款液相芯片18條常染色體的SNP標(biāo)記數(shù)、平均間距和連鎖不平衡水平統(tǒng)計(jì)。質(zhì)控前液相10K和50K芯片18條常染色體共計(jì)9 823和49 886個位點(diǎn)，質(zhì)控后分別有9 685和47 890個位點(diǎn)，位點(diǎn)的缺失率分別為0.40%和1.58%。如表1所示，液相10K芯片的位點(diǎn)平均間距為226 394 bp，平均連鎖不平衡(r)為0.227；液相50K的平均位點(diǎn)間距為44 231 bp，平均連鎖不平衡為0.258，說明10K與50K液相芯片相比，標(biāo)記間距雖然從44 kb擴(kuò)大到226 kb,但是SNP標(biāo)記間的連鎖不平衡程度卻幾乎沒有下降。雖然大部分染色體50K液相芯片的連鎖不平衡程度高于10K芯片，但是8、12、18號染色體10K芯片的連鎖不平衡程度高于50K芯片。

表1 10K和50K液相芯片各染色體標(biāo)記間距和連鎖不平衡(r2)統(tǒng)計(jì)Table 1 The markers distance and linkage disequilibrium (r2) of 10K and 50K SNP panels on each chromosome

2.2 最小等位基因頻率對填充準(zhǔn)確性的影響

圖1顯示了不同參考群體大小下最小等位基因頻率(MAF)對基因型填充準(zhǔn)確性的影響。從圖1a、1b可以看出，用來反映填充準(zhǔn)確性的兩個指標(biāo)基因型一致性和相關(guān)系數(shù)展現(xiàn)了相同趨勢。MAF為0.05時是填充準(zhǔn)確性的拐點(diǎn)。當(dāng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) MAF 小于 0.05 時，填充準(zhǔn)確性都很低，隨著 MAF 的增加，基因型填充的準(zhǔn)確性急速上升；當(dāng) MAF 大于 0.05 時，雖然填充準(zhǔn)確性依然隨著 MAF 的上升有所增加，但增加幅度明顯減緩。由于 MAF<0.05 的標(biāo)記填充準(zhǔn)確性不高，因此本研究剔除 MAF<0.05 的位點(diǎn)，用于后續(xù)分析。同時，從圖1中也可看出，隨著參考群規(guī)模的增大，相同MAF下的填充準(zhǔn)確性也隨之升高，參考群體越大，填充準(zhǔn)確性越高。

a.MAF對基因型填充一致性的影響；b.MAF對基因型填充相關(guān)系數(shù)的影響a.Impact of MAF on genotype imputation consistency; b. Impact of MAF on genotype imputation correlation coefficients圖1 MAF對基因型填充準(zhǔn)確性的影響Fig.1 Impact of minor allele frequency (MAF) on genotype imputation accuracy

2.3 參考群體大小對填充準(zhǔn)確性的影響

表2列出了刪除10K和50K芯片中MAF<0.05標(biāo)記前后的基因型填充準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，刪除MAF<0.05的標(biāo)記后，3種參考群體規(guī)模下，填充準(zhǔn)確性都提高了。當(dāng)參考群體大小為3 600時，DR、基因型一致性和相關(guān)系數(shù)分別從0.976、0.941和0.922提高到0.978、0.965和0.948。同樣，10次重復(fù)的每個填充準(zhǔn)確性指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差也變小了。參考群體大小為800和2 000時，也是如此。說明刪除MAF<0.05的標(biāo)記可以進(jìn)一步提高填充準(zhǔn)確性。同圖1一樣，表2進(jìn)一步表明了參考群體規(guī)模對填充準(zhǔn)確性的影響?？梢钥闯?，當(dāng)參考群體規(guī)模為800時，基因型一致性和相關(guān)系數(shù)分別為0.907和0.902；當(dāng)參考群體規(guī)模增加至2 000時，基因型一致性和相關(guān)系數(shù)分別為0.939和0.924，相較于800群體，其基因型一致性和相關(guān)系數(shù)分別提升了3.53%和2.44%；繼續(xù)增加參考群體規(guī)模至3 600時，基因型一致性和相關(guān)系數(shù)分別為0.965和0.948，較2 000規(guī)模群體提升了2.77%和2.60%，較800規(guī)模群體提升了6.39%和5.10%。填充準(zhǔn)確性的上升幅度均比較明顯。與基因型一致性和相關(guān)系數(shù)相比，DR雖然也隨著參考群體規(guī)模增大而提高，但是變化幅度不大，參考群體規(guī)模為2 000和3 600時，DR幾乎沒有差異。

