曹子岳，董永貞，彭雪雯，陳 瑞，江 豐，范志勇，俞曉平，陳翊平,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430074；3.中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

魚肉含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，受到消費(fèi)者的普遍喜愛。但魚肉在加工貯存過程中，會(huì)發(fā)生一系列的化學(xué)、物理和生物變化（例如糖酵解、蛋白質(zhì)水解和脂肪降解），導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)，威脅人體健康。其中，魚肌肉中三磷酸腺苷的降解為主要的反應(yīng)之一，其發(fā)生順序如下：三磷酸腺苷→二磷酸腺苷→單磷酸腺苷→單磷酸肌苷→肌苷→次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸。在此反應(yīng)中，次黃嘌呤是主要的分解產(chǎn)物，在魚被宰殺后會(huì)立即積累，并被黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）催化分解生成黃嘌呤和尿酸。研究表明，當(dāng)魚肉中的次黃嘌呤含量超過102 mg/kg時(shí)，魚肉初步腐??；當(dāng)魚肉中的次黃嘌呤含量超過144 mg/kg時(shí)，魚肉完全腐敗。此外，在魚類及其產(chǎn)品生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存過程中，組胺通常也是質(zhì)量監(jiān)控的生物標(biāo)志物之一，若人體攝入過量的組胺將引發(fā)特定的生理毒害作用，如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷、心臟損害等。歐盟頒布的標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)中規(guī)定魚和魚產(chǎn)品中組胺的限量為100 mg/kg。因此，針對(duì)次黃嘌呤和組胺進(jìn)行快速分析，對(duì)評(píng)定魚肉新鮮度和魚產(chǎn)品品質(zhì)以及保障人體健康具有重要意義。

目前，次黃嘌呤和組胺的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)方法和生物傳感器法。傳統(tǒng)方法例如薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法。其中薄層色譜法操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單，但靈敏度較低；毛細(xì)管電泳法靈敏度高、成本低，但穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差；高效液相色譜法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但需要復(fù)雜的前處理步驟和昂貴的儀器設(shè)備，限制了它們的進(jìn)一步應(yīng)用。生物傳感器法是一種較為新穎的檢測(cè)方法。研究人員已經(jīng)開發(fā)了一系列生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺，例如比色生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器等。但這些生物傳感器大多仍受限于靈敏度低、成本高、操作流程復(fù)雜等因素，難以應(yīng)用到次黃嘌呤和組胺的快速檢測(cè)中。

磁弛豫生物傳感器是一種新型的生物傳感器，通過納米磁顆?；蝽槾烹x子改變水分子的弛豫行為，以弛豫時(shí)間作為信號(hào)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。如圖1A所示，Mn（II）具有多個(gè)不成對(duì)軌道電子（1s2s2p3s3p3d，5 個(gè)未成對(duì)軌道電子），由于電子偶極子與質(zhì)子偶極子的相互作用，改變水分子的弛豫行為，具有較長(zhǎng)的電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）信號(hào)，磁信號(hào)更強(qiáng)，橫向弛豫時(shí)間（transverse relaxation time，）更短，而Mn（VII）無未成對(duì)軌道電子（1s2s2p3s3p3d），因此具有較短的ESR信號(hào)，磁信號(hào)可忽略，更長(zhǎng)；與之類似，F(xiàn)e（II）具有較少的未成對(duì)軌道電子（1s2s2p3s3p3d，4 個(gè)未成對(duì)軌道電子），具有較短的ESR信號(hào)，磁信號(hào)弱，值高，而Fe（III）具有較多的未成對(duì)軌道電子（1s2s2p3s3p3d，5 個(gè)未成對(duì)軌道電子），具有較長(zhǎng)的ESR信號(hào)，磁信號(hào)強(qiáng)，值低。因此，可通過Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）的價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)生物傳感信號(hào)的讀出。

