微囊藻毒素-LR長(zhǎng)期低劑量暴露誘導(dǎo)小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷：基于激活PI3K/AKT信號(hào)通路

梁小芳，楊 越，徐帥帥，劉 映，褚晗玉，唐 艷，楊 飛，

1南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院//湖南省典型環(huán)境污染與健康危害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3蘇州市吳中區(qū)疾病預(yù)防與控制中心，江蘇 蘇州215100

微囊藻毒素-LR（MC-LR）是一種在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率較高、產(chǎn)量較大和造成危害較嚴(yán)重的藻毒素［1］。MC-LR可通過(guò)飲水、食物鏈傳遞及水上活動(dòng)等方式進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)動(dòng)物健康造成嚴(yán)重威脅［2,3］。有研究表明腎臟是MC-LR特異性分布的重要靶器官之一［4］，實(shí)驗(yàn)證明小鼠經(jīng)口服、腹腔注射和靜脈MC-LR后，其腎臟中MC-LR含量遠(yuǎn)高于其他器官［5］。同時(shí)有研究提出MC-LR的暴露可引起腎臟損傷［2,6-11］。有體外實(shí)驗(yàn)表明，MC-LR可以阻滯G2/M期細(xì)胞群誘導(dǎo)人胚胎腎和人腎腺癌細(xì)胞凋亡［7］。同時(shí)在丁卡魚(yú)、羅非魚(yú)、鯽魚(yú)和小鼠的急性毒性試驗(yàn)中，觀察到MC-LR可以引起這些動(dòng)物腎臟結(jié)構(gòu)不同程度的病理改變，如腎小體的增大。鮑曼腔變寬并填充嗜酸性物質(zhì)、腎小體鮑曼囊增厚等［8-11］。然而這些研究多為腹腔途徑注射MC-LR后對(duì)腎臟的影響，且大都是急性染毒，僅有本課題組的前期做過(guò)MC-LR飲水染毒小鼠6月的研究［2］。且并未有研究對(duì)MC-LR長(zhǎng)期暴露引起腎損傷的作用及其機(jī)制進(jìn)行過(guò)探討。

磷脂酰肌醇3-激酶（AKT）信號(hào)通路已被確定對(duì)癌癥重要的3個(gè)主要信號(hào)通路之一，是一條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它支持新陳代謝，影響細(xì)胞周期、存活、凋亡、增殖、生長(zhǎng)和血管生成［12］。有研究表明MCLR可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路。許鵬飛等［13］的結(jié)果顯示MC-LR通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)黑色素瘸細(xì)胞侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移，同時(shí)又有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活與腎臟損傷密切相關(guān)［14,15］。Hakim等［14］發(fā)現(xiàn)，多囊腎病和腎功能衰竭與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)，Zhao等［15］的研究結(jié)果顯示阿拉曼定通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路，可以抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，從而改善腎功能，以此減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腎膿毒癥。由此推測(cè)MC-LR可以通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而引起腎損傷。

本文通過(guò)飲水染毒MC-LR（0、1、60、120 μg/L）12個(gè)月，建立體內(nèi)飲用水長(zhǎng)期染毒動(dòng)物模型，研究長(zhǎng)期低劑量暴露MC-LR對(duì)腎臟損傷的作用。并利用體外MC-LR染毒與PI3K/AKT抑制劑聯(lián)合染毒模型進(jìn)一步地探討PI3K/AKT信號(hào)通路在MC-LR致腎臟損傷中的作用及其分子機(jī)制。本研究可為預(yù)防和治療MC-LR引起的慢性腎臟疾病提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑

MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)品（北京伊普瑞斯技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；人正常胚胎腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞由中南大學(xué)馮湘玲老師贈(zèng)送；胎牛血清、雙抗和0.25%EDTA胰蛋白酶（Gibco）；DMEM 培養(yǎng)基、PI3K 抑制劑LY294002（Sigma）；血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、肌酐（Cr）（南京建成生物）；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒（南京諾唯贊）；PCR引物（上海生工生物）；PI3K抗體、AKT抗體、兔二抗、鼠二抗（三鷹）；p-PI3K抗體、p-AKT抗體（Cell Signaling Technology）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組與處理 選取健康6～8周齡C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量為20～23 g，購(gòu)自湖南省斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，喂養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物中心（許可編號(hào)：XYGW-2018-41），所有實(shí)驗(yàn)通過(guò)倫理委員會(huì)審核（XYGW-2018-41號(hào)）。將20只小鼠隨機(jī)平均分成4組，給予新配置的染毒水（0、1、60和120 μg/L），2次/周，小鼠MC-LR染毒時(shí)間持續(xù)12月。1次/月稱取小鼠體質(zhì)量。小鼠飼養(yǎng)滿12月后，通過(guò)摘眼球取血法收集小鼠血液，引頸處死后取出腎臟，稱量并記錄腎臟的絕對(duì)質(zhì)量和相對(duì)質(zhì)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將HEK293細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃恒溫飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HEK293細(xì)胞分為對(duì)照組（Control）、10 μmol/L LY294002（PI3K 抑制劑）組、15 μmol/L MC-LR組和MC-LR+LY294002組。在MC-LR染毒處理前1 h加入LY294002，處理24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 腎臟組織切片與HE染色 用生理鹽水清洗腎臟后，用刀片劃出厚度小于5 mm的腎臟組織，置于4%的多聚甲醛中室溫固定1～2 d。將組織送至武漢谷歌生物科技有限公司制作HE染色切片。主要步驟為：制作石蠟切片—二甲苯/無(wú)水乙醇/75%酒精脫蠟—蘇木素染色—酒精脫水—伊紅染色—無(wú)水乙醇/二甲苯脫水—中性樹(shù)膠封片。

1.2.4 試劑盒檢測(cè)腎臟生化指標(biāo) 按試劑盒步驟，吸取凍融血清和HEK293細(xì)胞上清液于潔凈的200 μL EP管，分別用BUN試劑盒和SCr（Cr）試劑盒測(cè)定腎功能指標(biāo)BUN和SCr（Cr）水平。

1.2.5 qPCR 檢測(cè)相關(guān)炎癥因子mRNA 的表達(dá) 使用Trizol試劑提取小鼠腎臟和HEK293細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和A260/280比值，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Primer Premier 5.0軟件中設(shè)計(jì)引物，然后將設(shè)計(jì)好的引物NCBI中進(jìn)行驗(yàn)證，交由中國(guó)上海生工生物合成，引物序列見(jiàn)表1。進(jìn)行三步法qPCR反應(yīng)程序：預(yù)變性（95 ℃持續(xù)30 s），接著進(jìn)行40個(gè)變性（95 ℃持續(xù)10 s）、退火（60 ℃持續(xù)30 s）、延伸（72 ℃持續(xù)25 s）循環(huán)。在擴(kuò)增階段完成后分析熔解曲線。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，使用GraphPad Prism 6.0軟件繪圖進(jìn)行。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況 用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取小鼠腎臟、HEK293細(xì)胞蛋白，根據(jù)蛋白分子量大小將蛋白進(jìn)行分離，之后通過(guò)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)移到固定載體，隨后以轉(zhuǎn)移到固定載體的蛋白質(zhì)為抗原，與相關(guān)蛋白的抗體起免疫反應(yīng)，最后與HRP標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，顯影以檢測(cè)p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表達(dá)，最終用Image J進(jìn)行灰度值分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本比較選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組樣本比較選用單因素方差分析。雙側(cè)檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況

實(shí)驗(yàn)小鼠在整個(gè)飼養(yǎng)周期內(nèi)，生命體征平穩(wěn)，未出現(xiàn)中途死亡等意外情況。在染毒后期，與對(duì)照組相比，60和120 μg/L染毒組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)發(fā)黃暗淡，缺少光澤，自主活動(dòng)度下降。各染毒組小鼠總體體質(zhì)量變化趨勢(shì)相近，無(wú)明顯異常情況（圖1）。

圖1 MC-LR染毒12個(gè)月期間的小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)Fig.1 Weight changes of the mice exposed to MC-LR for 12 months.

