結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌患者腸道菌群紊亂及腸道黏膜損傷情況分析

康發(fā)財(cái)，趙書紅，陳思楨，孫必達(dá)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院舟山分院 消化內(nèi)科，浙江 舟山 316000)

結(jié)腸炎是由于腸道黏膜發(fā)生病變引起的消化道疾病，按照發(fā)病原因可分為感染性結(jié)腸炎、缺鐵性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎等，其中潰瘍性結(jié)腸炎患者居多，發(fā)病年齡以20～40歲為主。我國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎確診10年后腸癌發(fā)病率為1.15%，20年后升至3.56%，30年后高達(dá)14.36%。結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌是由結(jié)腸炎通過(guò)炎癥-異型增生-癌變途徑形成，病變累及直腸、結(jié)腸部位，其受累范圍隨病變程度加深而增加。腸道菌群對(duì)機(jī)體免疫、新陳代謝等多種生理過(guò)程具有促進(jìn)作用，其結(jié)構(gòu)改變可引起腸道微生態(tài)失調(diào)，免疫功能減弱，進(jìn)而引發(fā)腸道炎癥。有研究認(rèn)為，腸道菌群紊亂所產(chǎn)生的炎癥可破壞腸道免疫系統(tǒng)，降低腸道黏膜細(xì)胞自我修復(fù)功能，進(jìn)而促進(jìn)腸癌的發(fā)展。本研究探討潰瘍性結(jié)腸炎及其相關(guān)腸癌患者的腸道菌群特點(diǎn)及腸道黏膜損傷情況，以期為臨床疾病診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院舟山分院2018年9月—2022年7月收治的215例潰瘍性結(jié)腸炎及其相關(guān)性腸癌患者的臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合我國(guó)《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見 2018》中結(jié)腸炎及結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②入組前2月內(nèi)未采取任何治療措施；③進(jìn)行腸鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并胃潰瘍、直腸癌等其他胃腸道疾病或腸癌患者；②嚴(yán)重機(jī)體免疫功能障礙者；③無(wú)法配合取樣檢測(cè)者。215例患者中，男114例，女101例，年齡20～47歲，平均(33.41±6.52)歲；疾病分類：初發(fā)型49例，慢性復(fù)發(fā)型68例，慢性持續(xù)型62例，急性爆發(fā)型36例；疾病嚴(yán)重程度：輕度71例，中度79例，重度65例；黏膜組織學(xué)分期：潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)期83例，緩解期69例，結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌63例。另選同期70例健康體檢者資料，均接受腸道菌群檢測(cè)、腸鏡檢查，并取結(jié)腸黏膜組織樣本進(jìn)行病理檢查；其中男38例，女32例，年齡22～46歲，平均(33.87±5.83)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。

1.2 腸道菌群失調(diào)程度分析及判定標(biāo)準(zhǔn)取患者新鮮糞便，采用無(wú)菌牙簽蘸去糞便直接涂抹于潔凈的載玻片上，厚度與血膜推片相近，待自然干燥后使用酒精火焰固定3次，然后用Gram染色液染色，先于100倍顯微鏡下觀察圖片的厚度及染色情況，再用1 000倍油鏡觀察并進(jìn)菌群失調(diào)度判定。基本正常：細(xì)菌總數(shù)大體正常，革蘭氏陽(yáng)性桿菌數(shù)多于革蘭氏陰性桿菌數(shù)，并有少量革蘭氏陰性球菌及陽(yáng)性球菌，無(wú)明顯酵母樣菌。Ⅰ度腸道菌群失調(diào)：細(xì)菌總數(shù)大體正常，革蘭氏陽(yáng)性桿菌數(shù)略少，陰性桿菌數(shù)略有增加。Ⅱ度腸道菌群失調(diào)：細(xì)菌總數(shù)明顯減少，革蘭氏陽(yáng)性桿菌數(shù)明顯減少，陰性桿菌數(shù)明顯增多，革蘭氏陽(yáng)性球菌明顯增加，球桿比例增加，伴有少量酵母樣菌。Ⅲ度腸道菌群失調(diào)：總細(xì)菌數(shù)極少，革蘭氏陽(yáng)性、陰性桿菌均大幅度降低，類酵母樣菌或葡萄球菌占絕大多數(shù)。

1.3 菌群菌落分析 稱取受試者新鮮糞便標(biāo)本0.5 g，加入4.5 mL標(biāo)本稀釋液充分稀釋混勻，并采用梯度稀釋法依次稀釋10～10，選取腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌、消化球菌、小梭菌7種菌種，根據(jù)菌落濃度參考值將每個(gè)稀釋度菌液分別滴于培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后采用顯微鏡觀察菌落生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法：=[(菌落數(shù)×50)/3]×稀釋倍數(shù)，再取對(duì)數(shù)，以lg10表示。