次黃嘌呤和組胺分別能被XOD 和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）催化分解產(chǎn)生過氧化氫（如式（1）～（3））。本研究通過利用HO的還原性和氧化性，誘導(dǎo)不同價(jià)態(tài)順磁離子（Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III））的轉(zhuǎn)化（式（4）、（5）），使磁信號(hào)發(fā)生變化，進(jìn)而改變周圍水分子的值，以實(shí)現(xiàn)次黃嘌呤和組胺的定量分析。建立的磁弛豫生物傳感器的測(cè)定原理如式（1）～（5）和圖1所示。

圖1 順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器的構(gòu)建原理圖Fig.1 Schematic diagram of the construction of paramagnetic ionsmediated magnetic relaxation switching biosensor

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買鯽魚作為實(shí)際樣品，收集魚肉并用絞肉機(jī)絞碎后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

次黃嘌呤、XOD 上海源葉生物科技有限公司；組胺上海麥克林生化科技有限公司；DAO 上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；HO溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%）、高錳酸鉀、四水合二氯化錳、七水合硫酸亞鐵、六水合氯化鐵、NaOH、三氯乙酸、HSO溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、HCl溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.0%～38.0%）（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

0.47 T低場(chǎng)核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）儀 上海紐邁電子科技有限公司；D-37520離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；ME104E電子分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 順磁離子溶液的值測(cè)定

用去離子水制備梯度濃度的M n（VII）、Mn（II）溶液（1.95、3.9、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 μmol/L）和Fe（III）、Fe（II）溶液（156.3、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000 μmol/L），去離子水作為空白對(duì)照。用LF-NMR儀對(duì)制備好的順磁離子溶液進(jìn)行的測(cè)定，用CPMG脈沖序列進(jìn)行的測(cè)定，參數(shù)如下：NMR頻率19.00 MHz；重復(fù)采樣等待時(shí)間5 000 ms；回波時(shí)間1 ms；前置放大增益3；回波個(gè)數(shù)18 000；采樣頻率100 kHz。計(jì)算值的變化值：Δ＝去離子水-順磁離子溶液。

1.3.2 順磁離子溶液濃度的優(yōu)化

將200 μL不同濃度的KMnO溶液（0.2、0.5、1.0 mmol/L）分別加入到200 μL梯度濃度的HO溶液（0、20、50、100、200、500、1 000 μmol/L）和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合溶液中，室溫下靜置反應(yīng)5 min，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行的測(cè)定。

將200 μL不同濃度FeSO溶液（1、2、5 mmol/L）分別加入到200 μL梯度濃度的HO溶液（0、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L）和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合溶液中，室溫下靜置反應(yīng)5 min，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行的測(cè)定。

1.3.3 順磁離子介導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)HO的響應(yīng)測(cè)定

將200 μL梯度濃度的HO溶液（0、1.95、3.9、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 500 μmol/L）分別加入到200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合溶液中，室溫下靜置反應(yīng)5 min，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行的測(cè)定。

將200 μL梯度濃度的HO溶液（0、10、20、50、100、200、500、1 000 μmol/L）分別加入到200 μL 2 mmol/L FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合溶液中，在室溫下靜置反應(yīng)5 min，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)后溶液進(jìn)行的測(cè)定。

1.3.4 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺的可性行測(cè)定

將100 μL 0.5 mg/mL DAO加入到200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合溶液中進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。

將100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤溶液與100 μL 1 mg/mL XOD混合均勻，在37 ℃下酶催化反應(yīng)30 min。反應(yīng)后，在上述反應(yīng)溶液中加入200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合液中，室溫下反應(yīng)5 min，反應(yīng)后測(cè)定其值。

將100 μL 1 mmol/L組胺溶液與100 μL 2 mg/mL DAO混合均勻，在37 ℃下酶催化反應(yīng)60 min。反應(yīng)后，在上述反應(yīng)溶液中加入200 μL 2 mmol/L FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合液中，室溫下反應(yīng)5 min，反應(yīng)后測(cè)定其值。