2.2 小鼠染毒后腎臟重量及腎臟指數(shù)

實(shí)驗(yàn)小鼠的腎臟系數(shù)計(jì)算公式為：腎臟指數(shù)（%）=（雙腎質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%MC-LR染毒12個(gè)月后，與對(duì)照組相比，不同濃度MC-LR組小鼠腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）

圖2 小鼠雙腎質(zhì)量(A)和小鼠腎臟系數(shù)(B)Fig.2 Bilateral kidney weight(A)and kidney index(B)of the mice in each group.

2.3 MC-LR對(duì)小鼠腎臟組織學(xué)形態(tài)的影響

在腎皮質(zhì)部分，與對(duì)照組相比，1 μg/L染毒組腎小體結(jié)構(gòu)完整，60和120 μg/L染毒組腎小球結(jié)構(gòu)改變，鮑曼空間壓縮，血管球擴(kuò)張（黃色長(zhǎng)框），間質(zhì)可觀察到明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色細(xì)箭頭），120 μg/L染毒組更為明顯（圖3A～D）；在腎髓質(zhì)部分，與對(duì)照組相比，1 μg/L染毒組腎小管結(jié)構(gòu)完整，60和120 μg/L染毒組腎小管擴(kuò)張（藍(lán)色粗箭頭），間質(zhì)可觀察到淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)且隨著染毒劑量升高而逐漸明顯（圖3E～H）；在腎盂部分，隨著染毒濃度的增加，腎盂淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度逐漸增加（紅色細(xì)箭頭）（圖3I～L）。

圖3 MC-LR慢性染毒后小鼠腎臟切片病理學(xué)觀察Fig.3 Pathological observation of the renal tissues of the mice with long-term MC-LR exposure(HE staining,original magnification:×200,scale bar=150 μm).A-D: Renal cortex.E-H: Renal medulla.I-L: Renal pelvis.The yellow boxes highlight baumann space compression,the red arrows indicate lymphocytic infiltration,and the blue arrows indicate dilated tubules.

2.4 MC-LR對(duì)小鼠血清腎功能指標(biāo)的影響

MC-LR染毒12個(gè)月后，與對(duì)照組相比，血清BUN和SCr水平在60和120 μg/L染毒組中升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 MC-LR染毒12個(gè)月對(duì)小鼠血清腎功能指標(biāo)的影響Fig.4 Effects of MC-LR exposure for 12 months on serum renal function indexes of the mice.A:BUN levels.B:SCr level.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control.

2.5 MC-LR對(duì)小鼠腎臟炎癥的影響

與對(duì)照組相比，TNF-α和IL-6在60和120 μg/L染毒組中升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5A、B）。IL-10在所有染毒組中的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5 C）。

圖5 MC-LR對(duì)小鼠腎臟炎癥因子的影響Fig.5 Effects of MC-LR exposure on mRNA expression levels of TNF-α(A),IL-6(B)and IL-10(C)in the mice.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control.

2.6 MC-LR對(duì)小鼠腎臟PI3K/AKT通路的影響

與對(duì)照組相比，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的蛋白相對(duì)表達(dá)量在染毒組中上升，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 MC-LR慢性染毒對(duì)小鼠腎臟相關(guān)蛋白的影響Fig.6 Effects of chronic MC-LR exposure on renal expressions of proteins in the PI3K/AKT pathway.A:Western blots of the proteins in the PI3K/AKT pathway.B,C: Quantitative analysis of the expression levels of P-PI3K/PI3K and PAKT/AKT proteins.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control.,

