基于牡丹皮微觀性狀與抗炎活性相關(guān)的“辨狀論質(zhì)”研究

陳依婷，王冰，孫艷濤，王詩(shī)雨，吳俊英

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600）

“辨狀論質(zhì)”是指根據(jù)藥材性狀的特點(diǎn)判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣［1］。中藥的“狀”既包括宏觀特征，如中藥材的形、色、表面和質(zhì)地等，也包括微觀特征，即中藥顯微特征［2］。目前國(guó)內(nèi)外“辨狀論質(zhì)”機(jī)制的研究較少，囊括的藥材僅30余種，大多基于藥材的宏觀特征，運(yùn)用感官技術(shù)來(lái)進(jìn)行“辨狀論質(zhì)”研究［3－5］。質(zhì)量評(píng)價(jià)方面，大多是研究藥材性狀與所含化學(xué)成分含量之間相關(guān)性［6］，而一種或幾種化學(xué)成分的活性并不能完全代表藥材的整體藥效，因此根據(jù)活性成分的含量判斷中藥質(zhì)量有一定的片面性。本實(shí)驗(yàn)選擇牡丹皮為研究對(duì)象，通過(guò)研究其顯微特征和抗炎藥理活性，考察二者之間存在的相關(guān)性，為牡丹皮“辨狀論質(zhì)”研究提供參考依據(jù)。

牡丹皮為毛茛科芍藥屬植物牡丹（Paeonia suffruticaosaAndr.）的干燥根皮［7］。牡丹皮有清熱涼血、活血化瘀的功效，可令血流暢而不留瘀，血熱清而不妄行，用于熱入營(yíng)血、溫毒發(fā)斑、吐血和衄血等［8］。臨床也可用于降血糖、抗菌消炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等［9］。當(dāng)前國(guó)內(nèi)有關(guān)牡丹皮“辨狀論質(zhì)”機(jī)制的研究甚少，國(guó)外對(duì)牡丹皮的研究多是基于內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析、對(duì)牡丹皮代謝產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)等［10－11］，未見(jiàn)涉及牡丹皮“辨狀論質(zhì)”的研究。牡丹皮粉性足，氣芳香，其所含淀粉粒及草酸鈣簇晶眾多，且簇晶直徑9～45 μm，排列成行，是牡丹皮最具特色的顯微特征［12］。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牡丹皮粉末中草酸鈣簇晶顯微特征明顯且易于計(jì)數(shù)［13］，極具代表性。牡丹皮的抗炎活性現(xiàn)代應(yīng)用較為廣泛［14］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇抗炎活性作為牡丹皮藥效的研究。通過(guò)對(duì)二者的相關(guān)性分析，揭示牡丹皮基于微觀性狀與抗炎活性的“辨狀論質(zhì)”內(nèi)涵。

1 儀器與試材

1.1 儀器

生物顯微鏡（Nikon E100）；TD 型電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；微量移液器（Thermo 賽默飛F2系列單道移液器）；足腫脹測(cè)定儀（KW－7C）；軟尺。

1.2 主要試劑

水合氯醛（天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：302－17－0，分析純）；甘油（商丘圣邦生物科技有限公司，批號(hào)：190202）；角叉菜膠（Simga，批號(hào)：127H1227）；乙酰水楊酸（純度＞91%，HPLC）由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

牡丹皮藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院康廷國(guó)教授鑒定均為正品藥材，見(jiàn)表1。健康小鼠250 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（遼）2020－0001。

表1 22批牡丹皮藥材產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 牡丹皮的顯微特征

2.1.1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

采用三因素六水平均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，見(jiàn)表2。取1號(hào)牡丹皮藥材粉碎，按均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表分別過(guò)80目、100目篩，精密稱定50、80、120、150、180、200 mg共6份樣品于10 mL容量瓶中，加入相應(yīng)的甘油量后，用水合氯醛定容，搖勻，用微量移液器吸取50 μL于載玻片上，蓋好蓋玻片。6份溶液各平行裝片50張，在生物顯微鏡下觀察簇晶并計(jì)數(shù)。將所得結(jié)果平均分為5組并取平均值，計(jì)算每組平均值的RSD，見(jiàn)表3。

