潘泓杉，馬高興，裴 斐，馬 寧，仲 磊，趙立艷，胡秋輝,

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為目前商業(yè)化程度較高的植物蛋白，具有成本低廉、易于獲取、氨基酸平衡且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)。凝膠性是大豆蛋白的重要性質(zhì)，由于其水凝膠具有高營(yíng)養(yǎng)、高生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，在食品領(lǐng)域具有營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充、包埋遞送風(fēng)味和活性物質(zhì)等多種應(yīng)用。但純大豆蛋白水凝膠具有力學(xué)性能不足、溶解性差等多種問(wèn)題，限制了大豆蛋白水凝膠在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

熱處理及化學(xué)改性是改善大豆蛋白水凝膠性質(zhì)的較為溫和、方便的方式。利用大豆蛋白的熱變性能使聚合物中分子鏈通過(guò)氫鍵、范德華力等交聯(lián)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以形成更均勻、致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而獲得更穩(wěn)定不易破碎的凝膠結(jié)構(gòu)。有報(bào)道表明添加多糖類大分子與大豆蛋白結(jié)合也可以改善大豆蛋白水凝膠性質(zhì)；劉冉等通過(guò)加入黃原膠（xanthan gum，XG）促進(jìn)大豆蛋白凝膠化形成半互穿網(wǎng)絡(luò)凝膠，提高了大豆蛋白凝膠的熱穩(wěn)定性。Dekkers等通過(guò)高溫及高剪切力作用改善了果糖-大豆蛋白微觀結(jié)構(gòu)和拉伸強(qiáng)度。金針菇多糖（polysaccharides，F(xiàn)VP）作為食用菌中提取的天然多糖，不僅具有益智、免疫活性、抗腫瘤活性等高生物活性，且作為多羥基結(jié)構(gòu)的非凝膠性陰離子多糖具有改善大豆蛋白水凝膠的潛力。

本研究將FVP與SPI混合并進(jìn)行加熱處理，通過(guò)分析水凝膠的結(jié)構(gòu)變化以闡明水凝膠形成過(guò)程及凝膠強(qiáng)度變化的機(jī)理，旨在為大豆蛋白水凝膠高營(yíng)養(yǎng)、寬領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇粉 陜西金碩果業(yè)有限公司。SPI（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥85%）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度99%）、乙二胺四乙酸二鈉（NaEDTA，純度99%）、甘氨酸（Gly，純度99%）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，純度95%） 北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS，純度98%） 上海源葉生物科技有限公司；2-硝基苯甲酸（DNTB，純度95%）、-巰基乙醇（純度98%） 上海麥克林生化科技有限公司；其余所用試劑均為化學(xué)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MCR302 流變儀奧地利 Anton Paar 公司；FreeZone真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇常州國(guó)華電器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；J-1500圓二色光譜儀 日本分光株式會(huì)社；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立高新株式會(huì)社；SpectraMax-190酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；8000差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC） 美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 FVP的提取

參照Yang Wenjian等的方法并稍作修改。將金針菇粉和水以1∶25（g/mL）混合，置于80 ℃水浴浸提5 h，10 752×離心10 min，取上清液。加入Sevag試劑（正丁醇∶三氯甲烷＝1∶4，/）靜置10 min，17 808×離心15 min，取上清液。除蛋白操作重復(fù)3 次以上。向上清液中加入其4 倍體積的95%乙醇溶液沉淀過(guò)夜，濾出的絮狀物用透析袋（截留分子質(zhì)量3.5 kDa）透析至溶液均一狀態(tài)，-20 ℃預(yù)凍后真空干燥得到FVP粗提物。使用Solarbio總糖檢測(cè)試劑盒測(cè)得FVP粗提物中多糖含量為（66.52±1.59）%。

1.3.2 FVP-SPI水凝膠制備

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加5% FVP制備的FVP-SPI（以加入的干粉質(zhì)量計(jì)）水凝膠穩(wěn)定性最高（其余實(shí)驗(yàn)組FVP添加量為0%、2.5%、5%、7.5%）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中FVP的添加量為5%，對(duì)照組XG的添加量也為5%。

將超純水或5%的FVP或XG加入超純水中以400 r/min磁力攪拌至完全溶解，加入SPI充分?jǐn)嚢柚另樆瑹o(wú)顆粒狀，即為SPI、FVP-SPI和XG-SPI冷水凝膠。將冷水凝膠于90 ℃水浴加熱30 min，得到熱處理水凝膠（h-SPI、h-FVP-SPI、h-XG-SPI）。

