特殊竹林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究

蘇建如， 彭艷*， 江偉， 韋杰， 欒春光， 楊成， 鄧文楷， 鄧四情

(1. 貴州民族大學生態(tài)環(huán)境工程學院, 貴陽 550025; 2.四川省宜賓竹海酒業(yè)有限公司， 宜賓 644304; 3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心， 北京 100015)

土壤微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分，極易受到外界環(huán)境影響，在林地生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用[1]。林地植被覆蓋和植被類型對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有重要影響[2]，林地植物群落多樣性關(guān)系到根際土壤提供微生物代謝的碳源種類的豐富度，決定著土壤微生物群落多樣性[3]。竹林植被單一，研究發(fā)現(xiàn)其林下土壤細菌主要來自變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)[4-5]，其中綠彎菌門是竹林土壤的特有優(yōu)勢菌[6]。對毛竹林的研究顯示，竹林非根際土壤細菌數(shù)量低于其他林地植物[7-8]，以酸桿菌門和變形菌門為主[9]，主要包括嗜糖假單胞菌Zoogloea、Pelomonas、陶厄氏菌屬Thauera、根瘤菌屬Rhizobium等[10]；而雷竹林則以綠彎菌門、酸桿菌門和變形菌門為主[11]，即不同種類的竹林土壤細菌結(jié)構(gòu)和多樣性存在較大差異。

活竹酒是將基酒注入毛竹幼竹竹腔內(nèi)自然生長三到五年所得，竹子活化了基酒中的甲醇、雜醇油等雜質(zhì)，竹酒發(fā)酵過程中吸收了竹體中對人體有益的黃酮等元素，決定了竹腔內(nèi)酒體的二次形成過程和酒體品質(zhì)的高低[12]?；谱⑷胫耋w、發(fā)酵和取酒等過程會導致基酒滲入林下土壤，改變林下土壤尤其是根際土壤環(huán)境，進而影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。利用竹林原位釀酒是一個很有商業(yè)價值的行為，目前鮮見對竹酒釀造區(qū)這種特殊環(huán)境中的竹林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的報道，因此，現(xiàn)圍繞這種活動對竹酒釀造區(qū)這種特殊竹林環(huán)境中的土壤細菌群落的研究，既能豐富特殊環(huán)境或極端環(huán)境下土壤微生物分布數(shù)據(jù)資料，還能為竹酒企業(yè)酒體形成和發(fā)酵過程的質(zhì)量控制提供環(huán)境數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 采樣區(qū)概況

采樣區(qū)位于素有“天然氧吧”之稱的“中國最美十大森林”、國家AAAA級風景區(qū)——四川宜賓長寧縣蜀南竹海竹酒釀酒生態(tài)園。長寧縣位于104°44′22″E～105°03′30″E，28°15′18″N～28°47′48″N，地勢南高北低，南北長約60 km，東西寬30 km，海拔245.9～1 408.5 m，森林覆蓋率62.8%，竹林是境內(nèi)植物一大特色,竹類品種中以楠竹、慈竹、硬頭黃竹、苦竹、斑竹為主產(chǎn)。長寧縣屬中亞熱帶濕潤性季風氣候，溫暖濕潤，雨熱同季，年均氣溫18.3 ℃，年均降雨量1 141.7 mm，日照時數(shù)987.6 h，年無霜期357 d。竹酒釀酒生態(tài)園占地150畝(1畝=667 m2)，園內(nèi)有兩萬余棵竹，園區(qū)綠化率68%，其竹海酒傳統(tǒng)釀造技藝在2018年獲得“長寧縣非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”稱號，年產(chǎn)優(yōu)質(zhì)竹海酒超過6 000 t。

1.2 土壤樣本

以竹酒工業(yè)園區(qū)竹酒竹林幾何中心為核心，在竹林核心區(qū)(J1)、非竹林區(qū)(J2)和竹林邊緣區(qū)(J3)選取生境因子基本一致的樣點，以五點采樣法采集距竹根50～60 cm的0～15 cm表層土壤，去除土壤中的石頭、樹根等雜物，充分混勻后裝入無菌采樣袋中，置于-85 ℃保存用于高通量測序。

1.3 高通量測序及生物學信息統(tǒng)計分析

1.3.1 土壤微生物宏基因組提取及檢測

利用安倍 (MP)的土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil)提取土壤微生物元基因組，瓊脂糖凝膠電泳檢測元基因組完整性后，用微量核酸測量儀NanoDrop和Qbit對其DNA進行濃度測定，OD260/280=1.8，最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性。