表2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表

表3 均勻設(shè)計(jì)結(jié)果

設(shè)Y為RSD%值，X1為樣品重量，X2為藥材粉碎粒度，X3為甘油量。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)結(jié)果可得：Y=117.760－0.937X2，R= 0.966，F(xiàn)= 55.063，Ymin =24.06。由此可知，影響RSD值的主要因素為X2粉碎粒度，X1、X3與Y無(wú)明顯相關(guān)性，可依實(shí)驗(yàn)情況而定。為降低RSD值，最佳水平組合條件為：樣品重量120 mg，粉碎粒度100目，加入甘油2 mL。

2.1.2 牡丹皮中顯微特征指數(shù)的測(cè)定

取22 批牡丹皮藥材粉末過(guò)100 目篩，精密稱定120 mg藥粉于10 mL容量瓶中，精密加入2 mL甘油，用水合氯醛定容，搖勻，用微量移液器吸取50 μL 于載玻片上，蓋好蓋玻片，每份溶液平行紙片50 張，于顯微鏡下觀察簇晶，計(jì)數(shù)，所得結(jié)果分為5組并取每組平均值，按照公式（1）計(jì)算［15］，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。可以看出個(gè)別批次的牡丹皮顯微特征指數(shù)明顯較高，有的牡丹皮顯微特征指數(shù)區(qū)間相近。

表4 牡丹皮顯微特征指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s）

表4 牡丹皮顯微特征指數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s）

樣品號(hào)顯微特征指數(shù)（個(gè)/mg）顯微特征指數(shù)（個(gè)/mg）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 343±270 1 307±289 1 632±190 1 484±278 1 088±285 1 276±260 1 396±338 1 293±276 1 361±313 1 305±224 1 523±321樣品號(hào)12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 706±309 1 831±217 2 188±433 1 445±257 2 016±407 1 636±343 2 681±663 1 856±170 2 023±319 1 461±332 1 597±293

其中，P：定量藥材顯微特征指數(shù)（個(gè)/mg）；X：每片蓋玻片下藥材顯微特征數(shù)；V：定量藥材混懸液總體積（mL）；V'：蓋玻片下藥材混懸液體積（mL）；W：藥材重量（mg，按干燥品計(jì)）。

2.1.3 牡丹皮簇晶數(shù)據(jù)聚類分析

以簇晶數(shù)據(jù)為變量，采用系統(tǒng)聚類法對(duì)不同來(lái)源的牡丹皮進(jìn)行聚類分析，所得垂直冰柱圖見(jiàn)圖1。

圖1 牡丹皮簇晶數(shù)據(jù)垂直冰柱圖

當(dāng)群集數(shù)為5時(shí)，22批牡丹皮被劃分為5類：第Ⅰ類群包括11個(gè)品種，編號(hào)分別為1、2、4、6、7、8、9、10、11、15、21；第Ⅱ類群僅1 個(gè)品種，編號(hào)為5；第Ⅲ類群包括6 個(gè)品種，編號(hào)分別為3、12、13、17、19、22；第Ⅳ類群包3個(gè)品種，編號(hào)分別為14、16、20；第Ⅴ類群僅1個(gè)品種，編號(hào)為18。將顯微特征指數(shù)測(cè)定值與聚類分析結(jié)合，按照顯微特征指數(shù)測(cè)定值高低分出5 個(gè)類群的大小排列：Ⅴ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。

2.2 牡丹皮抗炎活性測(cè)定

2.2.1 供試品溶液制備

取22 批牡丹皮藥材適量，分別加5 倍量75%乙醇，回流提取2 次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，得到牡丹皮流浸膏［16］。

2.2.2 牡丹皮抗炎情況測(cè)定

小鼠250 只，隨機(jī)分為25 組，每組10 只，分別為空白組、模型組、給藥組1～22組和陽(yáng)性組［17］。其中，各給藥組小鼠分別灌胃給予22 批牡丹皮提取液0.6 g/mL，陽(yáng)性組小鼠灌胃陽(yáng)性對(duì)照品阿司匹林溶液0.125 g/mL［18］。連續(xù)灌胃4 d，最后1次灌胃40 min后，除空白組外，對(duì)其余各組小鼠采用左后足趾處注射1%角叉菜膠混懸液0.05 mL 的方法建立炎性小鼠模型［19］，空白組小鼠于同部位注射等量生理鹽水。于造模前及造模5、30 min和1、2、4 h后測(cè)量各組小鼠左足踝關(guān)下0.5 mm 處的周長(zhǎng)［20］。足腫脹抑制率用造模后相對(duì)于造模前周長(zhǎng)的增加值表示［21］。結(jié)果見(jiàn)表5，可以看出個(gè)別牡丹皮的抑制率較高，有的牡丹皮的抑制率區(qū)間相近。

