楊武斌，唐金鳳，米本中

(1重慶市高新區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學(xué)辦公室，重慶 400039；2重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院,國(guó)家衛(wèi)生健康委出生缺陷與生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；*通訊作者,E-mail:919733824@qq.com)

肝纖維化是一種慢性肝損傷疾病，是指在病毒、酒精、藥物等刺激因素下所致的肝細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)過度沉積，是各種慢性肝病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。持續(xù)的慢性肝損傷，會(huì)導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞變得更具增殖性，并轉(zhuǎn)分化為成肌纖維母細(xì)胞。在肝纖維化形成的過程中，肝臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是調(diào)節(jié)ECM生成與沉積最重要的細(xì)胞因子之一，其可促使肝星狀細(xì)胞活化，并能促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ，Col Ⅰ)的表達(dá)，具有明顯的促肝纖維化作用，被認(rèn)為是肝纖維化形成的關(guān)鍵因子[2,3]?；罨母涡菭罴?xì)胞的收縮力增加歸因于細(xì)胞骨架蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，故α-SMA的表達(dá)被用作肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志物[4]。早期肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的病變過程，在適當(dāng)干預(yù)條件下是可以逆轉(zhuǎn)的。目前，如何逆轉(zhuǎn)早期肝纖維化的病理過程已成為臨床工作和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。根據(jù)肝纖維化的臨床癥狀及體征表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“脅痛”“積聚”等范疇。柴胡疏肝散(Chaihu Shugan powder，CSGS)是疏肝理氣法的代表方，具有疏肝理氣之功效，主治肝氣郁滯證[5,6]。本研究模擬肝纖維化的中醫(yī)肝郁血瘀病機(jī)，通過CCl4構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，研究柴胡疏肝散對(duì)大鼠肝纖維化程度和相關(guān)細(xì)胞因子變化的影響，初步探討柴胡疏肝散對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的早期肝纖維化模型大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2017-0003。在重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所常規(guī)條件喂養(yǎng)(12 h光-暗循環(huán)，室溫22 ℃，濕度30%～40%)。

1.2 柴胡疏肝散水煎劑的制備

柴胡疏肝散(CSGS)包含的所有中藥材均購(gòu)自重慶市帛霖藥業(yè)有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院米本中副研究員鑒定符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》質(zhì)量規(guī)定。柴胡10 g，陳皮10 g，白芍6 g，枳殼6 g，川芎10 g，醋香附10 g，炙甘草2 g。稱20倍處方量，將中藥材充分浸泡30 min后，用10倍體積水煎1 h，取上清液，再用10倍體積水煎濃縮至含生藥2 g/ml，約540 ml。

1.3 試劑和儀器

FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)；SYBR Green master mix(美國(guó)KAPA Biosystems)；TRIzol Reagent(美國(guó)Life Technologies公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Vortex混合儀(上海啟前電子科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及造模 將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、秋水仙堿組(陽(yáng)性對(duì)照，0.2 mg/kg)、柴胡疏肝散低劑量組(CSGS-L組，3.5 g/kg)、柴胡疏肝散中劑量組(CSGS-M組，6.3 g/kg)、柴胡疏肝散高劑量組(CSGS-H組，12.6 g/kg)，每組10只。除正常組外，各組大鼠腹腔注射40% CCl4橄欖油溶液(1 ml/kg)，2次/周，共10周，建立肝纖維化模型[7]；正常組以等容量橄欖油腹腔注射代替。CSGS給藥組于造模同時(shí)灌胃給藥，正常組和模型組給予等量蒸餾水，每天1次。肝纖維化模型復(fù)制成功的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：生化指標(biāo)方面表現(xiàn)為血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯升高；肝組織中TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達(dá)顯著升高；病理學(xué)變化表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)大量纖維增生[8,9]。第10周結(jié)束實(shí)驗(yàn)，將全部大鼠禁食不禁水16 h，次日腹主動(dòng)脈采血，取肝組織標(biāo)本。

1.4.2 大鼠一般情況觀察 對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、體質(zhì)量變化進(jìn)行觀察記錄。

1.4.3 大鼠血清AST、ALT、TBIL檢測(cè) 第10周末，使用戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠后，采集腹主動(dòng)脈血液，每只大鼠約4 ml，室溫靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃下保存。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST和TBIL的含量。

1.4.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量測(cè)定 取“1.4.3”項(xiàng)下大鼠保存血清樣品，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量水平。