1.3.2 構(gòu)建元基因組文庫

以細菌16S V4區(qū)(引物為515F和806R)正向、反向引物的聚合酶鏈式反應(yīng)(forward 、reverse primer PCR)擴增得到的元基因組為模板，使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒構(gòu)建高通量測序文庫，不同樣本通過反向引物的barcode加以區(qū)別。反應(yīng)體系為50 μL，包括正反向引物各0.4 μmol/L，200 μmol/L的4種dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，1U的Taq DNA聚合酶(Kapa biosystems，Boston，US)。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 6 min，共22個循環(huán)：95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，并用QIAGEN MinElute?gel extraction kit (Cat.no. 28604, USA)回收試劑盒回收目的條帶。對每個文庫都進行了質(zhì)量檢測，包括NanoDrop ND1000 的濃度檢測(Thermo Scientific, USA)和Real-time PCR(ABI 7300)的連接效率檢測，在中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀酒中心Thermofisher IonS5TMXL測序平臺完成高通量測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀疏曲線與OTUs數(shù)分析

由圖1可知，本研究中的樣本讀長(reads)均達到6萬條以上，測序樣本物種數(shù)目(OTUs)達到平臺期，測序數(shù)據(jù)能滿足檢測微生物多樣性的要求。

圖1 樣品OTUs數(shù)與種群相對豐度的稀疏曲線Fig.1 Sparse curve of sample OTUs and the relative population abundance

2.2 基于OTUs數(shù)的韋恩圖分析

由圖2可知，各樣本的OTUs總數(shù)表現(xiàn)為竹林邊緣區(qū)J3(1 514)>非竹林區(qū)J2(1 282)>竹林核心區(qū)J1(1 233)，且J3獨有OTUs數(shù)量(245)高于J2(162)、J1(153)，說明不同生境的交匯地帶土壤細菌基因總數(shù)和獨有基因數(shù)最高；竹林邊緣區(qū)J3與竹林核心區(qū)J1的共有OTUs數(shù)為64，但與非竹林區(qū)J2的共有OTUs數(shù)為253，這可能與竹林單一的生態(tài)環(huán)境有關(guān)，單一植物種類或會降低土壤細菌群落的群落多樣性。

圖2 基于OTUs的韋恩圖Fig.2 Venn diagram based on OTUs

2.3 物種分布情況和進化樹分析

2.3.1 門水平上的物種分布分析

門水平上的研究顯示，采樣區(qū)域土壤細菌OTUs豐度排行前10的微生物菌門主要來自酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatinonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)以及擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicuates)和己科河菌門(Rokubacteria)。在前6種優(yōu)勢菌門中，放線菌門在全部樣品中總占比53.08%最高，其次是酸桿菌門18.57%和變形菌門10.39%，芽單胞菌門、綠彎菌門、疣微菌門總占比依次為7.38%、6.46%、4.12%。

為分析門水平上樣本間優(yōu)勢物種的差異，選取平均豐度排名前10的物種生成了Ternaryplot三元相圖。由圖3可以看出，樣本的優(yōu)勢種群主要是酸桿菌門、變形菌門、放線菌門次之、綠彎菌門的細菌等；放線菌門距竹林核心區(qū)J1更近，在J1中豐度較高；非竹林區(qū)J2中變形菌門、酸桿菌、綠彎菌門豐度較高；與J1、J2相比，竹林邊緣區(qū)J3中綠彎菌門豐度較低，變形菌門豐度高于J1低于J2。

圖3 門水平上排行前10的優(yōu)勢物種三元相圖Fig.3 The ternary plot of the Top 10 dominant species at the phylum level

為了進一步研究樣本間的相似性，在考慮物種豐度變化的基礎(chǔ)上，從進化角度對樣本進行了兩兩比較，完成了基于Weighted Unifrac距離矩陣的聚類分析(圖4)。由圖4可知：竹林核心區(qū)J1與竹林邊緣區(qū)J3樣本細菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，合為一類，二者與非竹林區(qū)J2差異較大，說明竹林土壤微生物有相對獨立和獨特的微生物群落；排行前10的細菌菌門的OTUs總數(shù)表現(xiàn)為竹林核心區(qū)J1高于J3、J2，即土壤細菌豐度從竹林核心區(qū)向非竹林區(qū)逐漸遞減；從細菌群落結(jié)構(gòu)來看，竹林核心區(qū)J1以放線菌門(Actinobacteria)占比最高，酸桿菌門(Acidobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)次之；竹林邊緣區(qū)J3以變形菌門占比最高，其次是放線菌門和酸桿菌門；非竹林區(qū)J2以酸桿菌門占比最高，其次是變形菌門和其他類。

圖4 門水平上的Weighted Unifrac距離矩陣聚類分析Fig.4 Cluster analysis of Weighted Unifrac distance matrix at the phylum level

