李永盛 祝麗欣 張樂軍 梅紫薇 俞忠明#

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

3 麗水市中心醫(yī)院 浙江 麗水 323000

槐耳為多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子實(shí)體。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明[1]，槐耳可以通過對固有免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)，發(fā)揮間接抗腫瘤作用，能抑制腫瘤的增殖及遷移作用，誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，對正常細(xì)胞毒性小，故在肝癌、乳腺癌、胃腸癌和胰腺癌等多種腫瘤中廣泛使用[2]，并取得了較好的臨床療效[1]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，將槐耳有效部位制備成凍干粉，通過細(xì)胞體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察其對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的體外增殖抑制作用及對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器：ZD-A30J冷凍干燥機(jī)（南京載智自動化設(shè)備有限公司）；JA203H型電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（Thermo）。

1.2 試劑與藥材：槐耳飲片（浙江佐力百草）；槐耳顆粒（啟動蓋天力藥業(yè)）；五氟尿嘧啶（5-Fu，K0084）；泊洛沙姆（20160820，永華化學(xué)），甘露醇（20140823，強(qiáng)順化學(xué)）；MTT（150208），0.25%胰蛋白酶（21467 E16），DMEM（8114096），均購于Gibco公司；優(yōu)級胎牛血清（FBS）（1616966），磷酸鹽緩沖鹽（PBS）（D221FA0007），購于BBI公司；二甲基亞砜（DMSO）（WXBB8079V，Sigma公司）；輔料均為藥用，實(shí)驗(yàn)用水為生理鹽水。

2 方法與結(jié)果

2.1 槐耳有效部位凍干粉的制備[3,4]：稱取槐耳有效部位提取物浸膏粉10g，加入甘露醇25g、泊洛沙姆2.5g、生理鹽水250mL，50℃加熱，超聲助溶，搖勻。將溶液轉(zhuǎn)至西林瓶，每瓶25mL（液面高約13mm），-56℃慢凍法預(yù)凍3h，-15～-10℃升華干燥12h，45～50℃解析干燥9h，得槐耳有效部位凍干粉制劑。

2.2 凍干粉體外細(xì)胞藥效研究：具體如下。

2.2.1 試藥的配置：稱取槐耳顆粒1000mg、自制凍干粉200mg、5-Fu 40mg，并將其分別用10mL不含血清培養(yǎng)基溶解，各自配置成適宜濃度的母液，備用，給藥時再依次梯度稀釋至所需濃度。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：A組（單用槐耳顆粒）、B組（單用自制凍干粉）、C組（單用5-Fu）、D組（自制凍干粉+5-Fu聯(lián)合）、E組（槐耳有效部位浸膏+5-Fu聯(lián)合），F(xiàn)組（陰性凍干粉組），并設(shè)立陰性對照組。

2.2.3 體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)[5,6]：采用MTT法測定不同濃度藥物對腫瘤細(xì)胞的影響，給藥平行設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置不添加細(xì)胞懸液為空白對照組，平行實(shí)驗(yàn)3次。給藥后細(xì)胞在同樣條件的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h或48h后采用MTT法測細(xì)胞活性，于多功能酶標(biāo)儀上490nm處測定各孔的光密度（OD）值，以正常對照組（未給藥組）測得的OD值為對照，按照抑制率公式計(jì)算槐耳各提取物組對于腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果，根據(jù)各浸出部位浸膏得率轉(zhuǎn)化成相應(yīng)浸膏用量，計(jì)算出IC50值。抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組MTT檢測OD值-空白組OD）/（正常對照組MTT檢測OD值-空白組OD）]×100%。

2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果與分析：結(jié)果見表1。由表1可知，各組均顯示48h藥效較24h藥效好，說明對細(xì)胞的體外增殖抑制作用均顯示具有時間依賴性；A與B比較結(jié)果顯示，自制凍干粉制劑的體外細(xì)胞藥效較市售槐耳顆粒佳，其原因可能與凍干粉能增加槐耳有效部位的溶解有關(guān)；C、D、E結(jié)果對比顯示，聯(lián)合用藥組較單用5-Fu組藥效更佳，其中凍干粉與5-Fu聯(lián)合用藥組最佳，其次浸膏與5-Fu聯(lián)合用藥組，凍干粉與5-Fu聯(lián)合用藥可以明顯降低5-Fu的用量（P＜0.01），說明凍干粉與5-Fu可能產(chǎn)生了協(xié)同作用，具體作用機(jī)理需要進(jìn)一步的研究。

表1 槐耳有效部位凍干粉對體外藥效試驗(yàn)

2.3 細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：具體如下。

2.3.1 藥物的配置：稱取自制凍干粉、槐耳顆粒及5-Fu適量，并將其分別溶于不含血清培養(yǎng)基中，配置成適宜濃度的母液，給藥時再依次梯度稀釋至所需濃度。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)分組：A組（空白對照）、B組（單用槐耳顆粒劑，濃度為8000μg/mL）、C組（單用自制凍干粉，濃度為500μg/mL）、D組（單用5-Fu，濃度為10μg/mL）、E組（自制凍干粉500μg/mL+5-Fu 10μg/mL）。

2.3.3 制備單層細(xì)胞：用記號筆在6孔板背面劃出均勻的橫線，每隔0.5～1cm一道，橫穿過孔。將濃度5～10×105個/mL的HCT-116腫瘤細(xì)胞接種到6孔板上，每孔加入2mL，加入含10%FBS的培養(yǎng)液，放入5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，使形成單層細(xì)胞。

2.3.4 劃痕：待細(xì)胞達(dá)約90%匯合時，用5μL移液槍槍頭在細(xì)胞上垂直劃呈“一”字劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，然后加入不同濃度的藥液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔為平行樣本，且重復(fù)3次。

2.3.5 觀察并拍照：吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，按劃痕后0h、24h取樣，在倒置顯微鏡下觀察、拍照。用Im‐age J 7.0圖像處理軟件計(jì)算劃痕愈合率。

2.3.6 試驗(yàn)結(jié)果與分析：劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)芊从嘲┘?xì)胞的遷移能力，由表2可知，與空白對照組相比，單獨(dú)應(yīng)用凍干粉組能明顯降低結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的劃痕愈合率（P＜0.01），凍干粉和5-Fu聯(lián)合應(yīng)用與單獨(dú)應(yīng)用凍干粉相比，效果更明顯（P＜0.01），說明凍干粉能降低結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞遷移能力，且與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

表2 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 體外細(xì)胞藥效實(shí)驗(yàn)：5-Fu為臨床治療消化道惡性腫瘤的最常用藥物之一，但該藥容易產(chǎn)生耐藥性，而且作為細(xì)胞毒性藥物，其毒副作用也較明顯。這些臨床中存在的實(shí)際問題促使我們思考是否可以通過聯(lián)合中藥，在不降低療效的情況下減少5-Fu的用量，降低化療藥耐藥性，并在此基礎(chǔ)上研究試驗(yàn)新型安全、高效、低毒性的藥物。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是考察自制凍干粉能否降低化療藥物5-Fu的用藥量。實(shí)驗(yàn)對陰性空白凍干粉的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其于2000μg/mL濃度下對結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞無細(xì)胞毒性。

3.2 細(xì)胞遷移、侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：結(jié)果出現(xiàn)遷移率太小以及存在遷移率為負(fù)值的情況，原因可能是給藥劑量太大所致，所以劃痕實(shí)驗(yàn)的給藥劑量最好控制在IC50值以下為宜。