GM-CSF 對(duì)豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因表達(dá)的影響

黃國(guó)梁，王倩玉，買雨晨，咸承俊，張濤杰

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124）

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）是一種分子量為18～22 kDa 的糖蛋白，通過與其受體GM-CSFR 相結(jié)合發(fā)揮功能。GM-CSF是主要的造血生長(zhǎng)因子之一，在造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。GM-CSF 通過調(diào)控粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及激活樹突狀細(xì)胞，在外周組織中發(fā)揮功能[1]，也能夠刺激骨髓細(xì)胞生成粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的增殖[2]。1994 年，Brannstrom等[3]發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢能分泌具有生物活性的GM-CSF，分泌水平在排卵時(shí)達(dá)到峰值。1996年，Jasper等[4]發(fā)現(xiàn)，人類卵泡液中的GM-CSF隨著生殖周期的變化而改變，體外培養(yǎng)的顆粒性黃體細(xì)胞和卵泡膜性黃體細(xì)胞均分泌GM-CSF，表達(dá)為其受體GM-CSFRα 和β。在GM-CSF 敲除小鼠的卵巢功能研究中發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，雙敲（GM-/-）妊娠小鼠卵巢中細(xì)胞數(shù)明顯減少，孕酮表達(dá)水平降低，表示GM-CSF 影響早期妊娠雙敲小鼠（GM-/-）黃體的分泌功能，但不影響卵巢正常功能的發(fā)揮[5]。

有研究表明，子宮上皮細(xì)胞能夠分泌GM-CSF，原位雜交結(jié)果證明了子宮內(nèi)膜上皮和腺上皮是GM-CSF 表達(dá)的主要部位。卵巢分泌的生殖激素對(duì)GM-CSF 有調(diào)節(jié)作用，這種雌激素誘導(dǎo)的分泌增加可以通過聯(lián)合使用孕酮來抑制[6]。在牛的整個(gè)發(fā)情周期中，輸卵管和子宮內(nèi)膜都可見GM-CSF的表達(dá)?？梢?，GM-CSF是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的一個(gè)重要細(xì)胞因子[7]。與正常體型牛相比，GM-CSF 在肥胖牛的輸卵管壺腹部的表達(dá)較低，可能與其生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量較少有關(guān)[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情周期和妊娠早期的小鼠子宮內(nèi)膜上皮分泌的GM-CSF，是類固醇激素調(diào)節(jié)子宮內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的激活和募集的重要調(diào)控因子[9]。GM-CSF 能夠促進(jìn)小鼠附植前胚胎的發(fā)育和存活，可能與其對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和凋亡通路的抑制作用有關(guān)[10]。豬胚胎發(fā)育過程中，培養(yǎng)基添加2 μg/L 或10 μg/L 的GM-CSF，體外受精與核移植胚胎的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，在囊胚期移植后經(jīng)過GM-CSF處理的胚胎可成功進(jìn)行核移植[11]。GM-CSF受體α和β在牛的卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞上均有表達(dá)，可提高卵丘細(xì)胞擴(kuò)展率[12]。試驗(yàn)旨在研究豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，GM-CSF對(duì)卵母細(xì)胞的極體排出率、卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

重組GM-CSF（北京中科拜克生物技術(shù)有限公司）、M199 培養(yǎng)基（GIBCO）、CCK-8 檢測(cè)試劑盒（日本同仁）、M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Biosharp）。

1.2 藥品配制

撿卵液（M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)液28 mL+200 μL 肝素鈉儲(chǔ)液），洗卵液（M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液2 mL+胎牛血清100 μL，試驗(yàn)前2 h配好放入恒溫箱平衡）

成熟培養(yǎng)液配制：M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)液730 μL+雙抗（100 IU/mL 青霉素+100 μg/mL 硫酸鏈霉素）+10 μL 葡萄糖儲(chǔ)液(0.55 g/mL)+10 μL NaHCO3儲(chǔ)液（0.03 g/mL）（SIGMA V900182）+10 μL 丙酮酸鈉儲(chǔ)液（0.03 g/mL）(EKEAR SO131）+10 μL PVA 儲(chǔ)液（0.01 g/mL）（EKEAR P0207）+l-半胱氨酸儲(chǔ)液（0.07 g/mL）（SIGMA c7352-100G）+4%胎牛血清（Biosharp）

