高效液相法對(duì)蛹蟲草中蟲草素的提取及含量測(cè)定

趙宇英

（廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 廈門 361000）

0 引言

通過對(duì)文獻(xiàn)資料的分析，目前常見的測(cè)定蛹蟲草中蟲草含量的方式包括以下三種：薄層色譜法（TLC）、毛細(xì)管電泳法（CE）以及高效液相色譜法。高效液相色譜法是現(xiàn)階段試驗(yàn)過程中的首選方法，與其他方式相比，測(cè)量結(jié)果的精準(zhǔn)性較高，在前期操作處理中所用的操作不復(fù)雜。由于不同的物質(zhì)具備不同的光譜，因此可以用作試驗(yàn)中的定性，由于二極管陣列檢測(cè)器（DAD）可以實(shí)現(xiàn)在設(shè)定波長區(qū)域內(nèi)的各波長之下采集數(shù)據(jù)信息，因此，當(dāng)觀察試驗(yàn)結(jié)果時(shí)不僅可以查看不同波長之下的色譜圖，也可以看到不同時(shí)期的光譜圖，對(duì)豐富試驗(yàn)數(shù)據(jù)的層次具有積極作用，該文主要研究在高效液相色譜圖和DAD 檢測(cè)器的基礎(chǔ)上，針對(duì)蛹蟲草中蟲草素的定量、定性分析方法，并對(duì)需要分析的樣品進(jìn)行制備方法分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

根據(jù)高效液相色譜法的實(shí)際應(yīng)用情況來看，該方法具有以下特點(diǎn)：第一，高壓，由于流動(dòng)相屬于液體，在流經(jīng)色譜柱的過程中受到的阻力較大，因此需要對(duì)載液施加高壓；第二，高速，與其他液體色譜法相比，該方法檢測(cè)速度較快，通常情況下，樣品的分析工作可以在30min 之內(nèi)完成；第三，高靈敏度，利用紫外檢測(cè)器，靈敏度可以達(dá)到0.01ng；第四，適用范圍較廣，70%以上的有機(jī)化合物都適用于高效液相色譜分析法，尤其是大分子、高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性較差的化合物。試驗(yàn)材料如下文所示。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品：純度 99.9%，上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司生產(chǎn)。甲醇、甲酸、乙腈：色譜純，德國默克股份公司生產(chǎn)。試驗(yàn)室用水為Milli-Q 超純水。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取干燥至質(zhì)量恒定的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品10mg（精確至0.0001g）于100mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度為100ug/mL。再用超純水分別稀釋成不同濃度的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

試驗(yàn)儀器主要有Waters2695 高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器DAD（美國Waters 公司）；Sartorius SQP QUINTIX 224-1CN 分析天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）；HWS-28 電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；HD-1008A 和逹超聲波（廈門和偉達(dá)超聲波設(shè)備有限公司）。

試驗(yàn)樣品：小麥、大米、蠶蛹粉3 種培養(yǎng)基質(zhì)作為栽培的蛹蟲草樣品，每種1 個(gè)批次。

1.2 色譜條件

檢測(cè)器：DAD 檢測(cè)器；色譜柱：Sunfire C18 5μm（4.6 mm×250mm，美國Waters 公司）；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：甲醇-甲酸-水（4 ∶1 ∶95，V ∶V ∶V）；檢測(cè)波長：260nm；運(yùn)行時(shí)間：10min；洗脫程序：等度洗脫。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

針對(duì)蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行梯度濃度的稀釋方法：準(zhǔn)確吸取0.5mL、1.0mL、3.0mL、6.0mL 和8.0mL 的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100μg/mL）于10mL 容量瓶中，用水定容、搖勻，該標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為5.00μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL、60.0μg/mL 和80.0μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。每個(gè)進(jìn)樣重復(fù)3 次，以蟲草素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其中蟲草素的回歸方程為=38505+8952.2，=0.9993。

1.4 流動(dòng)相的選擇

采用不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相，對(duì)樣品中蟲草素的分離效果進(jìn)行比較，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定甲醇-水（16 ∶84，V/V），流速為1.0mL/min。