2.7 PI3K/AKT通路對(duì)MC-LR染毒HEK293細(xì)胞腎損傷指標(biāo)以及炎癥因子的影響

與對(duì)照組相比，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的蛋白相對(duì)表達(dá)量在MC-LR 染毒組呈上升趨勢(shì)。而在與PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合處理后，與MC-LR染毒組相比，以上蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。與對(duì)照組相比，BUN和Cr在MC-LR染毒組中均表達(dá)上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖8）。與MC-LR染毒組相比，在PI3K抑制劑處理后的MCLR染毒組中，BUN和Cr的水平顯著下調(diào)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比，IL-6、TNF-a在MC-LR染毒組中均表達(dá)上調(diào)，IL-10在MC-LR染毒組中均表達(dá)下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖9）。與MC-LR染毒組相比，在PI3K抑制劑處理后的MC-LR染毒組中，IL-6、TNF-α的表達(dá)顯著被抑制，而IL-10的表達(dá)被顯著上調(diào)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 干預(yù)PI3K/AKT信號(hào)通路后MC-LR對(duì)HEK293細(xì)胞蛋白表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of MC-LR on expressions of the related proteins in HEK293 cells after intervention of the PI3K/AKT signaling pathway.A:Western blots of the proteins in the PI3K/AKT pathway.B,C:Quantitative analysis of the expression levels of PPI3K/PI3K and P-AKT/AKT proteins.***P＜0.001 vs control;##P＜0.01,###P＜0.001 vs MC-LR.

圖8 干預(yù)PI3K/AKT信號(hào)通路后MC-LR對(duì)HEK293細(xì)胞腎功能指標(biāo)的影響Fig.8 Effect of MC-LR on BUN and Cr levels in HEK293 cells after intervention of the PI3K/AKT signaling pathway.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs MC-LR.

圖9 干預(yù)PI3K/AKT信號(hào)通路后MC-LR對(duì)HEK293細(xì)胞炎癥因子的影響Fig.9 Effect of MC-LR on mRNA expression levels of TNF-α(A),IL-6(B)and IL-10(C)in HEK293 cells after intervention of PI3K/AKT signaling pathway.**P＜0.01 vs control;#P＜0.05,##P＜0.01 vs MC-LR.

3 討論

慢性腎病被認(rèn)為是多因素疾病，其發(fā)生與遺傳因素、個(gè)人生活飲食行為習(xí)慣、病原體感染以及環(huán)境毒素暴露等因素有關(guān)［16］，但現(xiàn)有對(duì)于MC-LR引起慢性腎損傷的作用及其分子機(jī)制研究有限。本研究旨在探討MC-LR慢性染毒造成的腎臟損傷，以及PI3K/AKT信號(hào)通路在腎臟損傷中的作用。結(jié)果顯示MC-LR可調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響腎臟炎癥反應(yīng)發(fā)生。

在本研究中，為了模擬公眾最常見(jiàn)的MC-LR暴露方式—飲水暴露，我們對(duì)40只清潔級(jí)的雄性C57BL/6小鼠給予含0、1、60和120 μg/L MC-LR的飲用水，慢性染毒12個(gè)月后觀察MC-LR對(duì)腎臟毒作用的效果。Go等［17］通過(guò)檢測(cè)太湖水體和水產(chǎn)品中的微囊藻毒素濃度，評(píng)估在太湖梅梁灣（污染區(qū)）長(zhǎng)期生活的漁民對(duì)微囊藻毒素的環(huán)境吸收程度，估算出在動(dòng)物模型的MC-LR染毒濃度大于100 μg/L。Fawell等［18］根據(jù)MC-LR亞慢性（13周）灌胃染毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MC-LR的未觀察到有害作用水平（NOAEL）是40 μg/（kg·d），相當(dāng)于250 μg/L的MC-LR 飲用水濃度［17］。關(guān)于MC-LR 慢性染毒的NOAEL數(shù)據(jù)亟需探討，故本研究選擇了120 μg/L（1/2的NOAEL）的濃度作為MC-LR的最高染毒劑量，選擇60 μg/L（1/4的NOAEL）作為另一個(gè)染毒劑量。其次，在我國(guó)的《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》及《生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范》中分別規(guī)定了水源水、飲用水中的MC-LR最高濃度限值，即1 μg/L。因此，本研究的最低染毒劑量定為1 μg/L，觀察1 μg/L的MC-LR慢性染毒是否對(duì)腎臟產(chǎn)生明顯的損害作用。