試驗(yàn)前2 h 配好放入恒溫箱平衡。試驗(yàn)開始前添加10 IU/mL PMSG（北京索萊寶科技有限公司）+10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素HCG（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)

1.3.1 卵母細(xì)胞的收集

豬卵巢無菌采集于蘭州市榆中縣生豬屠宰場(chǎng)，選擇9 頭6～7 月齡健康長(zhǎng)白豬卵巢，將采集到的卵巢保存于PBS緩沖液中，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。37 ℃恒溫?fù)炻?，選擇胞質(zhì)均勻、顏色較深、顆粒細(xì)胞包裹緊密、達(dá)3 層以上的COC，在洗卵液、成熟液中各沖洗2次備用[13]。

1.3.2 成熟液的分組

將獲取的豬卵泡卵母細(xì)胞置于35 mm胚胎培養(yǎng)皿中，做成3個(gè)200 μL的微滴，隨后覆蓋石蠟油。每個(gè)液滴中放入30～40個(gè)卵母細(xì)胞，每皿1組，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)。試驗(yàn)組1 為成熟培養(yǎng)液；試驗(yàn)組2 為成熟培養(yǎng)液中添加10 μg/L 的GM-CSF；試驗(yàn)組3 為成熟培養(yǎng)液中添加100 μg/L的GM-CSF。

1.3.3 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)

洗滌后的卵母細(xì)胞放入38 ℃、5%CO2飽和溫度條件培養(yǎng)48 h，進(jìn)行機(jī)體排出率和卵丘擴(kuò)展情況的統(tǒng)計(jì)，并收集卵丘細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 試驗(yàn)方法

按照CCK8 檢測(cè)試劑盒說明，將在成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)12、24 及48 h 的COC 上的卵丘細(xì)胞吹下，接種于96 孔板中。每孔加入100 μL 的卵丘細(xì)胞至含4%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后加入10 μL CCK8 檢測(cè)試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h 至培養(yǎng)液顯色為粉紅色，并設(shè)空白對(duì)照組，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)OD 值。OD 值按照試劑盒提供的細(xì)胞活力計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算并統(tǒng)計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Graph Pad Prism 8 軟件進(jìn)行差異顯著性分析和制圖，基因表達(dá)與蛋白表達(dá)的組間差異性分析采用t檢驗(yàn)，各級(jí)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和卵母細(xì)胞極體排出率統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵丘細(xì)胞擴(kuò)展程度分級(jí)及成熟卵母細(xì)胞判定（見圖1）

圖1 卵丘細(xì)胞擴(kuò)展程度分級(jí)及成熟卵母細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Scale of cumulus cell expansion and morphology of mature oocytes

倒置顯微鏡下將卵母細(xì)胞的按卵丘擴(kuò)展程度進(jìn)行分類。由圖1（a）可知，0 級(jí)為卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞脫落退化；由圖1（b）可知，1 級(jí)為卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞只有一層或最外圍擴(kuò)散，卵丘細(xì)胞少且不均勻；由圖1（c）可知，2 級(jí)為卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞的外層出現(xiàn)擴(kuò)散，層數(shù)增多，卵丘細(xì)胞包裹緊密顏色深；由圖1（d）可知，3 級(jí)為卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞除放射冠外開始全部擴(kuò)散，卵丘細(xì)胞顏色較淺，胞質(zhì)均勻；由圖1（e）可知，4 級(jí)為卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞全部擴(kuò)散；由圖1（f）可知，吹打下卵丘細(xì)胞，觀察成熟卵母細(xì)胞，卵黃間隙上出現(xiàn)極體即可判定為成熟。

2.2 GM-CSF 對(duì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和卵母細(xì)胞成熟的影響（見表1）

由表1 可知，卵丘擴(kuò)展程度為3～4 級(jí)的卵丘細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在各組別間差異性顯著（P<0.05）。

表1 卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和卵母細(xì)胞極體排出率Tab.1 Cumulus cell expansion and oocyte polar body excretion rate 單位：%

2.3 GM-CSF對(duì)卵丘細(xì)胞活性的影響（見圖2）

圖2 GM-CSF對(duì)卵丘細(xì)胞活性的影響（n=3）Fig.2 Effect of GM-CSF on cumulus cell activity(n=3)

