天麻醋發(fā)酵工藝優(yōu)化及成分分析

張弛，賀陽，姜禹辰，賈元隆，張薇，文連奎

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

天麻（Gastrodia elata）為蘭科（Orchidaceae）植物的干燥塊莖，是我國名貴的中藥材之一[1]。研究表明，天麻中含有多種對人體有益的化學(xué)成分，如天麻素、天麻多糖、4-羥基苯甲醇、巴利森苷等[2-3]，這些成分具有抗氧化、抗衰老、降血壓、降血糖、神經(jīng)保護等功效[4-7]，對人體有很好的營養(yǎng)價值和功效作用。2020年國家衛(wèi)健委將天麻列入藥食兩用名單[8]，為天麻深入開發(fā)提供了良好的機遇。目前在天麻食品方面已開發(fā)出天麻米酒、天麻可樂、天麻面條、天麻蛋糕等新產(chǎn)品[9-12]，而以天麻為原料的發(fā)酵醋研究鮮見報道。

醋是以淀粉或糖含量較高的物質(zhì)經(jīng)過酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵后的酸味液態(tài)調(diào)味品，具有增進食欲、抑菌殺菌、活血化瘀等作用，多用于烹飪[13]，原料一般為糧食及水果等。近年來，以藥食同源原料開發(fā)的保健醋市場需求越來越大。殷路萍[14]以新鮮的五味子果實為主要原料，經(jīng)榨汁、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵（液態(tài)深層發(fā)酵法）制得五味子醋。呂歡[15]以葛根和高粱為主要原料，對葛根醋的酶解、糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等階段的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，確定了葛根醋釀造的最佳工藝流程。謝錦明[16]以苦蕎為原料發(fā)酵釀造食醋，制得的苦蕎醋不僅擁有傳統(tǒng)的食醋功能，還兼具苦蕎的營養(yǎng)成分。

本文以天麻為原料，通過液化、糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵制得天麻醋，并經(jīng)單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，采取頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對天麻醋的香氣成分進行分析，以期為天麻醋品質(zhì)的提高提供參考，促進天麻醋產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏美天麻：吉林省輝南縣喜霞有機農(nóng)業(yè)有限公司；α-淀粉酶（40 000 U/mL）、糖化酶（100 000 U/mL）：Aladdin試劑（上海）有限公司；安琪釀酒高活性酵母：安琪酵母股份有限公司；滬釀1.01醋酸菌種、醋酸菌培養(yǎng)基：北京生物保藏中心；酵母膏：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蔗糖（食品級）：山東喬邦化工有限公司；檸檬酸（食品級）：江蘇瑞多生物工程有限公司；碳酸氫鈉（食品級）：濟南坤豐化學(xué)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（HH-4A）：北京市光明醫(yī)療儀器廠；pH計（pH-3C）：上海佑科儀器儀表有限公司；雙人凈化工作臺（SW-CJ-2D）：浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；振蕩培養(yǎng)箱（SPX-250B-D）、生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z）、壓力蒸汽滅菌鍋（LS-3D）：上海博迅實業(yè)有限公司；大容量多孔離心機（LXJ-ⅡB）：上海安亭科學(xué)儀器廠；萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：上海安譜實驗科技股份有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀（TSQ9000）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高效液相色譜（1200）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 天麻醋釀造工藝流程及操作要點

1.3.1.1 天麻醋釀造工藝流程

1.3.1.2 操作要點

挑選、清洗、粉碎：挑選無腐爛、無蟲害的優(yōu)質(zhì)干天麻。將干天麻清洗干凈，鼓風干燥箱65℃烘干后利用粉碎機將其粉碎，過100目篩，裝袋避光保存。

天麻漿制備：按料液比1∶10（g/mL），向天麻粉中加水得到天麻漿液，加水量過高或過低都不利于后期酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵。

液化：天麻漿液中加入天麻粉質(zhì)量0.4%α-淀粉酶，攪拌均勻后88℃水浴40 min獲得液化醪。

糖化：將降至25℃后的液化醪加入天麻粉質(zhì)量5%糖化酶，攪拌均勻后54℃水浴40 min，獲得糖化醪。

過濾：200目濾布過濾天麻糖化醪，濾除天麻殘渣。

糖度調(diào)整：用蔗糖將天麻糖化醪糖度調(diào)整至10%。

酵母菌活化：準確稱取所需安琪酵母，加入2%糖水中，酵母與水的體積比為1∶20，攪拌均勻，至35℃～38℃水浴鍋中活化30 min。

酒精發(fā)酵：將酵母活化液接種至糖化醪，按酵母用量接種量為0.8 g/L，30℃酒精發(fā)酵8 d，得到酒精度為5.2%vol和pH4.5的天麻酒醪。

醋酸菌活化：將醋酸菌按照1∶100的體積比接入醋酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h[17]。