1.4 潰瘍性結(jié)腸炎臨床分級(jí)

1.4.1 內(nèi)鏡分級(jí)于Baron內(nèi)鏡下觀察患者腸道，根據(jù)內(nèi)鏡下UC活動(dòng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)：黏膜正常，腸壁光滑平整；Ⅰ級(jí)：血管模糊，黏膜充血；Ⅱ級(jí)：黏膜接觸性充血；Ⅲ級(jí)：黏膜自發(fā)性充血；Ⅳ級(jí)：腸鏡下黏膜呈現(xiàn)大小不等的潰瘍創(chuàng)面。

1.4.2 黏膜組織學(xué)分期活動(dòng)期：①固有膜內(nèi)彌漫性、慢性炎性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；②隱窩急性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，發(fā)展成隱窩炎隱窩膿腫，有膿腫潰入網(wǎng)有膜；③隱窩上皮增生，杯狀細(xì)胞減少；④可見黏膜表層糜爛、潰瘍形成，肉芽組織增生。緩解期：①中性粒細(xì)胞消失，慢性炎細(xì)胞減少；②隱窩大小形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂；③腺上皮與黏膜肌層間隙增大；④潘氏細(xì)胞化生。

1.4.3 臨床嚴(yán)重程度分級(jí)根據(jù)美國(guó)胃腸病協(xié)會(huì)結(jié)腸炎診療指南進(jìn)行分級(jí)，輕度(S1)：大便<4次/d，血沉正常，可伴有或不伴有血便，全身無(wú)中毒表現(xiàn)；中度(S2)：血便較輕度次數(shù)增加，伴有輕微發(fā)熱、貧血、心率增加等癥狀，血沉偏高；重度(S3)：血便>6次/d，伴有明顯發(fā)熱、貧血、心動(dòng)過(guò)速等中毒癥狀，血沉升高。

1.5 病理檢查 于患者結(jié)腸段內(nèi)每隔10 cm腸段取2～4塊黏膜進(jìn)行病理組織染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織浸潤(rùn)程度。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群失調(diào)狀況 隨著腸道病變程度增加，腸道菌群失調(diào)程度逐漸增加，且各組之間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見表1。

表1 不同病變程度的患者腸道菌群失調(diào)狀況比較[n(%)]

2.2 腸道菌落分布及水平 顯微鏡下觀察菌落生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示：腸桿菌、腸球菌、消化球菌、小梭菌密度隨病變程度的增加而升高，雙歧桿菌、乳桿菌密度隨病變程度的升高而降低，各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，各組擬桿菌密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。見表2。

表2 不同病變程度的患者腸道菌落分布及水平

2.3 不同病變程度患者病理特征 正常人腸鏡下可見腸道黏膜光滑、平整，無(wú)充血、水腫，組織染色為單層柱狀上皮；緩解期結(jié)腸炎患者腸鏡下可見輕度黏膜水腫，組織染色可見固有層有少量中性粒細(xì)胞，累及少量隱窩；活動(dòng)期結(jié)腸炎患者腸鏡下可見黏膜水腫、潰瘍性病變，黏膜腺體萎縮變形，組織染色可見大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥病變；結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌患者腸道重度水腫、潰爛，組織染色可見黏膜腺體扭曲變形、萎縮，大部分區(qū)域可見淋巴濾泡增生及隱窩膿腫，炎癥因子浸潤(rùn)呈彌漫連續(xù)分布。見封三圖2。

2.4 不同病變程度的患者內(nèi)鏡分級(jí)比較 隨著腸道病變程度增加，腸道內(nèi)鏡分級(jí)逐漸增加，且各組之間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)，見表3。

表3 不同病變程度的患者內(nèi)鏡分級(jí)比較[n(%)]

3 討論

結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌是由慢性腸道炎癥持續(xù)病變形成，也是結(jié)腸炎患者主要死亡原因，其主要發(fā)生途徑有：腺瘤腺癌途徑、Denovo途徑、炎癥癌變途徑。腸道癌變可引起腸道組織黏膜損傷并發(fā)生異型增生，根據(jù)病情進(jìn)展可發(fā)生不同程度的近處或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其病變微轉(zhuǎn)移主要浸潤(rùn)直腸黏膜及黏膜下層，累及直腸及遠(yuǎn)端結(jié)腸，嚴(yán)重者可累及全結(jié)腸，治愈難度相當(dāng)大。因而，了解結(jié)腸炎病變進(jìn)程中腸道環(huán)境及組織病變對(duì)早期介入治療及改善預(yù)后具有重要意義。

