高產(chǎn)糖苷酶非釀酒酵母菌株篩選、鑒定及其發(fā)酵過程中酶活性變化

任學(xué)梅，姚紅紅，嚴(yán)幻汝，祝 霞,2，楊學(xué)山,2,

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

源自葡萄果實(shí)的香葉醇、芳樟醇、-松油醇等揮發(fā)性單萜類物質(zhì)，具有多種花香和水果氣息，是決定干白葡萄酒品種香氣特征的關(guān)鍵性化合物。但它們多以無味的糖苷鍵合態(tài)香氣前體形式存在，其中雙糖苷約占80%以上，其次為單糖苷形式（約10%），三糖苷含量最低。鍵合態(tài)前體物可在發(fā)酵過程中由--葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）和其他糖苷酶的協(xié)同作用下水解釋放。在葡萄酒釀造過程中添加外源性--葡萄糖苷酶可能引發(fā)非特異性水解反應(yīng)或形成不良風(fēng)味，而使用可以分泌--葡萄糖苷酶的酵母菌作為發(fā)酵劑，能引發(fā)鍵合態(tài)品種香氣物質(zhì)的充分釋放，提升葡萄酒的區(qū)域典型性和感官?gòu)?fù)雜性。與釀酒酵母（）不同，一些非釀酒酵母（non-）菌株可以分泌高活性的--木糖苷酶（EC 3.2.1.37）、--阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55）和--鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40），先裂解雙糖苷鍵生成相應(yīng)的單萜基--葡萄糖苷，再通過--葡萄糖苷酶的作用釋放單萜，從而提高葡萄酒品種的香氣和風(fēng)味。López等篩選出高產(chǎn)--葡萄糖苷酶和--木糖苷酶酵母菌株，通過釀酒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種優(yōu)選非釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，總萜烯含量增加1.1～1.3 倍，Padilla等研究發(fā)現(xiàn)，由于--葡萄糖苷酶的活性，接種菌株增加了-松油醇、香葉醇和橙花醇的濃度。總體而言，現(xiàn)在大部分研究主要集中在非釀酒酵母菌株分泌的--葡萄糖苷酶活性對(duì)葡萄酒香氣復(fù)雜性的影響，然而對(duì)菌株的雙糖苷酶活性，特別是發(fā)酵過程中酶活性的菌株差異探究還十分欠缺。

本實(shí)驗(yàn)從寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵葡萄汁中分離酵母菌株，以WL培養(yǎng)基和七葉苷培養(yǎng)基初步評(píng)價(jià)非釀酒酵母菌株的--葡萄糖苷酶活性，再通過對(duì)硝基苯酚（-nitrophenol，-NP）法定量測(cè)定并篩選雙糖苷酶活性較高的菌株；利用模擬干白葡萄酒發(fā)酵體系，評(píng)估優(yōu)選本土非釀酒酵母菌株在模擬葡萄汁發(fā)酵過程中酶活性動(dòng)態(tài)變化。本實(shí)驗(yàn)旨在獲得釀造適應(yīng)性優(yōu)良的高產(chǎn)糖苷酶非釀酒酵母菌株，為進(jìn)一步提升葡萄酒香氣品質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄樣品與商業(yè)酵母

葡萄樣品均采自寧夏賀蘭山東麓不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)。采自閩寧立蘭酒莊的霞多麗、赤霞珠，還原糖質(zhì)量濃度分別為243.06、241.52 g/L，pH值分別為3.91、3.74，可滴定酸質(zhì)量濃度（以酒石酸計(jì)）分別為5.15、5.81 g/L；采自青銅峽西鴿酒莊的霞多麗、赤霞珠，還原糖質(zhì)量濃度分別為246.37、234.42 g/L，pH值分別為3.86、3.94，可滴定酸質(zhì)量濃度分別為5.64、5.09 g/L；采自甘城子古城人家酒莊的赤霞珠，還原糖質(zhì)量濃度為236.21 g/L，pH值為3.89，可滴定酸度質(zhì)量濃度為5.71 g/L。

346商業(yè)非釀酒酵母 法國(guó)Lallema公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸粉、2%瓊脂，自然pH值（5.4），121 ℃滅菌20 min。