2.3.2 屬或種水平上的物種分布分析

為了更為清晰地反映土壤樣品間細菌群落結(jié)構(gòu)的微觀變化，以相同的方法分析了土壤微生物屬或種水平上細菌菌群的結(jié)構(gòu)和豐度(表1)。研究結(jié)果顯示，竹林核心區(qū)J1主要以酸桿菌門酸棲熱菌屬為主，放線菌門的科維粟屬、嗜酸微生物屬、蓋萊萊屬也是其優(yōu)勢菌群。竹林邊緣區(qū)J3的優(yōu)勢菌群則包括變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬、酸桿菌門苔蘚桿菌屬、芽單胞菌門金雀花屬、疣微菌門烏代桿菌屬及綠彎菌門綠彎菌屬。對非竹林區(qū)J2而言，各類菌群豐度均較低，酸桿菌門苔蘚桿菌屬成為其優(yōu)勢菌群。隨著樣本從非竹林區(qū)逐漸接近竹林核心區(qū)，個別微生物菌群的豐度發(fā)生了顯著性變化。

表1 屬或種水平上排行前10的細菌豐度差異Table 1 The top 10 bacterial abundance differences at the genus or species level

2.3.3 屬水平上的物種進化樹分析

選擇屬水平上的Top 100代表序列進行物種進化樹分析(圖5)，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的分支的顏色表示其對應(yīng)的門，每種顏色代表一個門。結(jié)果顯示它們主要來自共有菌屬，即在屬水平上細菌群落多有著共同起源；其在群落多樣性和豐度上存在部分交叉，表明彼此間存在一定的進化相關(guān)性。

圖5 屬水平上Top100物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.5 Phylogenetic relationship among Top100 species at the genus level

2.4 樣本內(nèi)復(fù)雜度分析

為反映樣本內(nèi)部細菌群落的豐富度、多樣性及組間差異，進行α群落多樣性分析(表2)。由表2可知，三個樣本Goods Coverage指數(shù)均接近于1，表明樣本測序深度非常合理，已基本覆蓋了所有物種；非竹林區(qū)J2的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均低于J3、J1，表明竹林邊緣區(qū)J3的群落多樣性、均勻性較高、J2較低；由Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)可知，竹林邊緣區(qū)J3的物種豐富度、稀有物種數(shù)量遠高于J2、J1；OTUs數(shù)提示竹林邊緣區(qū)J3種群豐富，基于進化距離和物種豐度的PD譜系多樣性指數(shù)也顯示，J3有著更大的群落物種多樣性，群落內(nèi)物種較為復(fù)雜。

表2 樣本內(nèi)α群落多樣性分析Table 2 Analysis of α diversity within-community

2.5 樣本間比較分析

為分析不同樣本的細菌群落構(gòu)成，根據(jù)樣本OTUs豐度信息，選用 Weighted Unifrac(加權(quán)距離)、Unweighted Unifrac(非加權(quán)距離)兩個距離指標來計算兩個樣本間的距離，并描述其組間差異(圖6)，方格中的數(shù)字是兩樣本間的相異系數(shù)，同一方格上下兩個值分別代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離。

由圖6可知，非竹林區(qū)J2與竹林核心區(qū)J1的變異系數(shù)最大(0.36)，其次是與竹林邊緣區(qū)J3的變異系數(shù)(0.265)，J1與J3之間變異系數(shù)最小，說明非竹林區(qū)與竹林邊緣區(qū)、竹林核心區(qū)在細菌群落結(jié)構(gòu)方面存在的差異較大，竹林生態(tài)系統(tǒng)具有獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖6 β多樣性指數(shù)熱圖Fig.6 Heat map of β diversity index

3 討論

3.1 酸桿菌的分布及影響因子

酸桿菌門在土壤中的數(shù)量占細菌總量的20%左右[13]，在16SrRNA 基因庫中比例高達30%～50%，僅次于變形菌門[14]，有的甚至高達 65%[15]。本文研究也發(fā)現(xiàn)，釀酒環(huán)境的竹林核心區(qū)J1中放線菌門數(shù)量最多，但酸桿菌門的酸棲熱菌屬才是其優(yōu)勢菌屬，豐度達到39.26%。相關(guān)研究顯示，杉木林、馬尾松林等森林土壤細菌中酸桿菌門也是優(yōu)勢菌群(32.68%～49.17%)[16]，且中、老林的平均豐度明顯高于幼林[17]。酸桿菌的多樣性及其分布與土壤類型也有一定關(guān)系，不同的酸桿菌屬在不同林地類型土壤中相對豐度也不同。對7種常見樹林根際土壤的研究發(fā)現(xiàn)，其細菌多樣性較高，常綠樹根際土和落葉樹根際土酸桿菌亞群分布存在差異[18]。當土地利用類型改變，如原始森林轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)田后，酸桿菌相對含量由28%降到16%[19]。對農(nóng)田的研究顯示，酸桿菌門平均相對豐度為24.11%，是僅次于變形菌門(29.93%)的土壤第二大細菌類群[20]?？傮w上，酸桿菌門細菌對不同環(huán)境有很強適應(yīng)能力，在自然環(huán)境中廣泛分布，其影響因子主要包括pH[21-22]、土壤有機碳含量、土壤 C/N[27]、地表植被類型、海拔高度[23]、大氣二氧化碳含量和土壤含氮量等[24]，在不同生境之間以及同一生態(tài)環(huán)境不同區(qū)域之間其群落結(jié)構(gòu)都存在顯著性差異[12，25]，可能在各生態(tài)系統(tǒng)中均具有獨特的驅(qū)動作用及生態(tài)功能[25]。