1.3.5 最優(yōu)XOD與DAO質(zhì)量濃度的測(cè)定

將100 μL不同質(zhì)量濃度的XOD（0.1、1、2、5 mg/mL）與100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤溶液混合均勻，在37 ℃下酶催化反應(yīng)30 min。反應(yīng)后，在上述反應(yīng)溶液中加入200 μL 0.5 mmol/L KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合液，室溫下反應(yīng)5 min，反應(yīng)后測(cè)定其值。

將100 μL不同質(zhì)量濃度的DAO（1、2、5、10 mg/mL）與100 μL 1 mmol/L組胺溶液混合均勻，并在37 ℃下酶催化反應(yīng)60 min。反應(yīng)后，在上述反應(yīng)溶液中加入200 μL 2 mmol/L FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合液，室溫下反應(yīng)5 min，反應(yīng)后測(cè)定其值。

1.3.6 Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤

將100 μL梯度濃度的次黃嘌呤溶液（0、0.105、0.525、1.05、5.25、10.5、26.3、52.5、105、263、394、525、630、1 050 μmol/L）與100 μL最優(yōu)質(zhì)量濃度的XOD混合均勻，在37 ℃下酶催化反應(yīng)30 min。反應(yīng)后，在上述反應(yīng)溶液中加入200 μL最優(yōu)濃度的KMnO溶液和100 μL 0.1 mol/L HSO溶液的混合液，室溫下反應(yīng)5 min，反應(yīng)后測(cè)定其值。0 μmol/L次黃嘌呤溶液為空白樣品。

1.3.7 Fe（III）/Fe（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)組胺

將100 μL梯度濃度的組胺溶液（0、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 μmol/L）與100 μL 最優(yōu)質(zhì)量濃度的DAO混合均勻，在37 ℃下酶催化反應(yīng)60 min。反應(yīng)后，在上述反應(yīng)溶液中加入200 μL最優(yōu)濃度的FeSO溶液和100 μL 0.2 mol/L HCl溶液的混合液，室溫下反應(yīng)5 min，反應(yīng)后測(cè)定其值。0 μmol/L組胺溶液為空白樣品。

1.3.8 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器的特異性測(cè)試

在最優(yōu)條件下，對(duì)Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤的特異性進(jìn)行測(cè)試，使用263 μmol/L次黃嘌呤、500 μmol/L葡萄糖、150 μmol/L尿酸、25 μmol/L乳酸、25 μmol/L抗壞血酸混合溶液作為測(cè)試溶液。測(cè)試步驟和反應(yīng)條件與1.3.6節(jié)一致。

在最優(yōu)條件下，對(duì)Fe（III）/Fe（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)組胺的特異性進(jìn)行測(cè)試，使用100 μmol/L組胺、500 μmol/L葡萄糖、263 μmol/L次黃嘌呤、25 μmol/L乳酸、25 μmol/L抗壞血酸混合溶液作為測(cè)試溶液。測(cè)試步驟和反應(yīng)條件與1.3.7節(jié)一致。

1.3.9 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器的實(shí)際樣品測(cè)試

1.3.9.1 加標(biāo)回收率測(cè)試

向鯽魚樣品中分別加入不同濃度次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（80、250、750 μmol/L）和10 mL 1 mol/L三氯乙酸溶液，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)上清液至pH 6.5得到待測(cè)液，取100 μL待測(cè)液用Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器在最優(yōu)條件下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試步驟和反應(yīng)條件與1.3.6節(jié)一致。

向鯽魚樣品中加入不同濃度組胺標(biāo)準(zhǔn)品（10、200、1 000 μmol/L），加入45 mL去離子水，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液為待測(cè)液。取100 μL待測(cè)液用Fe（III）/Fe（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器最優(yōu)條件下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試步驟和反應(yīng)條件與1.3.7節(jié)一致。