WL培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。稱取80.25 g WL培養(yǎng)基，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min，pH 5.5±0.2。

賴氨酸培養(yǎng)基購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司。稱取66.3 g賴氨酸培養(yǎng)基于1 L含8.4 mL乳酸鉀的蒸餾水中，用乳酸調(diào)節(jié)pH值（pH 5.0±0.2），121 ℃滅菌20 min。

七葉苷篩選培養(yǎng)基：0.3%七葉苷、0.05%檸檬酸鐵、0.2% NaCl、0.05% MgSO·7HO、0.1% KHPO，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1%吐溫80、1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、0.3%硝酸銨、0.05% MgSO·7HO、0.4% KHPO。

模擬葡萄汁：240 g/L葡萄糖、1.5 g/L酵母浸粉、0.3 g/L檸檬酸、5 g/L酒石酸、5 g/L-蘋果酸、2 g/L(NH)SO、5 g/L KHPO、0.4 g/L MgSO、0.2 g/L NaCl、0.05 g/L MnSO、50 mg/L SO，用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH值至3.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

七葉苷、NP、對(duì)硝基苯基---葡萄糖苷（-nitrophenyl---glucopyranoside，NPG）、對(duì)硝基苯基---鼠李糖苷（-nitrophenyl--rhamnopyranoside，NP-Rha）、對(duì)硝基苯基---阿拉伯糖苷（-nitrophenyl---arabinopyranoside，NPAra）、對(duì)硝基苯基---木糖苷（-nitrophenyl--xylopyranoside，NP-Xyl） 上海源葉生物科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；500051S立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-300-II生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)器械醫(yī)療有限公司；H2050R高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Genesis 10S紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI Veriti公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄汁自然發(fā)酵過程中還原糖測(cè)定及酵母菌株的分離純化

自然發(fā)酵：在葡萄成熟期采收葡萄并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。無菌狀態(tài)下將新鮮成熟度好的葡萄破碎，裝入5 L無菌發(fā)酵罐中，添加30 mg/L SO，進(jìn)行自然發(fā)酵。霞多麗葡萄于20 ℃發(fā)酵，赤霞珠葡萄于25 ℃發(fā)酵，每天定期搖瓶2 次。

于不同發(fā)酵時(shí)期（2、4、6、8、11、15 d）定時(shí)取樣，利用梯度稀釋涂布平板法，依次稀釋6 個(gè)梯度，振蕩搖勻后吸取100 μL 3 個(gè)梯度（10、10、10）稀釋液涂布于WL培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，每個(gè)梯度做3 個(gè)重復(fù)。

菌株分離與純化：根據(jù)WL固體培養(yǎng)基菌落的顏色及形態(tài)，對(duì)菌株進(jìn)行初步區(qū)分，分別放在40%的滅菌甘油中，于-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)期葡萄汁的還原糖含量。

1.3.2 菌株產(chǎn)--葡萄糖苷酶定性篩選

將200 μL滅菌的七葉苷培養(yǎng)基添加到96 孔培養(yǎng)板中，接入20 μL活化后的供試菌液，于28 ℃培養(yǎng)24 h。按照顯色等級(jí)測(cè)定供試菌株產(chǎn)--葡萄糖苷酶的活性，深黑色記為“++++”表示最高酶活性，黑色記為“+++”表示中酶活性，深灰色記為“++”表示低酶活性。

1.3.3 糖苷酶活性定量測(cè)定

1.3.3.1--葡萄糖苷酶活性測(cè)定

參考錢超方法繪制NP標(biāo)準(zhǔn)曲線，以NP濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。

參考López等方法測(cè)定酶活性并略作修改。供試菌株在YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)72 h。取5 mL發(fā)酵液于離心管中，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，即得粗酶液。取0.5 mL粗酶液、1.2 mL pH 5.0檸檬酸-磷酸緩沖液（含0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鈉）、0.25 mL 5 mmol/L-NPG混合，于50 ℃培養(yǎng)30 min，加入1 mL 1 mol/L NaCO終止反應(yīng)，在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照組為未進(jìn)行反應(yīng)的樣品。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最終酶活性。酶活性單位（U）定義為pH 5.0、50 ℃條件下，1 min水解-NPG產(chǎn)生1 μmol-NP所需的酶量。

