王若妍,胡銘倩,瞿聞馨,范賽榮
溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(生命科學(xué)學(xué)院),浙江 溫州 325035
前列腺癌的發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中高居第二,2020年全球約有141多萬人新患前列腺癌,約有37.5萬人因前列腺癌而喪生[1-2]。據(jù)我國2020年對(duì)前列腺癌的專項(xiàng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),2017年我國男性前列腺癌新增患者數(shù)、死亡人數(shù)、發(fā)病率及病死率均大幅增加[3]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中往往伴隨著異常的糖基化修飾,直接影響著腫瘤細(xì)胞的生長、黏附、轉(zhuǎn)移、規(guī)避免疫監(jiān)視等[4-6],已逐漸被認(rèn)為是腫瘤的又一新特征[7]。巖藻糖基化是與癌癥最密切相關(guān)的糖基化修飾之一,由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase, FUT)催化介導(dǎo)[8-9]。研究表明,F(xiàn)UT在多種腫瘤中存在異常表達(dá),如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等,且與腫瘤的分期、預(yù)后等具有一定的相關(guān)性[10-11]。研究表明FUT2在肺腺癌中異常表達(dá),且參與了肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控[12],但FUT2與前列腺癌的相關(guān)性未見相關(guān)報(bào)道。為此我們以FUT2為研究對(duì)象,探討FUT2對(duì)前列腺癌生物學(xué)功能的影響,為前列腺癌的早期診斷及分子靶向治療提供潛在的靶標(biāo)和理論依據(jù)。
1.1 材料 臨床前列腺癌組織芯片購自西安百思達(dá)生物科技有限公司。前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物所。FUT2低表達(dá)載體psi-U6.1/eGFP/Puro-FUT2、空載載體psi-U6.1/eGFP/Puro-NC均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建;胎牛血清FBS購自美國Hyclone公司;DMEM培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)基、PBS均購自美國Gibco公司;β-catenin抗體購自美國Santa Cruz公司;ICAM-1抗體、Cyclin D1抗體、FUT2抗體、β-actin抗體、Tubulin抗體、GAPDH抗體購自美國Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn):將組織芯片烤至石蠟融化后脫蠟、復(fù)水、洗滌,加適量枸櫞酸鈉緩沖液,加熱至沸騰,中高火8 min而后冷卻,反復(fù)3次后自然冷卻,PBS洗滌,3% H2O2孵育后洗滌,之后5% BSA封閉,孵育一抗,4 ℃過夜。孵育二抗,37 ℃恒溫箱孵育1 h,DAB顯色,蘇木素復(fù)染并沖洗,乙醇脫水,透明后封片。
1.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建FUT2低表達(dá)的細(xì)胞株和空載細(xì)胞株:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將FUT2的兩種不同序列的RNA干擾質(zhì)粒、無義對(duì)照質(zhì)粒依托脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)入PC-3細(xì)胞;篩出陽性的單克隆細(xì)胞團(tuán),構(gòu)建穩(wěn)定傳代的FUT2低表達(dá)細(xì)胞株和空載細(xì)胞株。
1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn):胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種至96孔板,加入帶有MTT試劑的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后檢測吸光度。同樣方法分別檢測培養(yǎng)48 h和72 h后的細(xì)胞,最后將數(shù)據(jù)整理分析。
1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn):取生長對(duì)數(shù)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞消化計(jì)數(shù),將細(xì)胞懸液稀釋,以3 000個(gè)細(xì)胞/孔接種12孔板,培養(yǎng)10 d。出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí),用結(jié)晶紫染液染色后相機(jī)拍照。
1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,調(diào)整懸液濃度,吸取200 μL至Transwell小室上室,下室加入600 μL含有20% FBS的培養(yǎng)基,輕輕搖晃放置培養(yǎng)箱中48 h拿出,將小室甲醛固定后染色,用ddH2O清洗后顯微鏡下拍照觀察。
1.2.6 Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn):Matrigel基質(zhì)膠與培養(yǎng)液按1∶9比例混合后向每個(gè)小室的上室加入40 μL置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,12 h后將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,調(diào)整懸液濃度,吸取200 μL至提前加入Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室,下室加入600 μL含有20% FBS的培養(yǎng)基,輕輕搖晃放置培養(yǎng)箱中48 h拿出,將小室甲醛固定后染色,用ddH2O清洗后顯微鏡下拍照觀察。
1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn):提取細(xì)胞總蛋白并測定蛋白濃度,配置濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠,上樣,進(jìn)行穩(wěn)壓電泳分離待測蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,1×TBST洗滌3遍后根據(jù)目的蛋白分子量切目的條帶及內(nèi)參,一抗4 ℃搖床孵育過夜,孵育結(jié)束,1×TBST進(jìn)行洗滌,采用二抗室溫孵育1 h,1×TBST洗滌后曝光。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用±s表示,2組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 FUT2在前列腺癌組織中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明:FUT2在前列腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于其在正常前列腺組織中的表達(dá)水平(P<0.05),見圖1。
圖1 FUT2在前列腺癌組織中的表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)
2.2 FUT2低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建FUT2低表達(dá)的細(xì)胞株和空載細(xì)胞株,Western blot檢測FUT2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,與空載對(duì)照(NC)組比,干擾FUT2表達(dá)后,PC-3細(xì)胞中的FUT2蛋白表達(dá)顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2,表明FUT2低表達(dá)的前列腺癌PC-3細(xì)胞株構(gòu)建成功。
圖2 FUT2低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定