3.2 特殊竹林土壤與其他竹林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)比較

從門水平上看，竹林土壤細菌群落的優(yōu)勢菌門具有高度一致性[6]，優(yōu)勢菌群的構(gòu)成比例差異不明顯。本文研究中竹林核心區(qū)J1竹林種類為毛竹，因此其與自然生長毛竹林[1，11，26]和其他竹林[7]的土壤細菌優(yōu)勢菌門豐度相比(表3)，放線菌門占比較高，而其他竹林土壤變形菌門占比較高。

表3 特殊竹林土壤與自然生長竹林土壤細菌優(yōu)勢菌門豐度比較Table 3 Comparison of abundance of dominant bacteria in special bamboo forest soil and natural bamboo forest soil

從屬水平上看，本研究中竹林核心區(qū)J1主要以酸桿菌門酸棲熱菌屬為主，放線菌門的科維粟屬、嗜酸微生物屬、蓋萊萊屬也是其優(yōu)勢菌群；竹林邊緣區(qū)J3的優(yōu)勢菌群則包括變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、酸桿菌門苔蘚桿菌屬(Bryobacter)、芽單胞菌門金雀花屬(Gemmatimonas)、疣微菌門烏代桿菌屬(CandidatusUdaeobacter)及綠彎菌門綠彎菌屬(Chloroflexi)；而自然生長的毛竹林地土壤細菌優(yōu)勢菌群[12]主要包括不動桿菌屬(Acinetobacter)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、酸熱菌屬(Acidoth-ermus)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)。上述研究表明活竹酒釀酒環(huán)境對竹林土壤產(chǎn)生了一定的影響，導致土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變。

竹林與其他林地土壤細菌群落種類相差較小，豐度最高的前三優(yōu)勢菌門均為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門(表4)，但綠彎菌門是竹林特有優(yōu)勢菌門[6]。對油茶林土壤微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，油茶土壤酸桿菌門、變形菌門、放線菌門和綠彎菌門相對豐度之和超過80%[27]。白樺、樟子松、興安落葉松和偃松的根圍土壤中，變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為主要優(yōu)勢菌門，相對豐度之和均高于 75.0%[28]。本文研究中處于釀酒環(huán)境的竹林核心區(qū)J1土壤4種菌門相對豐度之和達81.6%，除綠彎菌門以外的3種菌門相對豐度之和為70.8%，放線菌門相對豐度高于其他植被類型，而變形菌門相對豐度相對較低。

表4 特殊竹林土壤與其他森林土壤細菌優(yōu)勢菌門豐度比較Table 4 Comparison of bacterial dominant phyla abundance between special bamboo forest soil and other forest soil

4 結(jié)論

(1)綠彎菌門是竹林特有優(yōu)勢菌門，活竹酒釀造環(huán)境使得竹林土壤放線菌門而非變形菌門數(shù)量最多。竹林核心區(qū)土壤細菌數(shù)量低于非竹林區(qū)、竹林邊緣區(qū)，或與竹林單一生境有關(guān)。

(2)竹林核心區(qū)酸桿菌門的酸棲熱菌屬數(shù)量最多，其豐度達到39.26%。竹林與非竹林區(qū)之間的交界區(qū)域群落物種豐富度、稀有物種數(shù)量較高，群落內(nèi)物種較為復(fù)雜，優(yōu)勢菌主要來自變形菌門和綠彎菌門，但其細菌群落結(jié)構(gòu)仍與竹林土壤相似。

(3)非竹林區(qū)的各類菌群豐度均較低，以酸桿菌門苔蘚桿菌屬為主，與竹林核心區(qū)、竹林邊緣區(qū)在細菌群落結(jié)構(gòu)方面存在的差異較大，活竹酒釀造使得竹林生態(tài)系統(tǒng)具有獨特的微生物群落結(jié)構(gòu)，對揭示竹酒釀造區(qū)土壤微生物的響應(yīng)機制具有一定意義。