1.3.9.2 鯽魚樣品中次黃嘌呤的測(cè)定

將鯽魚樣品在25 ℃下分別貯藏0、1、3、6、10、20 h。分別取5 g不同貯藏時(shí)間的魚肉樣品于離心管中，加入10 mL 1 mol/L三氯乙酸，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)上清液至pH 6.5得到待測(cè)液，取100 μL待測(cè)液用Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器在最優(yōu)條件下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試步驟和反應(yīng)條件與1.3.6節(jié)一致。為保證磁弛豫生物傳感器的準(zhǔn)確性，使用葛倩倩報(bào)道的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法確定鯽魚樣品中的次黃嘌呤含量。

1.3.9.3 鯽魚樣品中組胺的測(cè)定

取5 g 1.3.9.2節(jié)中不同貯藏時(shí)間的鯽魚樣品于離心管中，加入45 mL去離子水，超聲15 min，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液為待測(cè)液。取100 μL待測(cè)液用Fe（III）/Fe（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器在最優(yōu)條件下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試步驟和反應(yīng)條件與1.3.7節(jié)一致。為保證磁弛豫生物傳感器的準(zhǔn)確性，使用郭慧等報(bào)道的HPLC法確定鯽魚樣品中的組胺含量。

1.3.9.4 順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器用于指導(dǎo)魚肉貯藏方式

采用常規(guī)包裝4 ℃貯藏、真空包裝25 ℃貯藏、真空包裝4 ℃貯藏3 種方式對(duì)魚肉樣品進(jìn)行處理并貯藏20 h，貯藏完成后使用1.3.9.2節(jié)和1.3.9.3節(jié)步驟分別對(duì)不同貯藏方式魚肉樣品中的次黃嘌呤和組胺進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)由Origin 2018軟件處理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 順磁離子磁信號(hào)的分析

為驗(yàn)證磁弛豫信號(hào)讀出系統(tǒng)的可用性，首先對(duì)Mn（VII）、Mn（II）、Fe（III）和Fe（II）溶液的值進(jìn)行比較。如圖2A所示，Mn（VII）的Δ值可以忽略不計(jì)，磁信號(hào)接近于水，而Mn（II）具有很強(qiáng)的磁信號(hào)，兩者轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的傳感信號(hào)是一種從無到有的過程。如圖2B所示，相同濃度下，F(xiàn)e（III）具有更強(qiáng)的磁信號(hào)，且兩者磁信號(hào)差異明顯，兩者轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的傳感信號(hào)是一種從弱到強(qiáng)的過程。因此，Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）的價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)換可用于開發(fā)磁弛豫生物傳感器的讀出系統(tǒng)，用于氧化還原底物如HO的定量分析。

圖2 Mn（VII）/Mn（II）（A）和Fe（II）/Fe（III）（B）的T2信號(hào)測(cè)定值Fig.2 T2 signals of Mn (VII)/Mn (II) (A) and Fe (II)/Fe (III) (B)

2.2 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感信號(hào)讀出系統(tǒng)的構(gòu)建

2.2.1 順磁離子溶液濃度的優(yōu)化

以HO誘導(dǎo)的順磁離子價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)化作為磁弛豫生物傳感器的信號(hào)讀出系統(tǒng)，研究不同的Mn（VII）和Fe（II）濃度下，順磁離子系統(tǒng)對(duì)HO的響應(yīng)性能。如圖3A所示，在HO濃度較低時(shí)，0.2 mmol/L Mn（VII）溶液與0.5 mmol/L Mn（VII）溶液具有相近的Δ值；在HO濃度較高時(shí)，0.2 mmol/L Mn（VII）溶液的響應(yīng)趨于平緩；當(dāng)Mn（VII）濃度為1.0 mmol/L時(shí)，對(duì)HO的響應(yīng)強(qiáng)度低。當(dāng)Mn（VII）濃度為0.5 mmol/L時(shí)，具有更好的響應(yīng)性能和趨勢(shì)。因此，選擇0.5 mmol/L的Mn（VII）濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖3B所示，當(dāng)Fe（II）濃度為1 mmol/L時(shí)，在HO濃度大于0.5 mmol/L后，Δ值不再改變；當(dāng)Fe（II）濃度為5 mmol/L時(shí)，對(duì)HO響應(yīng)強(qiáng)度變化較小。因此，選擇2 mmol/L的Fe（II）濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同濃度Mn（VII）（A）和Fe（II）（B）對(duì)H2O2的響應(yīng)性能Fig.3 Response performance to H2O2 of different concentrations of Mn (VII) (A) and Fe (II) (B)