3.1 MC-LR染毒對(duì)小鼠一般情況的影響

在對(duì)小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期體質(zhì)量監(jiān)測(cè)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各染毒組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)的整體趨勢(shì)變化無(wú)明顯差異。與我們前期研究結(jié)果相一致［2］。Zhao等［15］和Li等［19］均開(kāi)展了MC-LR慢性染毒實(shí)驗(yàn)，在小鼠飲用水中加入不同劑量的MC-LR，在連續(xù)染毒12月的過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量明顯改變。此外，本課題組的前期研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，染毒6月后小鼠的腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)改變也無(wú)明顯差異［2］。同時(shí)，Qin等［20］通過(guò)MCLR染毒小鼠21 d發(fā)現(xiàn)腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)也無(wú)明顯改變。然而Lone等［21］發(fā)現(xiàn)染毒14 d后，小鼠的腎臟質(zhì)量顯著增加。這些結(jié)果表明MC-LR長(zhǎng)期暴露可能對(duì)小鼠體質(zhì)量以及腎臟質(zhì)量影響較小，而短期暴露對(duì)小鼠體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量影響較大。

3.2 MC-LR誘導(dǎo)腎臟損傷

MC-LR染毒后，小鼠腎臟HE結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在60和120 μg/L劑量組，腎小球結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，鮑曼間隙壓縮、血管球擴(kuò)張、間質(zhì)可觀察到明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)也可觀察到明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨染毒劑量增加而逐漸明顯；腎盂部分能觀察到明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)不同濃度（1、30、60、90和120 μg/L）MC-LR飲水染毒實(shí)驗(yàn)，腎臟切片結(jié)果與本研究結(jié)果相近［2］。同時(shí)有研究等［22］通過(guò)腹腔注射染毒大鼠8個(gè)月，組織病理學(xué)檢查顯示腎小球塌陷、基底膜增厚、擴(kuò)張的小管內(nèi)充滿嗜酸性管型。由此說(shuō)明MC-LR可以導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)的損傷，但由于個(gè)體差異以及染毒方式的不同，引起的損傷程度也不同。

血清生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎功能指標(biāo)發(fā)生改變，與對(duì)照組相比，60和120 μg/L劑量組中BUN和SCr呈上升趨勢(shì)，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MC-LR染毒組BUN和Cr同樣呈上升水平。Germoush［23］和Lone等［23］開(kāi)展了為期14 d的MC-LR染毒老鼠實(shí)驗(yàn)，前者研究發(fā)現(xiàn)大鼠血清BUN和SCr水平增高，后者也同樣發(fā)現(xiàn)小鼠血清BUN水平升高。然而，在本課題組之前的研究中，小鼠MC-LR慢性染毒達(dá)6個(gè)月，隨著染毒劑量的增加BUN表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而SCr水平?jīng)]有明顯變化［2］。推測(cè)出現(xiàn)這種情況是因?yàn)榧毙员┞队贛C-LR 后小鼠腎臟產(chǎn)生損傷，BUN和SCr水平上升。而慢性染毒時(shí)小鼠有自身保護(hù)機(jī)制，抑制BUN和SCr的上升并使其處于較低水平。但隨著染毒時(shí)間的增加，這種保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用降低，小鼠腎臟BUN和SCr在高M(jìn)C-LR染毒組中顯著升高，腎臟損傷逐漸加重。

