陳桂鋒 尚奇 李娟敏 陳弘林 招文華 余富勇 張鵬 余蝶 崔健超 沈耿楊* 任輝* 江曉兵*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)因其具有骨微結(jié)構(gòu)破壞，單位體積骨量減少，骨折風(fēng)險明顯增加的臨床特征，發(fā)病率逐年上升[1-2]。隨著我國人口老齡化的進展，OP已成為最常見的骨骼疾病，OP及由其所引起的骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率仍逐年上升。因此，開發(fā)治療OP的新藥仍然迫在眉睫。

黃芩素(Baicalein，BAI)也稱為黃芩黃素。作為中藥黃芩含量最高的成分，BAI具有抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤細胞增殖與遷移、抑制病毒增殖、降低病毒活性等多項藥理活性[3-8]。已有研究表明，BAI可促進人牙周膜細胞增殖及成骨標(biāo)志蛋白RUNX2和BMP-2的表達[9]；且可上調(diào)GPX4抑制小鼠MC3T3-E1成骨細胞的鐵死亡[10]；也可通過Wnt/β Catenin通路促進HCEM細胞成骨分化[11]。但目前尚未見BAI對小鼠MC3T3-E1細胞成骨分化的作用及從BMP-2/Smad通路探討B(tài)AI促進成骨作用機制的報道。因此，本研究以MC3T3-E1為研究對象，擬探究BAI通過調(diào)控BMP-2/Smad通路對MC3T3-E1成骨分化的影響及其作用機制，為BAI治療OP的應(yīng)用提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞及藥物

MC3T3-E1細胞株(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院贈送)，黃芩素(Sellleck公司，S2268)。

1.2 實驗儀器及試劑

DMEM低糖培養(yǎng)基(Servicebio公司，G4520-500)，胎牛血清(Cyagen公司，F(xiàn)BSAD-01011-500)，胰蛋白酶(Servicebio公司，G4001-100)，茜素紅染料(Cyagen公司)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen公司，MUXMT-90021)，CCK-8試劑盒(GLPBIO，GK1001)，熒光定量PCR試劑盒(TAKARA公司，RR420 L)，Trizol裂解液(美國Life Invitrogen，15596026)，EvoM-mLV反轉(zhuǎn)錄試劑(艾科瑞公司，AG11706)，RIPA裂解液(Solarbio公司 R0020)，BMP-2抗體(Abcam公司，ab14933，稀釋比例1∶1 000)，Smad1抗體(Abcam公司，ab33902，稀釋比例1∶2 000)，p-Smad1抗體(CST公司，#9516，稀釋比例1∶800)，RUNX2抗體(CST公司，#12556，稀釋比例1∶1 600)，COL1A1抗體(Affinity公司，AF7001，稀釋比例1∶500)，HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗均購自Affinity公司，CFX 96熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，DMI3000B倒置熒光顯微鏡(NIKON公司, 日本)，CO2電熱隔水式細胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，超凈工作臺(Thermo公司, 美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)：MC3T3-E1細胞每2～3天傳代1次，完全培養(yǎng)基由10 %FBS+90 %DMEM培養(yǎng)基配制。

1.3.2藥物配制：本研究所使用的BAI通過DMSO溶解，經(jīng)PBS稀釋后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行藥物干預(yù)。

1.3.3CCK-8檢測MC3T3-E1細胞增殖實驗：將細胞消化離心后用培養(yǎng)基重懸，并經(jīng)計數(shù)按3×104個/mL密度種入96孔板，共設(shè)置6個BAI梯度濃度，分別是0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，每組4個復(fù)孔。分別進行藥物干預(yù)后培養(yǎng)1、3、5、7 d后棄去原培養(yǎng)基后，每孔加入110 μL含CCK-8工作液的培養(yǎng)基并孵育1 h，在酶標(biāo)儀中測定吸光度。

1.3.4MC3T3-E1細胞成骨分化水平與礦化能力檢測——ALP與ARS染色：將MC3T3-E1細胞按1×104個/mL種入12孔板后。對照組用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行干預(yù)，實驗組細胞加入10 μmol/L濃度BAI進行成骨誘導(dǎo)處理，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。7 d后取出培養(yǎng)板吸出誘導(dǎo)液并沿側(cè)壁滴加PBS輕柔洗滌，加4 %多聚甲醛固定15 min后PBS洗板3次，將12孔板置于室溫中分別以堿性磷酸酶染色液(ALP)與1 %茜素紅染色液(ARS)染色0.5 h，PBS洗搖5 min，操作重復(fù)3次。染色后用掃描儀拍攝。