2.2.2 Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）介導(dǎo)的系統(tǒng)對(duì)HO的響應(yīng)分析

在最優(yōu)Mn（VII）和Fe（II）濃度下，構(gòu)建順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感信號(hào)讀出系統(tǒng)。如圖4A、C所示，隨著HO濃度的增加，Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III）系統(tǒng)的Δ值均逐漸增強(qiáng)，表明有更多的Mn（VII）被還原為Mn（II），更多的Fe（II）被氧化為Fe（III）。以HO濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（lg），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析其線性關(guān)系和方法的檢出限（limit of detection，LOD）（LOD由空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）的3 倍與標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度范圍斜率（）的比得到）。如圖4B所示，Mn（VII）/Mn（II）系統(tǒng)的線性范圍為7.81～1 000 μmol/L（＝841.22-466.08），線性相關(guān)系數(shù)（）為0.99，LOD為0.8 μmol/L（SD為6.97，為26.2）。如圖4D所示，F(xiàn)e（II）/Fe（III）系統(tǒng)的線性范圍為10～1 000 μmol/L（＝615.4+434.16），為0.994，LOD為1.42 μmol/L（SD為5.2，為10.98）。這些結(jié)果表明Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III）系統(tǒng)均對(duì)HO具有良好的響應(yīng)，證明順磁離子價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的磁弛豫信號(hào)讀出系統(tǒng)具有可行性。

圖4 Mn（VII）/Mn（II）（A、B）和Fe（II）/Fe（III）（C、D）介導(dǎo)磁弛豫信號(hào)讀出系統(tǒng)H2O2響應(yīng)性能Fig.4 Response performance to H2O2 of Mn (VII)/Mn (II) (A and B)and Fe (II)/Fe (III) (C and D)-mediated readout systems for magnetic relaxation signals

2.3 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器的構(gòu)建

2.3.1 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺的可性行分析

如圖5A所示，DAO能夠直接將Mn（VII）還原為Mn（II），磁信號(hào)變化明顯，因此選用Fe（II）/Fe（III）系統(tǒng)對(duì)組胺進(jìn)行檢測(cè)。如圖5B、C所示，反應(yīng)液的磁信號(hào)發(fā)生明顯變化，說明在此酶催化條件下（100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤溶液中加入100 μL 1 mg/mL XOD；100 μL 1 mmol/L組胺溶液中加入100 μL 2 mg/mL DAO），反應(yīng)體系能夠產(chǎn)生HO并使順磁離子價(jià)態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化，證明順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器用于檢測(cè)次黃嘌呤和組胺具有可行性。

圖5 DAO對(duì)Mn（VII）/Mn（II）系統(tǒng)的影響（A）與Mn（VII）/Mn（II）（B）和Fe（II）/Fe（III）（C）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺的可行性驗(yàn)證Fig.5 Effect of DAO on the Mn (VII)/Mn (II) system (A) and feasibility of Mn (VII)/Mn (II) (B) and Fe (II)/Fe (III) (C)-mediated magnetic relaxation switching biosensor for the detection of hypoxanthine and histamine

2.3.2 酶質(zhì)量濃度的優(yōu)化

為了提高順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器的分析性能，對(duì)XOD和DAO的用量進(jìn)行優(yōu)化。由圖6A可知，當(dāng)XOD的質(zhì)量濃度高于1 mg/mL時(shí)，Δ值相近，表明1 mg/mL XOD可以完全催化100 μL 1.05 mmol/L次黃嘌呤。因此，選擇1 mg/mL XOD用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖6B可知，當(dāng)DAO的質(zhì)量濃度高于2 mg/mL時(shí)，Δ值相近，表明2 mg/mL DAO可以完全催化100 μL 1 mmol/L組胺。因此，選擇2 mg/mL的DAO用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 XOD（A）和DAO（B）質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.6 Optimization of XOD (A) and DAO (B) concentrations