醋酸發(fā)酵：在天麻酒醪中按試驗設(shè)計的發(fā)酵溫度、醋酸菌接種量（醋酸菌經(jīng)平板計數(shù)為1.04×109個/mL）、初始pH值（采用檸檬酸與碳酸氫鈉緩沖液調(diào)整pH值）進行醋酸發(fā)酵，得到天麻原醋。

陳釀：發(fā)酵制得的天麻原醋風味刺鼻，口感柔和度欠佳，將天麻原醋在25℃條件下陳釀60 d調(diào)和風味口感。

澄清：天麻原醋在轉(zhuǎn)速4 000 r/min條件下，離心20 min。

殺菌：離心后的天麻原醋上清液裝瓶，巴氏殺菌后得到天麻醋成品。

1.3.2 天麻醋發(fā)酵單因素試驗設(shè)計

1.3.2.1 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響

根據(jù)齊海麗等[18]的方法稍作修改，調(diào)整天麻發(fā)酵酒醪為初始pH4.5，醋酸菌接種量為0.6%，分別置于28、30、32、34、36 ℃培養(yǎng) 12 d，每隔 2 d 取樣測定醋酸含量，以醋酸含量為評價指標確定最佳發(fā)酵溫度。

1.3.2.2 醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響

根據(jù)黃艷麗等[19]的方法稍作修改，調(diào)整天麻發(fā)酵酒醪為初始pH4.5，分別接入擴培后的醋酸菌0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，醋酸菌經(jīng)平板計數(shù)為 1.04×109個/mL，置于32℃培養(yǎng)12 d，每隔2 d取樣測定醋酸含量，以醋酸含量為評價指標確定最佳醋酸菌接種量。

1.3.2.3 初始pH值對醋酸發(fā)酵的影響

根據(jù)張麗麗[20]的方法稍作修改，調(diào)整天麻發(fā)酵酒醪初始 pH 值為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，醋酸菌接種量為0.6%，置于32℃培養(yǎng)12 d，每隔2 d取樣測定醋酸含量，以醋酸含量為評價指標確定最佳初始pH值。

1.3.3 天麻醋發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計天麻醋試驗?zāi)Ｐ?，響?yīng)值R為醋酸含量，選擇發(fā)酵溫度（A）、醋酸菌接種量（B）、初始 pH 值（C）3個因素為自變量，設(shè)計三因素三水平共17個試驗點響應(yīng)面試驗，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化天麻醋發(fā)酵工藝的因素和水平Table 1 Factors and levels for optimizing the fermentation process of Gastrodia elata vinegar by response surface methodology

1.3.4 天麻醋香氣成分分析

1.3.4.1 頂空固相微萃取條件

取5 mL巴氏殺菌后的天麻醋樣于20 mL頂空瓶中，添加1.0 g NaCl，于50℃加熱平衡30 min，將DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中，使之與醋液面保持1 cm距離，萃取30 min，磁力攪拌速度為800 r/min，熱解析時間30 s，熱解析溫度250℃[21]。

1.3.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX（長30 m、內(nèi)徑0.25 mm、液膜厚度0.25 μm）。載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。固相微萃取采用自動進樣，不分流模式。柱溫箱升溫程序為45℃保持3 min，然后以5℃/min的速度升溫至100℃保持1 min，再以10℃/min的速度升溫至240℃保持12 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，離子能量70 eV，質(zhì)譜傳輸線溫度為250℃，離子源溫度為230℃，掃描范圍為20 U～550 U[22]。峰表對照NIST譜庫進行檢驗分析。

1.3.5 天麻醋指標測定方法

1.3.5.1 理化指標測定

醋酸含量的測定方法：取20 mL醋樣與20 mL蒸餾水，混勻后加入蒸餾裝置，吸取1 mL餾出液加入10 mL蒸餾水，膠頭滴管吸取酚酞2滴加入待測液，用NaOH標準溶液滴定至有微紅色出現(xiàn)，30 s內(nèi)不褪色為終點[23]，參考GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的方法計算醋酸含量，以醋酸計；可溶性固形物含量采用手持折光計法；還原糖含量參考GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》中直接滴定法；天麻素含量參考《中華人民共和國藥典》中天麻素的測定方法[24]；天麻多糖含量參考程立君等[25]的苯酚硫酸法。

1.3.5.2 微生物指標測定

致病菌的測定參考GB 29921—2021《食品安全國家標準預(yù)包裝食品中致病菌限量》；菌落總數(shù)、大腸菌群的測定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》。

1.3.5.3 感官評價

感官評價參考GB 2719—2018《食品安全國家標準食醋》進行評價。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)測定3次，取平均值；采用Origin 2018 64 Bit、Design Expert 8.0軟件進行圖片繪制和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻醋發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對醋酸含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 The effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation

由圖1可知，當發(fā)酵溫度在32℃、發(fā)酵時間12 d時醋酸含量最高，達到了3.92 g/100 mL。發(fā)酵溫度過低，菌數(shù)生長速率緩慢，醋酸發(fā)酵不完全，醋酸含量較低。發(fā)酵溫度過高，乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶在高溫環(huán)境下受到抑制，乙醇氧化成醋酸的速率降低，從而醋酸含量下降[26]。因此選擇30、32、34℃作為響應(yīng)面試驗水平。

2.1.2 醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響

醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of acetobacter inoculum on acetic acid fermentation

由圖2可知，當醋酸菌接種量在0.6%、發(fā)酵時間12 d時，醋酸含量最高，達到3.86 g/100 mL；醋酸菌接種量為0.4%時醋酸含量最小，僅有3.08 g/100 mL；在醋酸菌接種量超過0.6%時，醋酸含量隨著醋酸菌接種量的增大而減小。結(jié)果表明，適當增加醋酸菌接種量，醋酸發(fā)酵速率會隨之增快，但當接入過量的醋酸菌醋酸含量不再增大，這是因為過量的醋酸菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)也增多，醋酸發(fā)酵過程被抑制，導(dǎo)致醋酸含量下降[27]。因此選擇0.5%、0.6%、0.7%作為響應(yīng)面試驗水平。

2.1.3 初始pH值對醋酸發(fā)酵的影響

初始pH值對醋酸發(fā)酵的影響見圖3。

圖3 初始pH值對醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of initial pH on acetic acid fermentation

由圖3可知，在初始pH3.5～4.5時，醋酸含量隨著pH值的增大而增加。在初始pH4.5，發(fā)酵時間12 d時，醋酸含量達到了最大值3.74 g/100 mL，之后隨著pH值的增加，醋酸含量隨之降低，這可能是由于醋酸菌適宜生長于偏酸性條件中。pH值大小能夠改變醋酸菌代謝行為，影響醋酸產(chǎn)量[28]。因此選擇pH4.0、4.5、5.0作為響應(yīng)面試驗水平。

2.2 天麻醋發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計模型及其響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design model and its response values

醋酸含量是檢驗醋品質(zhì)評價的重要指標，本試驗以醋酸含量作為響應(yīng)值R，按表2進行回歸分析，醋酸含量R的回歸方程如下。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

由表3可知，模型P值為0.000 2（P＜0.01）差異極顯著；失擬項 P值為 0.860 7（P＞0.05）差異不顯著，表明該模型在試驗參數(shù)范圍內(nèi)可行。方程決定系數(shù)R2=0.966 2，模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.922 8，說明模型擬合度較好，能夠解釋響應(yīng)值變化。

根據(jù)F值大小可知，3個因素對醋酸含量的影響順序為發(fā)酵溫度（A）＞初始pH值（C）＞醋酸菌接種量（B）。二次項B2（P＜0.05），表明對醋酸含量有顯著影響；一次項 A、B、C，二次項 A2、C2，對醋酸含量有極顯著影響（P＜0.01）；其他因素組合對醋酸含量無顯著影響（P＞0.05）。

2.2.2 響應(yīng)面模型分析

響應(yīng)面見圖4～圖6。

圖4 發(fā)酵溫度與醋酸菌接種量交互作用對醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 The effect of the interaction between fermentation temperature and acetic acid bacteria inoculum on acetic fermentation

圖5 發(fā)酵溫度與初始pH值交互作用對醋酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of interaction between fermentation temperature and initial pH on acetic fermentation

圖6 醋酸菌接種量與初始pH值交互作用對醋酸發(fā)酵的影響Fig.6 The effect of the interaction between acetic acid bacteria inoculum and initial pH on acetic fermentation

由圖4～圖6可知，發(fā)酵溫度與醋酸菌接種量（AB）、發(fā)酵溫度與初始pH值（AC）、醋酸菌接種量與初始pH值（BC）響應(yīng)面圖坡度平緩，AB、AC、BC間交互影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗驗證

根據(jù)Design Expert 8.0軟件優(yōu)化得到醋酸發(fā)酵最佳條件為發(fā)酵溫度32.61℃、接種量0.56%、初始pH4.59。為方便進行試驗操作，試驗條件調(diào)整為32.6℃、醋酸菌接種量0.56%、初始pH4.6。經(jīng)過3次重復(fù)試驗，總酸含量為4.23 g/100 mL，與模型預(yù)測值相差不大，誤差為±0.15%。該模型可以用于預(yù)測醋酸發(fā)酵條件與醋酸含量之間的關(guān)系。