1.3.3.2 雙糖苷酶活性定量測(cè)定

參考López等方法，并略作修改。取0.25 mL粗酶液，0.6 mL檸檬酸-磷酸緩沖液（0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鈉，pH 5.0），分別與0.13 mLNP-Rha、NP-Ara、NP-Xyl（5 mmol/L）混合后，于50 ℃反應(yīng)30 min，加入1 mL 0.5 mol/L NaCO終止反應(yīng)，在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照組為未進(jìn)行反應(yīng)的樣品。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算最終酶活性。酶活性單位（U）定義為pH 5.0、50 ℃條件下，1 min水解NP-Rha、NPAra、NP-Xyl產(chǎn)生1 μmol-NP所需酶量。

1.3.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

參考田進(jìn)等方法，并略作修改，提取基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

1.3.5 優(yōu)選非釀酒酵母在模擬葡萄汁發(fā)酵中發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及糖苷酶活性動(dòng)態(tài)變化

1.3.5.1 模擬葡萄汁發(fā)酵過程中發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

在20 mL固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）小瓶中進(jìn)行純菌種微規(guī)模發(fā)酵（3 個(gè)獨(dú)立的重復(fù)），發(fā)酵小瓶中含有16 mL模擬葡萄汁。將6 株優(yōu)選非釀酒酵母、、3 株、于YPD液體培養(yǎng)基活化，以1×10CFU/mL接種量接種。用頂部裝有穿孔硅塞和一次性注射器針頭密封小瓶，并在20 ℃下進(jìn)行發(fā)酵。通過質(zhì)量減輕監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程，如果連續(xù)3 d沒有觀察到進(jìn)一步的質(zhì)量減輕，則發(fā)酵被評(píng)估為“停滯”。每天通過測(cè)定CO釋放造成的瓶子質(zhì)量損失監(jiān)測(cè)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)。

1.3.5.2 模擬葡萄汁發(fā)酵過程中糖苷酶活性測(cè)定

選擇產(chǎn)酶性能較好的6 株非釀酒酵母菌株，按1×10CFU/mL接種量接種于500 mL含有400 mL模擬葡萄汁的錐形瓶，以商業(yè)非釀酒酵母346做對(duì)照，于20 ℃恒溫發(fā)酵。每天監(jiān)測(cè)各發(fā)酵液--葡萄糖苷酶、--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶的活性變化，酶活性測(cè)定參考1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、Origin 2018軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，利用Tbtools v1.09876軟件對(duì)酶活性測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄汁自然發(fā)酵期間還原糖變化和WL培養(yǎng)基形態(tài)鑒定

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，來自寧夏賀蘭山東麓不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)的霞多麗和赤霞珠葡萄汁在自然發(fā)酵條件下還原糖質(zhì)量濃度逐漸降低；且發(fā)酵15 d，霞多麗和赤霞珠葡萄汁均在本土菌株的作用下，順利完成自然發(fā)酵（還原糖質(zhì)量濃度≤4 g/L）。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)期霞多麗（A）和赤霞珠（B）葡萄發(fā)酵醪液還原糖變化Fig.1 Changes in reducing sugar in fermented must as a function of fermentation time

根據(jù)不同酵母菌株在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)和顏色，對(duì)其進(jìn)行初步區(qū)分。如圖2所示，將分離的酵母菌株分為20 類。每一類別隨機(jī)挑取15～20 株具有代表性的單菌落，共計(jì)分離并收集821 株酵母菌株。發(fā)酵前期（1～4 d）主要以和發(fā)揮主導(dǎo)作用，發(fā)酵中期（5～8 d）酵母多樣性增加，出現(xiàn)、、、等酵母菌株，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌株的多樣性降低，逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，完成后續(xù)乙醇發(fā)酵。

圖2 自然發(fā)酵液中分離得到的酵母菌在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of yeasts isolated from spontaneously fermented grape must on WL medium