腸道菌群被稱為“人類的第八大器官”，在腸炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，據(jù)報(bào)道，人體約90%的細(xì)菌存在于腸道中，腸道共生菌對(duì)促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育及新陳代謝起著重要作用，對(duì)于慢性炎癥病變及癌變患者而言，腸道菌群是重要的感染源及致癌因子。研究表明，腸道菌群失調(diào)可引起腸內(nèi)有效屏障減弱，促進(jìn)腸道菌群移位，進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎癥發(fā)生，炎癥產(chǎn)生的趨化因子或細(xì)胞因子等可激活相關(guān)炎癥信號(hào)通路，促使機(jī)體穩(wěn)態(tài)及自我修復(fù)功能失衡，進(jìn)而引起組織病變。菌群的變化可通過(guò)糞便檢查測(cè)定，一般而言，腸道菌群失調(diào)主要表現(xiàn)為厭氧菌與需氧菌比值下降，而通過(guò)提高益生菌及益元菌比例可改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道代謝。腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群以專性厭氧菌為主，如擬桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌屬等，是腸道代謝所必需的菌群。研究報(bào)道，擬桿菌在腸道內(nèi)增加有致癌作用，而雙歧桿菌在腸道炎癥患者及腸癌患者中的數(shù)目明顯低于正常人群。此外，條件致病菌與腸道炎癥及菌群定植密切相關(guān)，腸道菌群失調(diào)時(shí)條件致病菌增加，常見的條件致病菌有腸球菌、腸桿菌、小梭菌等。有研究表明，大腸桿菌數(shù)量增加與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生相關(guān)，而活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量明顯降低，小梭菌、腸球菌等條件致病菌數(shù)量顯著升高。本研究通過(guò)糞便檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，結(jié)腸炎及腸癌患者菌群呈失調(diào)狀態(tài)，且其失調(diào)程度與腸道病變程度呈正相關(guān)，提示腸道病變與腸道菌群生態(tài)環(huán)境息息相關(guān)。對(duì)納入的7種常見的腸道菌群進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，腸道病變患者腸桿菌、腸球菌、消化球菌、小梭菌密度均顯著增加，雙歧桿菌、乳桿菌密度均顯著降低，這說(shuō)明病變組織中腸道益生菌水平降低，而條件致病菌水平增加，與上述報(bào)道相一致。而擬桿菌密度有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析與患者病變類型及檢測(cè)差異相關(guān)。

結(jié)腸炎病理特征為淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性炎癥，其病變部位主要為黏膜及黏膜下層組織，病灶浸潤(rùn)程度的評(píng)估對(duì)手術(shù)治療及預(yù)后具有重要參考價(jià)值。目前最為可靠的方法為腸鏡檢查及組織活檢，據(jù)報(bào)道，腸鏡檢查初次診斷準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上，借助腸鏡可觀察病變部位、浸潤(rùn)范圍、有無(wú)癌變及分期等，不同病變期的患者腸道組織內(nèi)鏡表現(xiàn)也不相同。本研究分別對(duì)比正常組、緩解期結(jié)腸炎、活動(dòng)期結(jié)腸炎及腸癌患者的內(nèi)鏡組織狀態(tài)及病理活檢結(jié)果，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎病變程度與結(jié)腸受累范圍相關(guān)，且隨著病變程度加深其內(nèi)鏡分級(jí)逐漸增加。正?；颊吣c道組織表面平整光滑，組織活檢細(xì)胞輪廓清晰，無(wú)炎癥細(xì)胞；而緩解期患者腸鏡下可見潰瘍性病變，組織活檢可見明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；活動(dòng)期患者則有明顯的黏膜性水腫、充血，部分組織出現(xiàn)潰爛，組織染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞腺體形態(tài)扭曲，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)加深；腸癌患者則病變部位重度水腫、潰爛，炎癥因子浸潤(rùn)呈彌漫連續(xù)分布，大部分區(qū)域可見淋巴濾泡增生及隱窩膿腫。這充分說(shuō)明炎癥反應(yīng)參與腸道病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。結(jié)合上述研究，我們得知炎癥的發(fā)生與腸道菌群變化密切相關(guān)，故而本研究認(rèn)為腸道疾病的發(fā)生發(fā)展與腸道菌落失調(diào)及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，臨床治療及預(yù)防中應(yīng)充分改善腸道炎癥，促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡，以加強(qiáng)腸道黏膜自我修復(fù)能力，提高整體免疫功能。

綜上所述，腸道菌群紊亂及內(nèi)鏡不規(guī)則性潰瘍和狹窄可能提示結(jié)腸發(fā)生炎性病變，臨床可根據(jù)內(nèi)鏡及活檢組織學(xué)觀察判斷結(jié)腸炎病變范圍及程度，合理制定治療方案。