表2 刪除MAF<0.05標(biāo)記后填充準(zhǔn)確性變化Table 2 The comparison of the imputation accuracy before and after removal of SNPs with MAF<0.05

圖2a、2b展現(xiàn)了刪除MAF<0.05標(biāo)記后每條常染色體上的基因型一致性(a)和相關(guān)系數(shù)(b),可以看出，參考群體規(guī)模較小時，染色體填充準(zhǔn)確性波動較大，隨著參考群體規(guī)模增大，每條染色體填充準(zhǔn)確性相差不大。

a.參考群大小對基因型填充一致性的影響；b.參考群大小對基因型填充相關(guān)系數(shù)的影響a.Impact of reference population size on genotype imputation consistency; b.Impact of reference population size on genotype imputation correlation coefficients圖2 參考群大小對基因型填充準(zhǔn)確性的影響Fig.2 Impact of reference population size on genotype imputation accuracy

3 討 論

已有很多研究表明，參考群大小會對基因型填充的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響。Lee等使用了3 821頭漢伍牛，以889頭漢伍牛作為填充群體，以其余500、1 000、1 500、2 000、2 000余頭漢伍牛作為參考群體，研究了3個低密度芯片(5K、10K、15K)到高密度(50K)芯片的基因型填充準(zhǔn)確性，結(jié)果表明在參考群體規(guī)模為3 600時，基因型填充的準(zhǔn)確性可達(dá)0.904～0.967。He等在關(guān)于中國荷斯坦奶牛從6K到50K的填充效果研究中，比較了3種不同的填充軟件對3種不同參考群下基因型填充準(zhǔn)確性的影響，結(jié)果表明在fimpute 軟件中，所有情況下都表現(xiàn)最好，從公牛到女兒或半同胞之間的相關(guān)性由0.921提升至0.978。Weng等也在2 108頭中國荷斯坦奶牛3K到7K的填充效果研究中，發(fā)現(xiàn)使用3款填充軟件無論以何種比例奶牛作參考群，Beagle的表現(xiàn)最穩(wěn)定，平均填充準(zhǔn)確性可達(dá)0.90。Badke等用1 800頭大白豬作參考群，從10K填充至60K，平均填充準(zhǔn)確性可達(dá)到0.95。Xiang等研究表明，使用4 263頭大白豬作為參考群，從8K填充至60K，填充準(zhǔn)確性可達(dá)0.94。這與本研究結(jié)果相似，當(dāng)參考群體規(guī)模為2 000和3 600時，10K液相芯片填充到50K液相芯片的準(zhǔn)確性為0.92、0.95(相關(guān)系數(shù))和0.94、0.97(基因型一致性)。本研究用DR、基因型一致性和相關(guān)系數(shù)作為衡量填充準(zhǔn)確性指標(biāo)，相同情況下，DR的值最高，相關(guān)系數(shù)最低，通常使用相關(guān)系數(shù)評價填充準(zhǔn)確性較多。