2.2 酵母菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶定性篩選分析

酵母菌株可以水解糖苷配基和低聚糖之間的-糖苷鍵，其中起作用的第一類酶是--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶等雙糖苷酶；隨后，--葡萄糖苷酶作用于--葡萄糖苷釋放葡萄糖和芳香糖苷配基。因此，--葡萄糖苷酶是芳香配基釋放的重要限止因子。將保存?zhèn)溆玫?21 株酵母菌株活化，以七葉苷為底物，通過顯色反應(yīng)對(duì)酵母菌株產(chǎn)--葡萄糖苷酶水平進(jìn)行篩選。如圖3所示，將96 孔板中顯色較深的菌株挑選出在賴氨酸培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，能夠在賴氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株為非釀酒酵母，共從821 株酵母菌株中分離出120 株--葡萄糖苷酶活性較高的非釀酒酵母。

圖3 96 孔板初篩顯色結(jié)果Fig.3 Chromogenic results of primary screening in 96-well plates

為進(jìn)一步利用七葉苷培養(yǎng)基篩選出高產(chǎn)糖苷酶的非釀酒酵母菌株，將培養(yǎng)時(shí)間從48 h降低為24 h，對(duì)前期篩選出的120 株酵母菌株進(jìn)行再次篩選培養(yǎng)。觀察七葉苷培養(yǎng)基顯色程度，對(duì)120 株酵母菌株產(chǎn)--葡萄糖苷酶能力進(jìn)行具體劃分。由表1可知，分離自赤霞珠葡萄產(chǎn)-葡萄糖苷酶的供試菌株共75 株。其中，閩寧立蘭酒莊無高產(chǎn)--葡萄糖苷酶的菌株；青銅峽西鴿酒莊高產(chǎn)--葡萄糖苷酶的菌株有4 株，中產(chǎn)5 株，低產(chǎn)10 株；甘城子古城人家酒莊有3 株高產(chǎn)--葡萄糖苷酶的菌株，中產(chǎn)菌株4 株，低產(chǎn)菌株21 株。第2天取樣，產(chǎn)--葡萄糖苷酶菌株總數(shù)為20 株；取樣第4天，產(chǎn)--葡萄糖苷酶菌株數(shù)為30 株；第6、8、11天取樣，產(chǎn)--葡萄糖苷酶菌株數(shù)分別為14、6、5 株。綜上所述，相比于閩寧立蘭酒莊，青銅峽西鴿酒莊與甘城子古城人家酒莊分離菌株--葡萄糖苷酶活性較高；在第4天取樣，分離菌株產(chǎn)--葡萄糖苷酶的能力最強(qiáng)。

由表1可知，自霞多麗葡萄分離的菌株中，共篩選出45 株--葡萄糖苷酶活性較高的菌株。閩寧立蘭酒莊高產(chǎn)-葡萄糖苷酶的菌株有1 株，中產(chǎn)菌株9 株，低產(chǎn)菌株12 株；青銅峽西鴿酒莊高產(chǎn)--葡萄糖苷酶的菌株有2 株，中產(chǎn)10 株，低產(chǎn)11 株。第2天取樣，產(chǎn)--葡萄糖苷酶菌株總數(shù)為11 株；第4天取樣，產(chǎn)--葡萄糖苷酶的菌株總數(shù)為22 株；第6天取樣，產(chǎn)--葡萄糖苷酶的菌株總數(shù)為3 株；第8、15天取樣，產(chǎn)--葡萄糖苷酶的菌株總數(shù)分別為6、3 株。綜上所述，閩寧立蘭酒莊與青銅峽西鴿酒莊-葡萄糖苷酶水平差距相對(duì)較小，第4、6天取樣，菌株產(chǎn)--葡萄糖苷酶能力較強(qiáng)。

表1 分離自不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠、霞多麗產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶酵母菌株初篩結(jié)果Table 1 β-D-Glucosinase-producing capacity of yeast strains isolated from Cabernet Sauvignon and Chardonnay from different production areas