1.3.3 動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的測(cè)定

參照Sharma等的方法并稍作改動(dòng)，使用MCR 302流變儀對(duì)各冷、熱凝膠進(jìn)行測(cè)定，用PP-50夾具以1 mm的間隙進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用刮板清除多余樣品并使用硅油液封，防止水分揮發(fā)。冷水凝膠在1 Hz、1%應(yīng)力條件下從25 ℃加熱至90 ℃，90 ℃維持30 min，再?gòu)?0 ℃降至25 ℃，最后在25 ℃、應(yīng)力1%、0.1～10 Hz頻率范圍下掃描，以評(píng)估熱處理過(guò)程中水凝膠結(jié)構(gòu)變化過(guò)程。

1.3.4 持水性的測(cè)定

分別精確稱取2 g各水凝膠（）于離心管中，10 000×離心15 min，稱取離心后各水凝膠失去的水的質(zhì)量（），計(jì)算水凝膠持水率：

1.3.5 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

將冷凍干燥的水凝膠粉碎，分別精確稱量2.0 mg各凍干水凝膠粉末于PerkinElmer高壓盤(pán)中，使用DSC儀測(cè)定。溫度變化范圍20～150 ℃；升溫速率10 ℃/min；氮?dú)饬魉?0 mL/min。

1.3.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

使用PBS溶液制備SPI質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的各水凝膠溶液。使用J-1500圓二色光譜儀和石英比色皿。設(shè)置氮?dú)饬魉贋? L/min，在190～240 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，使用Spectra manager分析圖譜軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.3.7 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

使用PBS配制成SPI質(zhì)量濃度為10 μg/mL的各水凝膠溶液，以PBS作為空白對(duì)照，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)射波長(zhǎng)300～500 nm下的熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描速率600 nm/min，狹縫寬度5 nm。

1.3.8 溶解度的測(cè)定

參照Wang Wenjie等的方法測(cè)定水凝膠在不同溶劑下的溶解度，使用的5 種溶劑為：A：蒸餾水；B：Tris甘氨酸緩沖液（pH 8.0，含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly和4 mmol/L NaEDTA）；C：B+2% SDS；D：C+8 mol/L尿素；E：D+1%-巰基乙醇。將1.3.2節(jié)中制備的水凝膠完全浸沒(méi)于上述5 種溶劑并連續(xù)攪拌，以8 000×離心20 min，使用BCA試劑盒測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)含量。計(jì)算水凝膠的溶解度：

式中：為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量；為加入水凝膠的總蛋白質(zhì)質(zhì)量。

水凝膠在溶劑間溶解度的差異表示分子間相互作用力的大小，其中溶劑B、A間代表靜電相互作用，溶劑C、B間代表疏水相互作用，溶劑D、C間代表氫鍵相互作用，溶劑E、D間代表二硫鍵相互作用。

1.3.9 游離巰基含量的測(cè)定

參照Z(yǔ)hang Mingkai等的方法。分別稱取40 mg各凍干水凝膠粉末溶解于pH 8.0的4 mL Tris-Gly緩沖溶液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly和4 mmol/L NaEDTA）中，常溫放置30 min后10 000×離心20 min。取上清液，加入30 μL Ellman試劑溶液（4 mg DTNB溶于1 mL Tris-Gly緩沖溶液），25 ℃反應(yīng)15 min。使用酶標(biāo)儀在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（），使用BCA試劑盒測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（/（mg/mL））。計(jì)算游離巰基含量：

式中：＝13 600 L/（mol·cm），為吸光系數(shù)；為稀釋倍數(shù)。

1.3.10 表面疏水性的測(cè)定

參考Zhong Lei等的方法，用PBS制備不同SPI質(zhì)量濃度（0、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL）的水凝膠溶液。取4 mL水凝膠溶液與20 μL 8 mmol/L ANS混合后避光反應(yīng)20 min測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)484 nm。計(jì)算熒光強(qiáng)度-蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的線性回歸斜率，斜率為蛋白質(zhì)表面疏水性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對(duì)FVP-SPI水凝膠形成過(guò)程流變學(xué)特性的影響