將含有不同濃度GM-CSF 的COC 培養(yǎng)12、24、48 h后，放入0.2%透明質(zhì)酸的M199 培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱中孵育5 min，使用10 μL 移液槍輕輕吹打COC。將脫落下來的卵丘細(xì)胞1 500 r/min 離心收集，加入4%胎牛血清后均勻注入96孔板中培養(yǎng)24 h，再加入CCK-8進(jìn)行活性檢測(cè)，每組試驗(yàn)均設(shè)3 個(gè)重復(fù)。由圖2 可知，不同培養(yǎng)時(shí)間的GM-CSF 組細(xì)胞活性均高于對(duì)照組，且48 h 時(shí)，10、100 μg/L 的GM-CSF 組細(xì)胞活性極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。

3 討論

通過組織學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，GM-CSF受體在牛卵巢中可與顆粒細(xì)胞孕酮分泌的相關(guān)蛋白3β-HSD 及卵泡刺激素FSHR 在牛卵巢中共表達(dá)，暗示其可能對(duì)顆粒細(xì)胞的激素分泌功能有影響。體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞中，添加GMCSF可以增加顆粒細(xì)胞2-脫氧葡萄糖（DOG）或3-O-甲基葡萄糖（OMG）的吸收，暗示其可調(diào)節(jié)牛卵巢顆粒細(xì)胞糖代謝的活性[11]。在關(guān)于牛卵丘細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞在SOF培養(yǎng)基中添加0、1、10和100 μL的人重組GM-CSF，22 h后分析擴(kuò)展指數(shù)（CEI）和極體排出率，發(fā)現(xiàn)GM-CSF 受體在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中均出現(xiàn)，10 μg/L 和100 μg/L 組擴(kuò)展指數(shù)為0.8 和1.22，高于0.22 的對(duì)照組。但極體排出率沒有明顯差異。100 μg/L 組的卵丘細(xì)胞生存率比對(duì)照組高出20%，且差異極顯著。且10 μg/L 和100 μg/L 增加卵丘細(xì)胞數(shù)量分別為20%和50%。而GM-CSF特異性抑制劑IP3細(xì)胞因子對(duì)以上差異均有抑制作用[13]。GM-CSF 對(duì)體外培養(yǎng)卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞的代謝有顯著影響[14]。

文獻(xiàn)報(bào)道，排卵前卵泡及多囊卵泡綜合征患者卵泡液中均含有GM-CSF[4,15-16]。試驗(yàn)在未添加豬卵泡液（PFF）的情況下，10 μg/L 組與100 μg/L 組的GM-CSF 對(duì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展均具有明顯的促進(jìn)作用，且主要提高擴(kuò)展程度較高的3～4 級(jí)卵丘細(xì)胞，對(duì)擴(kuò)展程度較低的0～2 級(jí)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展無明顯作用，說明GM-CSF 對(duì)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展與COC 的自身狀態(tài)有關(guān)，即GM-CSF 能促進(jìn)質(zhì)量較好的COC 的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，但不能逆轉(zhuǎn)質(zhì)量較差的卵丘擴(kuò)展。GM-CSF 雖然能提高3～4級(jí)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展數(shù)，但對(duì)極體排出及卵母細(xì)胞成熟率無顯著影響。孫興參等[17]研究豬卵丘擴(kuò)展與卵母細(xì)胞核成熟的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展充分與否與卵母細(xì)胞核成熟無顯著相關(guān)，在去除卵母細(xì)胞的COC 中，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展不受卵母細(xì)胞的影響，說明卵丘細(xì)胞擴(kuò)展與否并不對(duì)卵母細(xì)胞成熟起決定作用，GM-CSF對(duì)卵母細(xì)胞成熟沒有顯著促進(jìn)作用，與Oscar 等[12]在牛卵丘細(xì)胞擴(kuò)展中得出的結(jié)論一致。

本試驗(yàn)中，分別對(duì)COC 中GM-CSF 孵育12、24、48 h的卵丘細(xì)胞的細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，3個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞活性在10 μg/L 組與100 μg/L 組均有所提高，作用48 h后的細(xì)胞活性組間差異顯著（P<0.05）。

4 結(jié)論

GM-CSF 能夠顯著提高3～4 級(jí)豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展率及卵丘細(xì)胞的活性。