2.3 酵母菌株糖苷酶活性定量分析

采用-NP半定量比色法評(píng)估了41 株本土非釀酒酵母菌株和1株商業(yè)346糖苷酶活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線＝0.009 0+0.086 7（相關(guān)系數(shù)為0.999 5），計(jì)算最終酶活性。研究表明，非釀酒酵母在發(fā)酵前期能夠產(chǎn)生較多的胞外水解酶，提高最終產(chǎn)品的感官特性，但具有很強(qiáng)的菌株依賴性。以商業(yè)346為對(duì)照，對(duì)供試菌株糖苷酶粗提取液中--葡萄糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--木糖苷酶活性進(jìn)行測(cè)定。如圖4所示，菌株C-X-4-1（49.669 mU/mL）、X-M-8-1（20.067 mU/mL）、C-X-6-3（19.091 mU/mL）、C-X-4-7（20.278 mU/mL）、X-X-15-1（17.889 mU/mL）、X-X-4-5（18.473 mU/mL）產(chǎn)--葡萄糖苷酶活性較高；高產(chǎn)--木糖苷酶菌株有C-X-4-1（28.450 mU/mL）、C-X-2-4（23.383 mU/mL）、X-X-15-1（30.884 mU/mL）、X-X-4-5（28.850 mU/mL）、C-X-6-3（38.953 mU/mL）、X-M-8-1（32.048 mU/mL）、C-X-4-7（26.366 mU/mL）、X-M-2-6（32.048 mU/mL）、X-M-2-4（26.366 mU/mL）。少數(shù)菌株對(duì)所有底物都具有高活性，這一事實(shí)證明了菌株選擇的重要性，如菌株C-X-4-1、X-M-8-1、C-X-4-7、C-X-6-3、X-M-2-6、X-M-2-4等產(chǎn)--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性均表現(xiàn)出較高水平。綜合考慮酵母菌株4 種糖苷酶活性，篩選出菌株C-X-4-1、X-M-8-1、X-M-2-6、X-M-2-4、C-X-6-3、C-X-4-7，且這6 株菌株產(chǎn)--葡萄糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--木糖苷酶活性均高于對(duì)照菌株。將這6 株菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 本土酵母菌株粗酶液糖苷酶活性熱圖聚類分析Fig.4 Cluster analysis of glycosidase activity in crude enzyme solutions of native yeast strains

2.4 酵母菌株的分子生物學(xué)鑒定

通過對(duì)上述篩選的6 株非釀酒酵母進(jìn)行DNA提取及26S rDNA基因PCR擴(kuò)增，將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已發(fā)表的26S rDNA的D1/D2區(qū)域序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖5所示，包括3 個(gè)屬的4 個(gè)種，分別為（X-M-8-1）、（X-M-2-6）、（C-X-4-1、C-X-6-3、X-M-2-4）、（C-X-4-7）。

圖5 基于26S rDNA序列的酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequences of the yeast strains

2.5 模擬葡萄汁發(fā)酵過程中發(fā)酵動(dòng)力學(xué)與糖苷酶活性分析

2.5.1 模擬葡萄汁發(fā)酵過程中發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

選擇6 株非釀酒酵母分離菌株，分別為、、3 株、，以商業(yè)346為對(duì)照，在模擬葡萄汁中進(jìn)行純菌種發(fā)酵。發(fā)酵過程中質(zhì)量損失如圖6所示，菌株CO質(zhì)量損失最大，即發(fā)酵能力最強(qiáng)；其次，-2和-3也表現(xiàn)出較好的發(fā)酵能力；但所有菌株幾乎均在17 d出現(xiàn)發(fā)酵停滯。

圖6 模擬葡萄汁乙醇發(fā)酵過程中CO2質(zhì)量損失Fig.6 CO2 loss in synthetic grape must during alcoholic fermentation