3.3 MC-LR誘導(dǎo)腎臟炎癥

本研究在體內(nèi)和體外染毒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，MC-LR 染毒能夠上調(diào)促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平，并抑制抗炎因子IL-10的mRNA表達(dá)水平。TNF-α是一種多功能細(xì)胞因子，廣泛參與體內(nèi)的病理生理過(guò)程，如：增殖、分化、凋亡、自噬等［24］。Guo等［25］研究表明小鼠發(fā)生急性腎臟損傷時(shí)，會(huì)上調(diào)腎臟TNF-α mRNA的表達(dá)。Al-Badrani和Arman等［26,27］研究也發(fā)現(xiàn)暴露MC-LR 后會(huì)引起TNF-α的上調(diào)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)后，吞噬細(xì)胞會(huì)作用于凋亡和壞死細(xì)胞，其后分泌抗炎因子IL-10，抑制細(xì)胞因子和趨化因子。Arman等［27］也觀察到暴露于MC-LR后會(huì)導(dǎo)致小鼠腎臟IL-10的表達(dá)水平的下調(diào)。Magno等［28］提到IL-6家族成員在糖尿病腎病、腎小球腎炎和梗阻性腎病等腎臟疾病患者的腎組織中上升。綜上，MC-LR可以引起小鼠腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，促炎因子和抗炎因子的失衡是腎臟炎癥的重要因素。

3.4 MC-LR激活腎臟PI3K/AKT信號(hào)通路

目前沒(méi)有對(duì)于MC-LR慢性染毒引起小鼠腎臟損傷的PI3K/AKT信號(hào)通路改變的研究。我們首次在體內(nèi)MC-LR慢性染毒動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，WB結(jié)果表明與對(duì)照組相比p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的蛋白相對(duì)表達(dá)量在MC-LR染毒組中上升。在體外MC-LR染毒模型中以上蛋白表達(dá)量均升高，并激活了PI3K/AKT通路，而在PI3K抑制劑處理后，PI3K/AKT通路被明顯抑制，同時(shí)也抑制了炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果表明MC-LR的暴露激活了PI3K/AKT通路，與其他研究相一致。Miao等［29］提出，MC-LR激活PI3K/AKT誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞和HT-29細(xì)胞遷移和侵襲。Chen等［30］指出MC-LR介導(dǎo)的PI3K/AKT通路激活會(huì)導(dǎo)致男性生殖功能障礙。Wen等［31］的KEGG 通路分析結(jié)果提示MC-LR 激活PI3K/AKT造成肝臟損傷。Zhou等［32］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PI3K/AKT信號(hào)通路的激活在MC-LR誘導(dǎo)的慢性睪丸毒性中起著重要的作用。有研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了MCLR暴露激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［33］。同時(shí)也有一些研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可以導(dǎo)致腎損傷［34-40］。Pan等［34］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了氯化釓可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)HEK293人胚胎腎細(xì)胞增殖。Wang等［35］進(jìn)行了為期14 d的靜脈注射牛血清白蛋白大鼠實(shí)驗(yàn)，其研究顯示激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以引起膜性腎炎，導(dǎo)致膜性腎病腎損傷。Bao等［36］探討了增齡性腎血管硬化的影響因素，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示激活PI3K/AKT信號(hào)通路引起腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老和凋亡。Si等［37］開(kāi)展了為期14 d的草酸鈣結(jié)晶小鼠模型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗纖維化作用，減輕草酸所致大鼠腎臟損傷。Zhang等［38］在熊果苷對(duì)內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷作用的探討中，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以抑制細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)，從而減輕急性腎損傷。Hu等［39］建立了糖尿病大鼠模型，其結(jié)果顯示下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及激活自噬，從而發(fā)揮改善糖尿病腎病的作用。Zhu［40］和Wang等［41］在體外實(shí)驗(yàn)中證明了PI3K/AKT信號(hào)通路的下調(diào)可以抑制人腎癌細(xì)胞的增殖和凋亡，發(fā)揮抗癌作用。因此，本文結(jié)果表明PI3K/AKT信號(hào)通路的激活與長(zhǎng)期低劑量MC-LR暴露引起的腎臟損傷作用密切相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MC-LR可通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路，激活腎臟炎癥反應(yīng)。MC-LR進(jìn)入腎細(xì)胞后，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，引起炎癥因子改變，誘導(dǎo)腎細(xì)胞炎癥損傷，最終導(dǎo)致腎臟損傷。我們的研究為預(yù)防及治療MC-LR引起的腎損傷提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。