2.3.3 Mn（VII）/Mn（II）和Fe（III）/Fe（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺分析

在最優(yōu)條件下，對(duì)梯度濃度的次黃嘌呤和組胺進(jìn)行測(cè)定。如圖7A、C所示，隨著目標(biāo)物質(zhì)（次黃嘌呤和組胺）濃度的增大，Δ值均逐漸增強(qiáng)。以次黃嘌呤或組胺濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖7B可知，Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)磁弛豫傳感器檢測(cè)次黃嘌呤的線性范圍是0.525～1 050 μmol/L，線性回歸方程＝473.77+762.38，為0.996，LOD為0.17 μmol/L（SD為23.36，為420.69）。由圖7D可知，F(xiàn)e（II）/Fe（III）介導(dǎo)磁弛豫傳感器檢測(cè)組胺的線性范圍是5～1 000 μmol/L，線性回歸方程＝187.93+838.86，為0.992，LOD為2.34 μmol/L（SD為8.32，為10.68）。這些結(jié)果表明，順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)次黃嘌呤和組胺的定量分析，并且檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，可進(jìn)一步用于魚肉新鮮度的評(píng)價(jià)。

圖7 Mn（VII）/Mn（II）（A、B）和Fe（II）/Fe（III）（C、D）介導(dǎo)磁弛豫傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺的性能Fig.7 Detection performance of Mn (VII)/Mn (II) (A and B) and Fe (II)/Fe (III) (C and D)-mediated magnetic relaxation sensor for hypoxanthine and histamine

2.4 順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器的特異性和準(zhǔn)確性

魚肉基質(zhì)復(fù)雜，能夠在一定程度上影響檢測(cè)方法的特異性和準(zhǔn)確性。通過向魚肉樣品中分別添加不同濃度的干擾物質(zhì)研究磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺的特異性。如圖8A、B所示，僅次黃嘌呤或組胺存在時(shí)，反應(yīng)液具有較高的Δ值且響應(yīng)明顯，因此該順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤或組胺的特異性良好。

圖8 Mn（VII）/Mn（II）（A）和Fe（II）/Fe（III）（B）介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺的特異性Fig.8 Specificity of Mn (VII)/Mn (II) (A) and F (II)/Fe (III) (B)-mediated magnetic relaxation switching biosensor for the detection of hypoxanthine and histamine

對(duì)方法的加標(biāo)回收率進(jìn)行考察如表1 所示，Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)的磁弛豫傳感器對(duì)次黃嘌呤的回收率為76.26%～102.7 6%，變異系數(shù)為7.32%～10.15%；Fe（II）/Fe（III）介導(dǎo)的磁弛豫傳感器對(duì)組胺的回收率為70.73%～90.42%，變異系數(shù)為8.01%～13.36%，證明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表1 Mn（VII）/Mn（II）和Fe（II）/Fe（III）介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器檢測(cè)魚肉樣品中次黃嘌呤和組胺的回收率（n＝3）Table 1 Recoveries of Mn (VII)/Mn (II) and Fe (II)/Fe (III)-mediated magnetic relaxation switching biosensor for hypoxanthine and histamine in spiked fish samples (n=3)

如表2所示，與其他方法相比，本研究提出的方法對(duì)次黃嘌呤的檢測(cè)具有最低的LOD，且線性范圍寬于絕大多數(shù)方法；對(duì)組胺的檢測(cè)具有較低的LOD和較寬的線性范圍。雖然一些光學(xué)和電化學(xué)傳感器的LOD更低，但本研究建立的生物傳感器相較于光學(xué)傳感器，線性范圍不分段且明顯寬于電化學(xué)傳感器，因此在實(shí)際應(yīng)用中具有更好的潛力。