2.3 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞克隆增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載對(duì)照(NC)組相比,F(xiàn)UT2低表達(dá)的前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組相比,F(xiàn)UT2低表組細(xì)胞的單克隆團(tuán)數(shù)量明顯減少(P<0.05),表明干擾FUT2的表達(dá)能抑制PC-3細(xì)胞的單克隆形成能力。見圖3。
圖3 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞克隆增殖能力的影響
2.4 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移的影響 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與NC組比,F(xiàn)UT2低表達(dá)組(shFUT2#1和shFUT2#2)遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05),見圖4。
圖4 FUT2對(duì)PC-3細(xì)胞遷移能力的影響(×100)
2.5 FUT2對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲的影響 Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)表明,與NC組比,F(xiàn)UT2低表達(dá)組(shFUT2#1、shFUT2#2)細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05),提示下調(diào)FUT2的表達(dá)能抑制人前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力,見圖5。
圖5 FUT2對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)
2.6 FUT2對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵分子β-catenin和Cyclin D1表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示,與NC組相比,F(xiàn)UT2低表達(dá)組中β-catenin蛋白的表達(dá)水平并無明顯變化,但是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游關(guān)鍵信號(hào)分子Cyclin D1的表達(dá)水平在FUT2低表達(dá)組顯著降低(P<0.05),見圖6,提示FUT2可能參與了Wnt/β-catenin信號(hào)的傳導(dǎo)。
圖6 FUT2對(duì)β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響
2.7 FUT2對(duì)ICAM-1蛋白的表達(dá)影響 ICAM-1是一種黏附分子,可以作為受體分子介導(dǎo)細(xì)胞的黏附,同時(shí)也具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的功能。Western blot結(jié)果表明,F(xiàn)UT2低表達(dá)組(shFUT2#1、shFUT2#2)中ICAM-1的表達(dá)量顯著高于NC組(P<0.05),見圖7,提示干擾FUT2能促進(jìn)ICAM-1的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞的黏附能力。
圖7 FUT2對(duì)ICAM-1蛋白表達(dá)的影響
糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾最為常見的一種修飾方式,通過糖基化修飾賦予了蛋白質(zhì)更為多樣的結(jié)構(gòu)及功能,以執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)的各種復(fù)雜多樣的生命活動(dòng)。許多細(xì)胞膜表面受體及轉(zhuǎn)錄因子都存在糖基化修飾位點(diǎn),影響蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮。蛋白質(zhì)的異常糖基化現(xiàn)象在腫瘤中較為常見,在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌中均有發(fā)現(xiàn)由糖基轉(zhuǎn)移酶異常表達(dá)而催化產(chǎn)生的異常糖基化現(xiàn)象[14]。FUT作為介導(dǎo)巖藻糖基化修飾的關(guān)鍵酶,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中往往存在異常的表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13,15]。
基于前列腺癌組織芯片的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)FUT2在前列腺癌與正常前列腺組織中的表達(dá)量存在差異;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將空載載體和低表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到前列腺癌PC-3細(xì)胞中,采用抗藥性篩選得到穩(wěn)定低表達(dá)的FUT2前列腺癌細(xì)胞株,一系列生物學(xué)功能研究表明,F(xiàn)UT2能促進(jìn)前列腺細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,進(jìn)而影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。
Wnt/β-catenin信號(hào)通路與器官形成、組織再生等有關(guān),越來越多的研究報(bào)道證實(shí),在腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路被激活的現(xiàn)象,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系[16-17]。Cyclin D1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的關(guān)鍵信號(hào)分子,其表達(dá)水平的升高往往提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的活化。本研究結(jié)果表明干擾FUT2的表達(dá)能顯著抑制Cyclin D1的表達(dá)水平,提示FUT2可能參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)干擾FUT2的表達(dá)并不影響β-catenin的表達(dá)。作為Wnt/β-catenin信號(hào)的核心分子,β-catenin的磷酸化水平及其核漿分布將決定了該信號(hào)通路的活化狀態(tài)[18]。因此,F(xiàn)UT2是否參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控有待進(jìn)一步深入探討。另一方面,Cyclin D1作為一種S期周期蛋白對(duì)細(xì)胞周期具有重要的調(diào)控作用[19],這可能與下調(diào)FUT2表達(dá)能抑制PC-3細(xì)胞增殖相關(guān)。此外,F(xiàn)UT2對(duì)調(diào)黏附因子ICAM-1表達(dá)水平的調(diào)控作用,可能與前列腺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力相關(guān)。
綜上所述,F(xiàn)UT2在前列腺癌組織中表達(dá)水平異常升高,干擾FUT2的表達(dá)能抑制前列腺細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)功能,表明FUT2在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的調(diào)控作用,可能是前列腺癌診療潛在的靶標(biāo),但相關(guān)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討研究。
溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2022年10期