表5 不同批牡丹皮足腫脹抑制率結(jié)果（±s）

表5 不同批牡丹皮足腫脹抑制率結(jié)果（±s）

樣品號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11抑制率（%）39.54±31.82 39.80±36.97 46.11±26.90 75.04±17.88 63.48±20.13 68.84±26.24 73.71±36.23 31.80±39.73 81.61±49.81 49.95±26.61 61.74±19.09樣品號(hào)12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22抑制率（%）58.93±22.94 65.51±23.69 60.72±26.27 60.76±39.04 80.89±24.69 73.27±33.00 97.76±37.50 52.59±25.84 96.41±19.36 60.86±34.06 89.14±24.62

足腫脹抑制率=（對(duì)照組足平均腫脹度－給藥組足平均腫脹度）/對(duì)照組足平均腫脹度×100%

2.2.3 牡丹皮抗炎情況聚類分析

以抗炎數(shù)據(jù)為變量，采用系統(tǒng)聚類法對(duì)不同產(chǎn)地的牡丹皮進(jìn)行聚類分析，所得垂直冰柱圖如圖2所示。

圖2 牡丹皮抗炎情況垂直冰柱圖

當(dāng)群集數(shù)為5時(shí)，22批牡丹皮被劃分為5類：第Ⅰ類群包括3 個(gè)品種，編號(hào)分別為1、2、8；第Ⅱ類群包括3個(gè)品種，編號(hào)為3、10、19；第Ⅲ類群包括11個(gè)品種，編號(hào)分別為4、7、17、6、5、13、11、14、15、21、12；第Ⅳ類群包括3 個(gè)品種，編號(hào)分別為9、16、22；第Ⅴ類群包括2 個(gè)品種，編號(hào)為18、20。將足腫脹抑制率數(shù)值與聚類分析結(jié)合，按照足腫脹抑制率高低分出5 個(gè)類群的大小排列：Ⅴ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。

2.3 牡丹皮簇晶顯微特征指數(shù)與抗炎藥效相關(guān)性研究

運(yùn)用SPSS 17.0 軟件，對(duì)簇晶顯微特征指數(shù)與足腫脹抑制率進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果如下：相關(guān)系數(shù)R= 0.518，變量呈中等程度正相關(guān)；P= 0.007 ＜0.01，變量相關(guān)性顯著?？梢钥闯霾煌瑏?lái)源牡丹皮藥材簇晶顯微特征指數(shù)與其足腫脹抑制率呈顯著中等程度正相關(guān)，即簇晶顯微特征指數(shù)越大，足腫脹抑制率越高。

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)基于牡丹皮顯微特征（簇晶）與抗炎活性的相關(guān)性分析來(lái)評(píng)價(jià)闡釋“辨狀論質(zhì)”理論機(jī)制。相關(guān)性分析結(jié)果中，不同來(lái)源牡丹皮中簇晶顯微特征指數(shù)與抗炎活性有較顯著的相關(guān)性，呈中度正相關(guān)，中藥的藥理活性直接反映藥材的優(yōu)劣，說(shuō)明牡丹皮簇晶的顯微特征指數(shù)可作為判斷藥材品質(zhì)優(yōu)劣的參考指標(biāo)。聚類分析結(jié)果中，山東青島的牡丹皮藥材（編號(hào)18）中簇晶的顯微特征常數(shù)明顯多于其他來(lái)源，其抗炎藥理作用也較其他來(lái)源的牡丹皮較為顯著，說(shuō)明產(chǎn)于山東青島的牡丹皮品質(zhì)較優(yōu)，在牡丹皮的使用中可以優(yōu)先考慮該來(lái)源。其余的21 個(gè)品種中，相同產(chǎn)地的大都分為一類，說(shuō)明來(lái)源相同的牡丹皮質(zhì)量基本保持一致。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)微觀性狀－簇晶進(jìn)行了研究，拓展了中藥“辨狀論質(zhì)”理論中“狀”的范圍，即中藥的“狀”既包括藥材宏觀性狀，也應(yīng)包括微觀性狀，即藥材的顯微特征。通過(guò)“狀－效”關(guān)聯(lián)研究，表明藥材的顯微特征與藥理活性存在關(guān)聯(lián)，可以通過(guò)定性定量測(cè)定藥材性狀判別藥材品質(zhì)，可為中藥“辨狀論質(zhì)”科學(xué)內(nèi)涵的研究提供參考依據(jù)。