表2 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)次黃嘌呤和組胺與其他方法的對(duì)比Table 2 Comparison of paramagnetic ions-mediated magnetic relaxation switching biosensor with other reported methods for the detection of hypoxanthine and histamine

2.5 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器的鯽魚樣品測(cè)試分析

將鯽魚樣品在室溫條件下分別貯藏不同時(shí)間后，用所構(gòu)建的傳感器進(jìn)行檢測(cè)，并與HPLC進(jìn)行比對(duì)。如圖9所示，貯藏10 h后，從魚肉樣品中Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)到的次黃嘌呤超過375 μmol/L（102 mg/kg），組胺均超過100 μmol/L（100 mg/kg），這意味著在室溫下存儲(chǔ)，次黃嘌呤和組胺持續(xù)產(chǎn)生，導(dǎo)致魚肉開始變質(zhì)。在貯藏20 h后，Mn（VII）/Mn（II）介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器檢測(cè)到的次黃嘌呤超過529 μmol/L（144 mg/kg），表明魚肉已經(jīng)完全變質(zhì)。此外，本研究所構(gòu)建的順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器與HPLC檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和實(shí)際應(yīng)用潛力。

圖9 順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器和HPLC檢測(cè)魚肉樣品中的次黃嘌呤（A）和組胺（B）Fig.9 Results of paramagnetic ions-mediated magnetic relaxation switching biosensor and HPLC for hypoxanthine (A) and histamine (B)in fish samples

2.6 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)不同貯藏方式下魚肉品質(zhì)的變化

如圖10所示，在25 ℃真空包裝貯藏20 h后，魚肉中次黃嘌呤的含量超過了102 mg/kg（開始變質(zhì)），組胺含量未超過100 mg/kg，這表明真空包裝可以有效地控制魚的質(zhì)量，原因可能是真空包裝可以降低氧氣濃度，從而減弱了三磷酸腺苷的降解速度和微生物的作用。而4 ℃常規(guī)包裝貯藏時(shí)，次黃嘌呤和組胺含量均未超標(biāo)。進(jìn)一步研究4 ℃真空包裝貯藏對(duì)魚肉的保鮮效果，發(fā)現(xiàn)貯藏20 h后，次黃嘌呤與組胺含量低于4 ℃常規(guī)包裝貯藏。因此，4 ℃真空包裝是一種有效保證魚肉品質(zhì)的方式。

圖10 順磁離子介導(dǎo)磁弛豫生物傳感器檢測(cè)不同貯藏方式下魚肉樣品中次黃嘌呤和組胺的變化Fig.10 Changes in hypoxanthine and histamine contents in fish samples during storage under different conditions as detected by paramagnetic ions-mediated magnetic relaxation switching biosensor

3 結(jié)論

構(gòu)建一種順磁離子價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)換介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器，通過酶催化反應(yīng)產(chǎn)生HO實(shí)現(xiàn)生物信號(hào)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而結(jié)合氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)順磁離子的價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)換，最終實(shí)現(xiàn)磁弛豫信號(hào)的高效讀出。本方法實(shí)現(xiàn)了魚肉中次黃嘌呤（LOD為0.17 μmol/L）和組胺（LOD為2.34 μmol/L）的高靈敏快速檢測(cè)，線性范圍分別為0.525～1 050 μmol/L和5～1 000 μmol/L，且與HPCL檢測(cè)結(jié)果一致，可用于魚肉品質(zhì)的高效評(píng)價(jià)。與傳統(tǒng)的HPLC分析相比，本研究所構(gòu)建的順磁離子介導(dǎo)的磁弛豫生物傳感器不需要精密昂貴的儀器和專業(yè)的檢測(cè)人員，所用設(shè)備簡(jiǎn)單，極大簡(jiǎn)化了次黃嘌呤和組胺的檢測(cè)過程和檢測(cè)費(fèi)用，在魚肉品質(zhì)評(píng)定方面具有良好的應(yīng)用潛力。