1.3.5MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)基因表達水平檢測——熒光實時定量PCR：①進行藥物干預(yù)后的72 h內(nèi)對MC3T3-E1細胞收集后用Trizol法提取RNA。在冰上加入1 mL/孔Trizol對6孔板細胞進行裂解，充分裂解后轉(zhuǎn)入無RNA酶EP管中，加入1/5 Trizol體積的核酸提取液上下?lián)u動后室溫靜置5 min，在4 ℃下12 000 r/min離心15 min后分次輕柔吸出上層水相，將上層水相打入新EP管并在管中加入等量異丙醇，經(jīng)充分震蕩后靜置5 min，隨后4 ℃下12 000 r/min離心15 min，將上清液輕柔吸出后加入含DEPC H2O的75 % 乙醇洗脫管中剩余的沉淀，4 ℃下7 500 r/min離心，棄去上清，室溫下干燥10～20 min，每孔加入15 μL DEPC H2O進行溶解后測量RNA濃度，分裝并保存于-80 ℃冰箱。②將提取的RNA樣品按1 μg/20 μL體系配制反應(yīng)溶液，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。③按熒光定量PCR試劑盒說明書(TAKARA公司，RR420 L)配制，12.5 μL/孔TB GreenPremix Ex Taq(2×)，及2 μL/孔cDNA，上、下游引物各0.5 μL并參照25 μL體系配平后按SYBR法開始RT-PCR反應(yīng)程序。引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.3.6MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平檢測——蛋白質(zhì)印跡法(WB)：在6孔板中按每孔2～5×105個/mL細胞密度進行種板，實驗組和對照組各干預(yù)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后每孔加入等量RIPA裂解液充分裂解后，放入低溫離心機內(nèi)14 000 r/min離心后取上清棄沉淀。將樣品稀釋液加入96孔板中進行濃度測定，分析濃度加入Loading Buffer并變性蛋白。進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉30 min，加入一抗并4 ℃孵育過夜，次日洗膜后孵育對應(yīng)二抗，顯影分析。

1.3.7MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平檢測——細胞免疫熒光實驗(IF)：將細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出，吸出培養(yǎng)液后沿培養(yǎng)板側(cè)壁滴加PBS 輕柔潤洗 2～3 次，用多聚甲醛固定30 min后PBS輕柔洗板3次，每次5 min。室溫下加入1 mL 0.3% Triton-X100進行透膜，透膜后PBS洗板，加入1 % BSA室溫下封閉1 h后PBS洗板，4 ℃下一抗孵育過夜。室溫下進行二抗避光孵育1 h后PBS洗板，進行DAPI避光染色5 min后洗板，加入抗熒光猝滅劑顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖實驗及成骨分化水平與礦化能力檢測

CCK-8檢測MC3T3-E1細胞增殖實驗：以對照組作為空白對照，BAI組加入不同濃度BAI進行干預(yù)。100、1 000 μmol/L組細胞增殖受到抑制(P<0.000 1)，而0.01、0.1、1、10 μmol/L等濃度未見細胞增殖被抑制，見圖1。

注：與Control組比較，**** P <0.0001。

BAI對MC3T3-E1細胞成骨分化水平與礦化能力檢測：將MC3T3-E1細胞種板后分組，按10 μmol/L干預(yù)并成骨誘導(dǎo)7 d后，分別進行ALP、ARS染色，發(fā)現(xiàn)BAI組的礦化結(jié)節(jié)明顯增加，見圖2。

圖2 黃芩素促進成骨分化及礦化的染色結(jié)果Fig.2 The staining results of Baicalein promoting osteoblast differentiation and mineralization

2.2 BAI對MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)基因表達水平檢測

與對照組比較，10 μmol/L BAI干預(yù)1 d后發(fā)現(xiàn)，BAI組COL1A1(P<0.001)、RUNX2(P<0.05)、OSX(P<0.05)mRNA表達水平在成骨分化中表達上升，ALP mRNA表達水平有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3A。10 μmol/L BAI干預(yù)3 d后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BAI組ALP(P<0.05)mRNA表達水平上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；RUNX2(P<0.001)表達上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3B。10 μmol/L BAI干預(yù)7 d后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BAI組COL1A1 mRNA表達水平上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3C。

注：與Control組比較，* P <0.05，** P <0.001。

2.3 BAI對MC3T3-E1細胞BMP-2與 p-Smad1、Smad1蛋白的影響

與對照組比較，BAI組中的BMP-2表達水平上升(P<0.05)，見圖4B。經(jīng)BAI干預(yù)后MC3T3-E1的Smad1表達水平未見差異，p-Smad1表達上升。BAI實驗組p-Smad1/ Smad1表達水平較對照組增加(P<0.05)，見圖4B。