2.5.2 模擬葡萄汁發(fā)酵過程中糖苷酶活性分析

為了在乙醇發(fā)酵過程中利用非釀酒酵母的糖苷酶活性，需了解在真實(shí)葡萄酒條件下這些酶活性的動(dòng)態(tài)變化。由圖7可知，不同非釀酒酵母發(fā)酵時(shí)，糖苷酶活性變化趨勢(shì)大致相同；在發(fā)酵8～11 d酶活性達(dá)到最大值，隨后逐漸下降，直至發(fā)酵結(jié)束。但不同菌株處理間，酶活性水平表現(xiàn)出一定差異。在葡萄糖質(zhì)量濃度240 g/L、SO質(zhì)量濃度50 mg/L、pH 3.2、發(fā)酵溫度20 ℃條件下，供試菌株的--葡萄糖苷酶和雙糖苷酶（--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶）活性分別在10（16.512 mU/mL）、9（9.574 mU/mL）、11（14.366 mU/mL）、9 d（11.735 mU/mL）達(dá)到最大，且明顯高于其他菌株。對(duì)照菌株346的糖苷酶活性相對(duì)較低，尤其是--葡萄糖苷酶、--木糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶。

圖7 模擬葡萄汁乙醇發(fā)酵過程中糖苷酶活性變化Fig.7 Evolution of glycosidase activity in synthetic grape must during alcoholic fermentation

供試非釀酒酵母菌株--葡萄糖苷酶、--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶累積酶活性如圖8所示。、、1、2、3、、346菌株發(fā)酵過程中糖苷酶的總累積活性之間具有顯著差異（＜0.05），分別為419.353、326.945、246.144、256.668、216.20、213.88、224.48 mU/mL，且、、1、2這4 株菌株的總累積活性顯著高于對(duì)照（224.48 mU/mL）（＜0.05）。7 個(gè)非釀酒酵母菌株處理中，--葡萄糖苷酶累積活性（127.70 mU/mL）＞（101.44 mU/mL）＞（78.76 mU/mL）＞346（72.51 mU/mL）＞3（70.15 mU/mL）＞1（69.23 mU/mL）＞2（62.06 mU/mL）；--阿拉伯糖苷酶累積活性（99.04 mU/mL）＞（81.48 mU/mL）＞（71.28 mU/mL）＞3（62.72 mU/mL）＞2（55.36 mU/mL）＞346（55.31 mU/mL）＞1（54.32 mU/mL）；不同菌株--木糖苷酶和--鼠李糖苷酶累積活性與--阿拉伯糖苷酶變化趨勢(shì)相同。

圖8 模擬葡萄汁乙醇發(fā)酵過程中糖苷酶累積活性Fig.8 Evolution of glycosidase accumulation in synthetic grape must during alcoholic fermentation

3 討論

在葡萄汁中接種釀酒酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵是世界各地釀酒企業(yè)的普遍做法。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)釀酒葡萄表面的一些特定種屬的非釀酒酵母菌株，可以合成和分泌胞外糖苷酶，是提高葡萄酒復(fù)雜性和區(qū)域特色的良好助劑。同時(shí)，胞外糖苷酶的活性因酵母種類的不同而差異顯著，有些菌株可能根本不產(chǎn)生這種酶。因此，分離篩選高產(chǎn)糖苷酶的非釀酒酵母菌株是提高葡萄酒感官?gòu)?fù)雜性的重要手段。Escribano等采用API-ZYM半定量測(cè)試系統(tǒng)，篩選了酵母菌株酯酶、酯酶-脂肪酶、脂肪酶--葡萄糖苷酶活性。Hong Mengnan等分別以熊果苷和木聚糖為底物，對(duì)分離自冰葡萄汁的酵母菌株的--葡萄糖苷和--木糖苷酶進(jìn)行定性分析，共鑒定出11 株產(chǎn)香性能優(yōu)的非釀酒酵母。本研究采用七葉苷培養(yǎng)基96 孔板半定量顯色法初步篩選高產(chǎn)--葡萄糖苷酶的非釀酒酵母，獲得了6 株高產(chǎn)--葡萄糖苷酶及雙糖苷酶的酵母菌株，為葡萄酒的增香釀造奠定了基礎(chǔ)。