最小等位基因頻率對基因型填充準(zhǔn)確性的影響也有很多報道。本研究結(jié)果表明，對于較低MAF的填充準(zhǔn)確性會隨著參考群體規(guī)模的增大提高，這是因?yàn)閷τ谳^低的MAF，更大的參考群體可以提供更多的稀有變異的單倍型種類，從而提高填充準(zhǔn)確性。Lee等在研究不同水平下低密度芯片到高密度芯片的填充效果時，發(fā)現(xiàn)在相同MAF下，提高參考群大小能顯著提升基因型填充的準(zhǔn)確性，且MAF等于0.015是該試驗(yàn)填充準(zhǔn)確性的拐點(diǎn)。曾浩南等研究了3款50K芯片填充至測序數(shù)據(jù)MAF對基因型填充準(zhǔn)確性的影響時，發(fā)現(xiàn)MAF等于0.1是該試驗(yàn)填充準(zhǔn)確性的拐點(diǎn)。馬裴裴在芬蘭和瑞典紅牛的混合群體中，比較了幾種填充軟件將標(biāo)記從3K填充到54K時MAF對填充準(zhǔn)確性的影響，發(fā)現(xiàn)無論使用哪種軟件，MAF等于0.05是該試驗(yàn)基因型填充準(zhǔn)確性的拐點(diǎn)。在本試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)MAF為0.05是填充準(zhǔn)確性的拐點(diǎn)，MAF<0.05時，基因型填充的準(zhǔn)確性比較低，遠(yuǎn)小于MAF>0.05時的基因型填充準(zhǔn)確性，當(dāng)MAF>0.05后，基因型填充準(zhǔn)確性會趨于平穩(wěn)，這也與Heidaritabar等和Zheng等的研究結(jié)果相似。在大多數(shù)基于芯片的全基因組關(guān)聯(lián)分析或基因組選擇中，剔除 MAF<0.05 的位點(diǎn)是常用的基因型質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本研究也表明，剔除MAF<0.05的位點(diǎn)后，液相芯片10K到50K的填充準(zhǔn)確性得到提高。因此，液相芯片可同固相芯片一樣，將剔除MAF<0.05的標(biāo)記作為基因型質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

本研究表明，參考群體大小對基因型填充準(zhǔn)確性的影響很大，當(dāng)參考群體由800擴(kuò)大到3 600時，填充準(zhǔn)確性從0.90提高到0.95，10次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差也從0.006下降到0.002(表2)，說明不僅準(zhǔn)確性提高了，而且填充效果穩(wěn)定。進(jìn)行基因型填充時，構(gòu)建單倍型的準(zhǔn)確性影響填充的效果，而參考群體的大小直接影響單倍型的構(gòu)建。如果參考群較小，那么構(gòu)建的單倍型種類可能不完全，填充時目標(biāo)群體的單倍型就可能無法在參考群內(nèi)找到。Pausch等在德系西門塔爾牛群體中分別利用50、100、200和400頭牛作為參考群，將50K芯片填充至700K，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)基因型填充準(zhǔn)確性隨著參考群的增加而增加。He等在中國荷斯坦奶牛群體中，以不同參考群的10%、30%、60%、90%作為參考群，將6K芯片填充至50K，3款填充軟件的基因型填充準(zhǔn)確性都會隨參考群的增大而增大。Weng等也以2 108頭中國荷斯坦奶牛的20%、40%、80%、95%作參考群，從3K填充至7K，基因型填充準(zhǔn)確性逐漸增大。這與本研究的結(jié)果一致。此外，Ghoreishifar等也發(fā)現(xiàn)，在填充群體一定時，參考群由小規(guī)模提升至中等規(guī)模，基因型填充的準(zhǔn)確性提升很大，而當(dāng)參考群繼續(xù)增大至大規(guī)模時，填充準(zhǔn)確性的提升緩慢。這與本研究的結(jié)果相似，在本試驗(yàn)中，隨著參考群體的逐漸增大，基因型填充準(zhǔn)確性的提升幅度會逐漸減小。

本研究探討了豬液相芯片從10K到50K的基因型填充效果，結(jié)果表明，相同參考群體規(guī)模下，液相芯片填充準(zhǔn)確性同研究較多的固相芯片一樣。隨著參考群體規(guī)模的擴(kuò)大，基因型填充的準(zhǔn)確性也會隨之提升；但當(dāng)參考群體擴(kuò)大至一定程度時，繼續(xù)擴(kuò)大參考群體對基因型填充準(zhǔn)確性的提升幅度會變小，但依舊可以提升基因型填充的準(zhǔn)確性。因此，可以適當(dāng)選取參考群規(guī)模，在降低檢測成本的同時，保證基因型填充的準(zhǔn)確性。另外，同固相芯片一樣，MAF<0.05是填充準(zhǔn)確性的拐點(diǎn)，可以在基因型質(zhì)量控制時剔除MAF<0.05位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

基因芯片的低密度化是有效降低測定成本的育種手段，也是國際動物育種的趨勢。將低密度芯片與液相芯片結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)基于檢測成本的大幅降低，有助于推動基因組選擇的實(shí)際應(yīng)用。本研究結(jié)果表明了豬液相芯片從10K填充到50K是可行的，可以大規(guī)模用于基因組選擇，進(jìn)行早期選種，降低基因組選擇育種成本。