2.3 天麻醋香氣成分分析

采用HS-SPME-GC-MS對天麻醋進行測定，峰表對照NIST譜庫進行檢索。天麻醋中揮發(fā)性化合物的組成及相對含量見表4。

表4 天麻醋揮發(fā)性化合物的組成及相對含量Table 4 Composition and relative content of volatile compounds in Gastrodia elata vinegar

如表4所示，天麻醋中共鑒定出32種香氣成分，包括酸類、酯類、醇類、酚類、醛酮類、雜環(huán)類及其他類，各物質(zhì)相對含量總和占總含量的74.19%。其中酸類物質(zhì)共有4種，相對含量為27.46%；酯類物質(zhì)共有9種，相對含量為18.29%；醇類物質(zhì)共有6種，相對含量為14.82%；酚類物質(zhì)共有5種，相對含量為13.26%；醛酮類物質(zhì)共有5種，相對含量為5.37%；雜環(huán)類物質(zhì)共有1種，相對含量為0.18%；其他類物質(zhì)共有2種，相對含量為0.18%。

酸類物質(zhì)大多由酯類物質(zhì)降解生成，一般具有刺鼻氣味[29]。天麻醋中乙酸相對含量最高，為22.31%，是天麻醋風味的主要來源。異丁酸、異戊酸、異辛酸對天麻醋風味起輔助作用，相對含量分別為0.35%、1.98%、2.82%。

有機酸與醇脫水縮合的酯化反應(yīng)，是酯類物質(zhì)的主要來源。酯類物質(zhì)大多具有鮮果香以及花香。天麻醋中主要酯類物質(zhì)有乙酸苯乙酯、己酸乙酯、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二異丁酸酯，相對含量分別為7.30%、6.72%、2.93%。乙酸苯乙酯具有玫瑰花香，己酸乙酯具有菠蘿香氣，是天麻醋中甜香與果香的主要風味來源。

酵母代謝以及糖苷與酯類物質(zhì)代謝是醇的主要生成途徑。天麻醋中的主體醇類物質(zhì)苯乙醇就是由酵母菌有機合成與生物轉(zhuǎn)化得來的，相對含量為12.91%。苯乙醇具有玫瑰花香，賦予了天麻醋清甜香味。

酚類物質(zhì)中相對含量最高的是對甲酚，為10.49%，對甲酚具有煙熏、藥香味。單純的酚類物質(zhì)呈味簡單，與其他揮發(fā)性化合物共同作用后效果更佳。酚類物質(zhì)雖相對含量較低，但由于其香味閾值較高，所以對天麻醋的香氣成分貢獻較大。

醛酮類物質(zhì)、雜環(huán)類化合物及其他類化合物三種成分含量較低，所以它們對天麻醋風味的貢獻較小。

2.4 天麻醋指標分析結(jié)果

2.4.1 理化指標測定結(jié)果

天麻醋中可溶性固形物含量為3.9%，還原糖含量為2.2 mg/mL，醋酸含量為4.23 g/100 mL，天麻素含量為0.72 mg/mL，天麻多糖含量為0.396 mg/mL，符合國標中食醋質(zhì)量標準。

2.4.2 微生物指標測定結(jié)果

天麻醋中菌落總數(shù)≤100個/100 mL，大腸菌群與致病菌未檢出，符合國標中食醋微生物限量標準。

2.4.3 感官評價結(jié)果

天麻醋為棕褐色，醋品色澤清亮、質(zhì)地均勻無沉淀，兼具天麻獨有氣味與濃郁醋香，酸度適宜口感柔和，能夠滿足消費者需求。

3 討論與結(jié)論

天麻經(jīng)醋酸發(fā)酵后與自身香氣成分有很大區(qū)別，鮮天麻中的主體香氣成分為醇類與酚類[30]，而天麻醋主體香氣成分為酸類與酯類，且相同種類中的揮發(fā)性化合物也幾乎不同，這可能是由于酵母菌與醋酸菌作用后導(dǎo)致的成分變化。乙酸為天麻醋中的主體酸類物質(zhì)，這與周鈺欣等[31]所測定的5種發(fā)酵醋結(jié)果一致，但天麻醋中的酯類物質(zhì)相對含量低于岐山醋，高于其他4種發(fā)酵醋。

本試驗以天麻為原料，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面試驗對醋酸發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度32.6℃、醋酸菌接種量0.56%、初始pH4.6，得到的天麻醋醋酸含量為4.23g/100 mL。采取頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜對天麻醋進行香氣成分分析，共鑒定出32種香氣成分，其中酸類4種（27.46%）、酯類9種（18.29%）、醇類6種（14.82%）、酚類5種（13.26%）、醛酮類5種（5.37%）、雜環(huán)類1種（0.18%）、其他類物質(zhì)2種（0.18%）。綜上所述，天麻醋獨特的香氣風味并不是由一種或一類揮發(fā)性化合物提供，而是由不同種類揮發(fā)性化合物提供。