注：與Control組比較，* P <0.05。

2.4 BAI對MC3T3-E1細胞RUNX2、COL1A1蛋白表達的影響

對照組與BAI實驗組鏡下觀察均可見RUNX2、COL1A1蛋白熒光標(biāo)記，見圖5A。與對照組相比，BAI組熒光強度增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5B。

注：與Control組比較，** P <0.001。

3 討論

OP作為一種代謝性骨病，其骨量受成骨/破骨細胞介導(dǎo)的骨形成-骨吸收平衡調(diào)控，目前臨床只有通過減少骨量丟失、促進骨形成兩種方式進行治療。大多數(shù)治療OP的方法是通過抑制破骨以減少骨量丟失[2,13-15]。臨床應(yīng)用抗骨吸收藥物治療OP可提高總體生存率，但也有誘發(fā)不良反應(yīng)的風(fēng)險[2,13-14,16]。通過增加成骨細胞的數(shù)量或活性靶向骨形成被認(rèn)為是一種更有吸引力的治療方法以增加骨形成和促進骨再生。因此，進一步挖掘促進成骨分化的藥物很有必要。BAI作為一種黃酮類化合物，廣泛存在于多種中藥中，與促進干細胞分化、抑制炎癥損傷、減少氧化應(yīng)激、促進腫瘤細胞凋亡關(guān)系密切。近年來已有研究發(fā)現(xiàn)BAI在成骨分化、破骨分化、腫瘤凋亡等領(lǐng)域治療效果顯著[17-20]，但BAI促進成骨分化的具體機制仍不明確。

不同濃度BAI對細胞增殖的作用略有差異。王彩瓊等[9]發(fā)現(xiàn)10 μmol/L為BAI干預(yù)人牙周膜細胞的適宜濃度且對ALP活性上調(diào)最顯著。本研究首先通過CCK-8實驗篩選BAI的干預(yù)濃度，探討B(tài)AI促進MC3T3-E1增殖的作用。CCK-8結(jié)果顯示，在0.01、0.1、1、10 μmol/L濃度下BAI對MC3T3-E1細胞增殖無影響。當(dāng)BAI濃度為100 μmol/L和1 000 μmol/L時抑制MC3T3-E1細胞增殖(P<0.000 1)。因此10 μmol/L是不影響細胞正常增殖的最大濃度，我們在后續(xù)研究使用10 μmol/L作為BAI干預(yù)MC3T3的最佳濃度。該濃度與既往文獻探討B(tài)AI對MC3T3-E1的最佳濃度結(jié)果一致[9]。

被認(rèn)為是成骨分化早期標(biāo)志物的ALP在骨形成和骨礦化中具有重要作用。MC3T3-E1細胞成骨分化可見ALP表達上升。本研究發(fā)現(xiàn)BAI可促進ALP活性上升與ARS深染，促進RUNX2、COL1A1、OSX成骨標(biāo)志物表達。有文獻[9]報道不同濃度下BAI均可促進hPDLCs的ALP活性，其中10 μmol/L濃度BAI可明顯促進成骨相關(guān)標(biāo)志物RUNX2和BMP-2的mRNA表達水平，與本研究的結(jié)果相符，表明BAI可促進MC3T3-E1的成骨分化。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)/Smad通路被認(rèn)為在骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，如何通過激活該通路促進成骨細胞分化，進而促進骨形成以防治OP仍需探索。BMP-2/Smad通路在成骨細胞增殖和分化的作用已被充分證實[19,21-23]。BMP-2作為轉(zhuǎn)化生長因子家族中最大的糖蛋白肽之一，家族成員眾多。BMP-2作為驅(qū)動成骨分化不可或缺的生長因子，能與細胞膜受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)Smad通路，促進Smad1、5、8等轉(zhuǎn)導(dǎo)因子磷酸化，形成Smad復(fù)合物進入細胞核，促進RUNX2轉(zhuǎn)錄表達，并激活RUNX2以促進早期成骨mRNA的表達[24-25]。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)BAI可促進成骨分化的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究了BAI對成骨相關(guān)基因與蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)BAI在成骨分化的不同時間可不同程度地上調(diào)ALP、RUNX2、COL1A1、OSX、BMP-2等成骨標(biāo)志基因表達水平。BAI可上調(diào)BMP-2、p-Smad1等蛋白表達，提示BAI激活BMP-2/Smad通路可能是BAI促進MC3T3-E1成骨分化的途徑之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BAI可通過激活BMP-2/Smad通路以促進MC3T3-E1成骨分化。但本研究只基于細胞水平，存在一定的局限性，后續(xù)仍需要動物體內(nèi)實驗進一步探討并及運用基因敲除及過表達技術(shù)對其作用進行深入研究。