1.5 樣品前處理

將蛹蟲草子實(shí)體置于40℃烘干箱中烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200 目篩，在50mL 燒杯中加入粉末均勻的蛹蟲草樣品0.5g（精確至 0.0001g），加20%乙醇水溶液15mL，在超聲波儀40℃的條件下超聲提取3h，取出后用20%乙醇水溶液轉(zhuǎn)移至20mL 容量瓶中搖勻并定容至刻度。樣液離心后，將上清液過0.45μm 微孔濾膜，得到的濾液供高效液相色譜法使用。

1.6 提取條件的選擇優(yōu)化

蟲草素的分子式為CHNO，該物質(zhì)呈堿性，分子量為251，物質(zhì)呈現(xiàn)出針狀或片狀結(jié)晶，其熔點(diǎn)在230 攝氏度左右，最大的吸收波長可以達(dá)到259nm。為了監(jiān)測(cè)其波長，研究人員需要以甲醇為空白，選擇在200nm～450nm 對(duì)混合蟲草素的甲醇溶液進(jìn)行紫外吸收掃描，掃描結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，蟲草素在259.2nm～260.8nm 呈現(xiàn)出強(qiáng)吸收，可以使用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)先前的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，能夠保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性以及靈敏度，該研究最終選擇采用的測(cè)定波長為260nm，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品和蛹蟲草樣品的色譜圖如圖1 和圖2所示。

圖1 蟲草素色譜圖

圖2 蛹蟲草樣品色譜圖

由于蟲草素易溶于水、熱乙醇和甲醇，因此固蟲草素的溶劑通常是水、達(dá)到一定溫度的乙醇溶液和甲醇。凌建亞等試驗(yàn)人員利用浸提法、索氏提取法、回流法以及超聲法對(duì)蟲草素進(jìn)行了提取對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面：第一，浸提法對(duì)蟲草素的提取效果不佳，需要耗費(fèi)一定的時(shí)間，與其他提取方法相比，性價(jià)比較低，并不利于后續(xù)的試驗(yàn)操作；第二，在提取操作的時(shí)間方面，調(diào)整回流提取、超聲法以及索氏提取法的結(jié)果相似，其中超聲法的試驗(yàn)操作更便捷，不易受到外部環(huán)境因素的影響，該方法可以在試驗(yàn)中減少回流前后補(bǔ)足溶劑、定容等操作造成的試驗(yàn)誤差。

為了比較三種提取方法的優(yōu)劣，蟲草素的提取方法設(shè)計(jì)了以下三種情況：1）以三種蛹蟲草為材料，采用40℃條件下超聲波水提法。2）40℃條件下超聲波20%乙醇提法。3）40℃條件下超聲波甲醇提法。在以上提取方法中選擇蟲草素的最佳提取方式，試驗(yàn)人員使用正交試驗(yàn)方法對(duì)提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)這3 個(gè)影響因素進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果可以確定其最佳前處理樣品的制備方法為取樣后加入40 倍質(zhì)量的20%乙醇水溶液并置于40℃的超聲波儀中提取3h，3 種處理方式得到的結(jié)果見表1。

表1 3 種方法處理3 個(gè)樣品得到的蟲草素含量

將3 種培養(yǎng)基來源的蛹蟲草樣品稱取 0.5g ，加入15mL的20%乙醇水溶液，在40℃條件下分別超聲提取1h、2h、3h、4h、5h 后定容至20mL，最后通過高效液相色譜儀外標(biāo)法進(jìn)項(xiàng)定量，流動(dòng)相采用甲醇和水的體系。采用液相色譜儀測(cè)定蟲草素色譜峰面積，在260nm 波長下， 用提取時(shí)間（）對(duì)最終樣液的色譜峰面積（）作圖，如圖3 所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在樣品提取3h 后，基本可以將樣品中的目標(biāo)物提取出來，當(dāng)實(shí)際操作更高濃度含量的樣品時(shí)，可通過減少稱樣量、增大定容體積或者延長提取時(shí)間來充分提取樣品中的蟲草素。