通過(guò)測(cè)定熱處理過(guò)程中水凝膠儲(chǔ)能模量（′）及耗能模量（″）的變化模擬水浴加熱至90 ℃時(shí)FVP-SPI水凝膠的形成過(guò)程。′越高代表水凝膠彈性越強(qiáng)，″越高代表水凝膠黏性越強(qiáng)。如圖1所示，溫度從25 ℃至90 ℃上升過(guò)程中，各水凝膠′和″均呈下降趨勢(shì)，此過(guò)程是蛋白質(zhì)受熱變性過(guò)程。溫度在穩(wěn)定90 ℃的過(guò)程中，各水凝膠′和″呈先緩慢下降后迅速上升的趨勢(shì)，此過(guò)程中SPI本身或與多糖相互交聯(lián)形成新的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使其′和″得到明顯提升，水凝膠結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定、致密。溫度從90 ℃下降至25 ℃過(guò)程中，各水凝膠的′無(wú)明顯變化，″有所下降，表明新的水凝膠結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成，溫度降低也無(wú)法使水凝膠恢復(fù)，所以這種變化并非是可逆的物理變化，而是發(fā)生了斷鍵重組的化學(xué)變化。

圖1 熱處理過(guò)程中水凝膠G′和G″的變化Fig.1 Changes in G′ and G″ of hydrogels during heat treatment

2.2 FVP對(duì)SPI水凝膠持水性的影響

如圖2所示，各水凝膠的持水性有一定差異，其中SPI水凝膠的持水性最差。經(jīng)過(guò)熱處理或添加多糖，各水凝膠的持水性顯著提升（持水率均超過(guò)95%），但這些水凝膠的持水性無(wú)顯著差異（＞0.05）。其中，與SPI水凝膠相比，h-FVP-SPI水凝膠的持水率增加了10.59%。水凝膠的持水性在一定程度上反應(yīng)了水凝膠的抗干擾能力，在實(shí)際應(yīng)用中，水凝膠在受壓、切割等外界干擾下維持內(nèi)部水的吸附和結(jié)合能力非常重要。通過(guò)高速離心可以反映出水凝膠在受壓時(shí)的穩(wěn)定性。這表明添加5% FVP和90 ℃下加熱30 min的處理均能提高水凝膠對(duì)水的吸附和結(jié)合能力，提高水凝膠的穩(wěn)定性和抗干擾能力。此外，F(xiàn)VP對(duì)SPI水凝膠持水性的提升能力與XG無(wú)顯著差異。

圖2 不同水凝膠的持水率Fig.2 Water-holding capacity of different hydrogels

2.3 FVP對(duì)SPI水凝膠熱穩(wěn)定性的影響

如表1所示，各水凝膠的第一個(gè)峰出現(xiàn)在55～58 ℃范圍內(nèi)，這個(gè)小吸熱峰顯示蛋白纖維的“自增強(qiáng)”特性。對(duì)于SPI水凝膠而言，其DSC曲線中的吸熱峰主要?dú)w因于-伴大豆球蛋白及11S球蛋白的溶解或分離。純SPI水凝膠的和在熱處理前后差異不顯著，而添加多糖后，熱處理前后的水凝膠的發(fā)生顯著變化。熱水凝膠樣品的和較冷水凝膠升高。這些結(jié)果說(shuō)明熱處理后，多糖與蛋白發(fā)生交聯(lián)；添加多糖后，多糖與蛋白質(zhì)以非共價(jià)鍵結(jié)合構(gòu)建了更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得其需要更高的變性溫度。Δ和Δ也有相似的變化規(guī)律，其中，h-FVP-SPI水凝膠較SPI水凝膠總焓變提高了25.46%。在熱處理后，水凝膠的Δ和Δ更高；添加FVP的水凝膠比純SPI水凝膠的Δ和Δ更高，這意味著添加FVP的水凝膠更為穩(wěn)定。對(duì)比XG，F(xiàn)VP的添加提高了SPI水凝膠的熱變性溫度且焓變差異不顯著。