在葡萄酒中，一些次級(jí)代謝產(chǎn)物以游離或結(jié)合態(tài)存在，后者可在酵母菌分泌酶的作用下被水解。糖苷酶，特別是--葡萄糖苷酶和--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶等，參與單萜前體物質(zhì)的水解釋放。雖然一些釀酒酵母菌株產(chǎn)生--葡萄糖苷酶，但一些非釀酒酵母菌株分泌的糖苷酶活性更高。前人研究發(fā)現(xiàn)，、、、和的菌株能分泌--葡萄糖苷酶。本研究也發(fā)現(xiàn)，、、、等菌株均表現(xiàn)出較高的--葡萄糖苷酶活性。酵母菌株糖苷酶活性分布情況不僅在釀酒酵母與非釀酒酵母之間存在差異，而且不同非釀酒酵母之間也存在多樣性。Escribano等在對(duì)97 株非釀酒酵母菌株酶活性的分析中發(fā)現(xiàn)，具有-葡萄糖苷酶活性的菌株比例最高（63%），其次是sp（60%），其他多數(shù)酵母則沒有或僅有極少比例的菌株具有該酶活性。Bokulich等研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒酵母產(chǎn)生--木糖苷酶的能力非常罕見，目前僅在、、、和中發(fā)現(xiàn)。Manzanares和Zott等研究發(fā)現(xiàn)和具有較高水平的--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性。Cordero-Bueso等研究發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)出--木糖苷酶、--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性。本研究中，、和表現(xiàn)出較高--木糖苷酶活性，而346則表現(xiàn)出相對(duì)較低的活性。同時(shí)，的--鼠李糖苷酶、--阿拉伯糖苷酶活性與其他菌株也具有差異顯著性（＜0.05）。

研究釀酒過程中酶活性的演替變化對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)調(diào)控非常重要，因?yàn)樗鼈兊乃皆谡麄€(gè)過程中不一定是恒定的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖苷酶活性與乙醇發(fā)酵過程酵母菌的生長(zhǎng)密切相關(guān)，在8～12 d，CO質(zhì)量損失的變化量達(dá)到最大，而不同菌株糖苷酶活性也分別在此發(fā)酵階段達(dá)到最大值，這與發(fā)酵動(dòng)力學(xué)結(jié)果一致。Maturano等研究發(fā)現(xiàn)，酶活性的最高水平與生物量有關(guān)，并在生物量下降之前檢測(cè)到最大值。接種時(shí)，模擬葡萄汁pH 3.2，葡萄糖質(zhì)量濃度240 mg/L、SO質(zhì)量濃度50 mg/L，20 ℃恒溫發(fā)酵，大部分菌株均能正常生長(zhǎng)，且表現(xiàn)出較好的糖苷酶活性水平。López等研究發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母分泌的一些胞外酶，可以耐受葡萄酒的釀造條件，如低pH值、低溫、高糖或乙醇。有研究發(fā)現(xiàn)大部分菌株能產(chǎn)生--葡萄糖苷酶、-鼠李糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶，其中以--葡萄糖苷酶活性最高，其次為木糖苷酶和--阿拉伯糖苷，只有一部分具有--鼠李糖苷酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照菌株，供試菌株均表現(xiàn)出較高水平的糖苷酶活性。不同菌株間酶活性具有一定差異，且同一菌株間不同糖苷酶也表現(xiàn)出一定差異，從發(fā)酵過程中累積糖苷酶活性整體結(jié)果可知，--葡萄糖苷酶＞--阿拉伯糖苷酶＞--木糖苷酶＞--鼠李糖苷酶。

4 結(jié)論

利用WL培養(yǎng)基和七葉苷篩選培養(yǎng)基對(duì)自然發(fā)酵液中高產(chǎn)糖苷酶菌株進(jìn)行篩選，并對(duì)初步篩選出菌株的糖苷酶活性進(jìn)行定量測(cè)定，共篩選出6 株高產(chǎn)糖苷酶的本土非釀酒酵母菌株。在模擬汁發(fā)酵過程中，6 株優(yōu)選本土非釀酒酵母菌株均能正常生長(zhǎng)，且表現(xiàn)出相對(duì)較高的酶活性；尤其是菌株表現(xiàn)出良好的發(fā)酵能力、最高的--葡萄糖苷酶和雙糖苷酶累積活性；其次，菌株的--木糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶累積活性顯著高于對(duì)照菌株，菌株與3表現(xiàn)出較高的--木糖苷酶和--阿拉伯糖苷酶活性。綜合分析，菌株、、3、具有與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，提高葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性和區(qū)域特色的應(yīng)用潛力。