在已經(jīng)確定前處理方法后，接下來需要選擇流動(dòng)相。這次試驗(yàn)比較了幾組流動(dòng)相，分別為乙腈∶水（5 ∶95）、甲醇∶水（15 ∶85）、甲醇∶甲酸∶水（4 ∶1 ∶95），經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果分析比較，發(fā)現(xiàn)甲醇∶甲酸∶水（4 ∶1 ∶95）的試驗(yàn)條件下，蟲草素與樣品中的主要雜質(zhì)和干擾物呈現(xiàn)出較好的分離效果，試驗(yàn)結(jié)果表明，在該條件下出峰時(shí)間更合適，形成的峰形較好，受到的外界因素干擾較小，更能達(dá)到良好的試驗(yàn)效果。在保證高回收率和靈敏度的同時(shí)縮短分析用時(shí)，最終選出最優(yōu)的流動(dòng)相為甲醇∶甲酸∶水（體積比為4 ∶1 ∶95）。

由于改變超聲功率對(duì)蟲草素的含量影響較小，因此，該試驗(yàn)選擇試驗(yàn)儀器所能達(dá)到的最大超聲功率700 W；提取次數(shù)對(duì)蟲草素的影響較小，該試驗(yàn)結(jié)果表明：用水提取1 次，提取40min 即可將蟲草素完全提取，提取2 次僅使蟲草素分別增加了0.044 %、2.32%，因此一次提取即可滿足分析要求。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍、最低檢出限（LOD）與測(cè)量限（LOQ）

在完成最優(yōu)色譜條件的篩選之后，試驗(yàn)人員需要分別使用已經(jīng)稀釋之后的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行樣品分析，每個(gè)樣品都需要進(jìn)行3 次重復(fù)性試驗(yàn)，取測(cè)試結(jié)果的平均值，對(duì)蟲草素濃度（，μg/mL）與峰面積（）進(jìn)行線性回歸，得到蟲草素濃度與峰面積的回歸方程為=16197+2024，回歸系數(shù)=0.999834。試驗(yàn)結(jié)果表明：蟲草素的濃度在5μg/mL～80μg/mL，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。以低溶度標(biāo)準(zhǔn)樣（5.0μg/mL）進(jìn)樣，得出信噪比（S/N）為103，檢測(cè)限（方法）為7.5 mg/kg，定量限為22.5mg/kg。由于NY/T 2116-2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測(cè)定高效液相色譜法》要求的檢出限為10mg/kg，因此該方法的檢出限更低，可滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需求。

2.2 回收率和精密度

按照最優(yōu)前處理方法，在液相色譜條件下進(jìn)行前處理和上機(jī)檢測(cè)，對(duì)樣品SAM1、SAM2、SAM3 加標(biāo)，進(jìn)行12 次平行測(cè)量，回收率和精密度結(jié)果見表2。

表2 回收率和精密度的試驗(yàn)結(jié)果

蟲草素在不同加標(biāo)濃度下的加標(biāo)回收率為97.64%～98.40%，RSD 為0.31%～0.42%，表明采用熱的20%乙醇水溶液對(duì)蛹蟲草樣品進(jìn)行超聲提取、凈化并采用甲醇、水、甲酸的體系的方法能夠準(zhǔn)確高效地測(cè)量蛹蟲草中的蟲草素含量。

2.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取相同樣品五份，按試驗(yàn)要求制備成待測(cè)試液，在常溫下每間隔2h 測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定7 次，試驗(yàn)表明樣品平均峰面積變化不大，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%，樣品溶液中蟲草素在12h 內(nèi)穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

該研究通過試驗(yàn)的方式對(duì)高效液相色譜法測(cè)定蟲草素含量的前期處理進(jìn)行分析，選擇人工栽培的蛹蟲草作為主要樣本，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，最終選定20%的40℃乙醇作為提取劑，高效液相色譜法可以實(shí)現(xiàn)蟲草素含量的高效檢測(cè)，試驗(yàn)操作更靈敏，更適合人工栽培的蛹蟲草的蟲草素檢測(cè)工作。