表1 不同水凝膠的熱穩(wěn)定性Table 1 Thermal stability of different hydrogels

2.4 FVP-SPI凝膠結(jié)構(gòu)的表征分析

2.4.1 FVP對(duì)SPI水凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

SPI水凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)蛋白質(zhì)分子在部分區(qū)域上通過(guò)多肽鏈在一定方向上盤(pán)繞折疊維持，包括-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲，通過(guò)分子內(nèi)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與連續(xù)相之間的氫鍵保持局部空間排列。如表2所示，與SPI水凝膠相比，F(xiàn)VP-SPI水凝膠的-螺旋含量無(wú)顯著差異，-折疊含量增加了12.9%；h-FVP-SPI水凝膠的-螺旋含量減少了16.8%，-折疊含量增加了17.2%。在蛋白質(zhì)或多肽的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)中，肽鏈?zhǔn)歉叨扔行虻?，排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)轉(zhuǎn)換的分裂。其中破壞-折疊所需能量大于-螺旋，所以h-FVP-SPI水凝膠穩(wěn)定性高于SPI，F(xiàn)VP能提高SPI水凝膠的穩(wěn)定性。維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力是分子內(nèi)氫鍵和二硫鍵。-折疊是羰基氧（—C＝O）與相同或相鄰的肽鏈酰胺氫（—CONH—）之間通過(guò)肽鍵形成的規(guī)則氫鍵。加入FVP后和熱處理后，各水凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)均有所變化，這說(shuō)明FVP的加入和熱處理能改變SPI水凝膠的氫鍵和二硫鍵結(jié)構(gòu)。FVP可以通過(guò)與SPI分子的靜電和共價(jià)鍵的方式改善水凝膠的結(jié)構(gòu)，提高SPI水凝膠的機(jī)械能。

表2 不同水凝膠中SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Table 2 Secondary structure contents of soy protein in different hydrogels

2.4.2 FVP對(duì)SPI水凝膠三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，與SPI水凝膠相比，h-SPI水凝膠的最大熒光強(qiáng)度增加，并伴有最大熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)（）的輕微藍(lán)移；FVP加入后，h-SPI水凝膠的最大熒光強(qiáng)度進(jìn)一步提高（h-FVP-SPI）。這表明FVP和SPI水凝膠在加熱條件下的靜電或共價(jià)結(jié)合改變了SPI的折疊狀態(tài)。蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸殘基可以被280 nm的紫外線激發(fā)出熒光。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸帶有不同的側(cè)鏈基團(tuán)，具有不同的熒光光譜，其中色氨酸熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。色氨酸的熒光發(fā)射很容易受到某些因素影響而改變，包括相鄰位置的氨基酸殘基、用于溶解蛋白質(zhì)的溶劑以及色氨酸殘基在整個(gè)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置。蛋白質(zhì)中經(jīng)常發(fā)生從酪氨酸到色氨酸殘基的能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致酪氨酸殘基的熒光淬滅和色氨酸殘基的熒光增加。熱處理及FVP對(duì)SPI水凝膠熒光強(qiáng)度的增加表明，熱處理和FVP改變了SPI的三級(jí)結(jié)構(gòu)；其中，色氨酸作為一種疏水性氨基酸，在疏水性增強(qiáng)的過(guò)程中逐漸被安排在蛋白質(zhì)分子的外側(cè)，使SPI內(nèi)部的色氨酸殘留物逐漸暴露在SPI分子的表面上。

圖3 不同水凝膠熒光強(qiáng)度的變化Fig.3 Fluorescence intensity of different hydrogels

2.4.3 FVP對(duì)SPI水凝膠分子間作用力的影響

如圖4所示，疏水相互作用、二硫鍵和靜電相互作用是形成h-FVP-SPI復(fù)合水凝膠的主導(dǎo)力，這個(gè)結(jié)果與Wang Wenjie等的報(bào)道相似。在熱處理或添加FVP后，SPI水凝膠的靜電相互作用、氫鍵都得到了明顯的加強(qiáng)；熱處理也能使SPI水凝膠的二硫鍵作用得到顯著增強(qiáng)。FVP是一種帶負(fù)電荷的多糖，而SPI帶正電荷，F(xiàn)VP與SPI的加熱混合促進(jìn)了靜電相互作用的發(fā)生。因此，靜電作用在h-FVP-SPI水凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成中發(fā)揮了主要作用，這種靜電相互作用的增強(qiáng)可以被用于解釋持水性的增強(qiáng)。此外，由于FVP的加入引入了大量的—OH，使得氫鍵的作用增強(qiáng)，這導(dǎo)致親水作用的減弱和疏水能力的增強(qiáng)，疏水相互作用結(jié)果與熒光光譜的結(jié)果一致。二硫鍵的形成可能會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和疏水性，所以后續(xù)進(jìn)行了水凝膠表面疏水性的測(cè)定。

圖4 不同水凝膠在不同溶劑下的溶解度Fig.4 Solubility of different hydrogels in different solvents

2.4.4 FVP對(duì)SPI水凝膠巰基含量的影響

如圖5所示，各水凝膠的總巰基含量無(wú)顯著差異（＜0.05），說(shuō)明不同處理下的水凝膠總巰基含量無(wú)變化。熱處理后水凝膠的游離巰基含量顯著高于未加熱水凝膠。游離巰基含量是衡量蛋白質(zhì)聚集的指標(biāo)。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中共價(jià)鍵中裂解能量最低的屬于二硫鍵和C—S鍵，加熱至90 ℃的過(guò)程能夠使-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白變性，11S大豆球蛋白中至少有20 個(gè)二硫基，在蛋白質(zhì)變性時(shí)易發(fā)生變化，并且大豆球蛋白酸性和堿性多肽之間的S—S被破壞，引發(fā)巰基-二巰基交換反應(yīng)。此外，h-FVP-SPI水凝膠與h-XG-SPI水凝膠中游離巰基含量顯著高于h-SPI，這表明在FVP和XG加入后，二硫鍵介導(dǎo)的交聯(lián)更少，或者兩種多糖的加入抑制了巰基的氧化。由于多糖中硫酸酯、硫醇基團(tuán)的引入，在加熱過(guò)程中二硫鍵和硫醇-二硫化物的互換增加了蛋白質(zhì)中多肽鏈的表觀鏈長(zhǎng)，從而影響蛋白質(zhì)凝膠化過(guò)程。熱處理后水凝膠游離巰基含量增加的結(jié)果與分子間作用力中巰基作用的結(jié)果相互驗(yàn)證。

圖5 不同水凝膠的游離巰基與總巰基含量Fig.5 Contents of free sulfhydryl group and total sulfhydryl group in different hydrogels

2.4.5 FVP對(duì)SPI水凝膠表面疏水性的影響

如圖6所示，加入FVP和熱處理均能顯著提高SPI水凝膠的表面疏水性。熱處理后水凝膠的表面疏水性顯著高于未熱處理的水凝膠（＜0.05），這是由于大多數(shù)非極性氨基酸可以形成疏水性核心并掩藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，而熱處理促使蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸暴露，此結(jié)果與溶解度測(cè)定結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的表面疏水性取決于其分子質(zhì)量、形狀、分子內(nèi)和分子間交聯(lián)以及氨基酸的組成和排列。ANS和蛋白表面疏水區(qū)域結(jié)合后產(chǎn)生的熒光變化能反映暴露在蛋白質(zhì)分子表面疏水基團(tuán)的數(shù)量，這很大程度決定了蛋白質(zhì)溶解性。表面疏水性的增加表明熱處理及添加FVP降低了SPI水凝膠的溶解性，這與蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果中疏水性氨基酸向蛋白質(zhì)表面排列的結(jié)果相互驗(yàn)證，與疏水相互作用結(jié)果一致。

圖6 不同配方水凝膠的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of different hydrogels

3 結(jié)論

添加5% FVP并通過(guò)90 ℃水浴加熱30min制備FVPSPI水凝膠。在加熱過(guò)程中，SPI發(fā)生熱變性，發(fā)生不可逆的化學(xué)交聯(lián)形成更為致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。疏水相互作用、二硫鍵和靜電相互作用是形成h-FVP-SPI復(fù)合水凝膠的主導(dǎo)力。從二級(jí)結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)VP大量—OH的引入導(dǎo)致氫鍵的增加使-螺旋向-折疊轉(zhuǎn)變，二硫鍵的增加同時(shí)影響二級(jí)結(jié)構(gòu)并伴隨著三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，使h-FVP-SPI水凝膠表面疏水性增大，凝膠強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性得到顯著提高。FVP對(duì)SPI水凝膠的穩(wěn)定性和持水性的增強(qiáng)作用與XG無(wú)差異顯著性，熱穩(wěn)定性顯著提高。本實(shí)驗(yàn)為高活性菌物多糖在SPI水凝膠的應(yīng)用提供了一定理論依據(jù)。