1.4.5 HE染色法觀察肝組織病理學(xué)改變 大鼠的肝組織置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水。脫水后的肝組織用石蠟包埋機(jī)包埋成肝組織蠟塊。然后將肝組織蠟塊切成4 μm的切片。石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化，蒸餾水洗滌，蘇木素染色16 min，自來水洗去浮色，伊紅室溫染色15 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明30 min。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察顯色結(jié)果并拍照。

1.4.6 qRT-PCR檢測(cè)測(cè)定TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達(dá) 按TRIzol試劑盒說明書提取大鼠肝組織總RNA，測(cè)定RNA的濃度及純度。按照FastKing cDNA試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。qRT-PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

正常組大鼠狀態(tài)良好，活動(dòng)靈敏，皮毛光澤，飲食和排便正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。模型組大鼠精神萎靡，活動(dòng)遲緩，皮毛無光澤，體質(zhì)量較造模前略增加，死亡1只。與模型組比較，柴胡疏肝散各組和秋水仙堿組狀況均有改善。造模第6周開始，模型組大鼠體質(zhì)量較正常組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，柴胡疏肝散低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠較模型組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量比較 (g)

2.2 柴胡疏肝散對(duì)早期肝纖維化大鼠肝功能的影響

模型組大鼠肝細(xì)胞產(chǎn)生大量ALT、AST、TBIL，肝細(xì)胞嚴(yán)重受損，TBIL顯著升高，以上各指標(biāo)與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖1)，說明大鼠肝臟攝取和排泄功能出現(xiàn)障礙，提示造模成功。與模型組相比，柴胡疏肝散低、中、高劑量組血清ALT、AST、TBIL均有不同程度的下降(P<0.05或P<0.01)，其中柴胡疏肝散高劑量組改善程度最明顯。柴胡疏肝散高劑量組與秋水仙堿組血清ALT、AST、TBIL含量相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。

與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 柴胡疏肝散對(duì)早期肝纖維化大鼠血清ALT、AST和TBIL含量的影響Figure 1 Effect of Chaihu Shugan powder on serum ALT, AST and TBIL levels in rats with early liver fibrosis

2.3 柴胡疏肝散對(duì)大鼠血清中早期肝纖維化炎癥因子的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01，見表3)，提示造模成功。與模型組比較，秋水仙堿組和柴胡疏肝散低、中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低(P<0.01)。與柴胡疏肝散低劑量組相比，柴胡疏肝散高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)，柴胡疏肝散中劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。與柴胡疏肝散中劑量組相比，柴胡疏肝散高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。柴胡疏肝散高劑量組與秋水仙堿組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

2.4 柴胡疏肝散對(duì)早期肝纖維化模型大鼠肝組織病理學(xué)的影響

HE染色顯示，正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小均勻，未見變性壞死。模型組肝小葉被破壞，肝細(xì)胞不同程度的水腫、結(jié)構(gòu)紊亂、明顯腫脹變形，有點(diǎn)狀、片狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示造模成功。秋水仙堿組較模型組肝組織結(jié)構(gòu)稍正常，細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。與模型組比較，柴胡疏肝散低、中、高劑量組大鼠肝組織病理?yè)p傷均得到不同程度的改善，肝索排列較整齊，肝小葉基本恢復(fù)正常，炎性因子減少，細(xì)胞壞死減輕，其中以柴胡疏肝散高劑量組的大鼠治療效果最佳。秋水仙堿組與柴胡疏肝散高劑量組相比，肝小葉破壞和炎性因子浸潤(rùn)仍然存在，僅表現(xiàn)為破壞程度和數(shù)量減少，二者程度相當(dāng)(見圖2)。

表3 柴胡疏肝散對(duì)早期肝纖維化大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響

圖2 HE染色觀察各組大鼠肝組織病理改變Figure 2 Pathological changes of liver tissue in each group by HE staining

2.5 柴胡疏肝散對(duì)肝組織TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果分析顯示，與正常組比較，模型組TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖3)，提示造模成功。與模型組比較，秋水仙堿組TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，柴胡疏肝散各劑量組TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中柴胡疏肝散高劑量組降低程度最為明顯。柴胡疏肝散高劑量組與秋水仙堿組肝組織TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達(dá)水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 柴胡疏肝散對(duì)肝組織TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of Chaihu Shugan powder on TGF-β1, Col Ⅰ, α-SMA mRNA expression in liver tissue

3 討論

肝臟是人體解毒器官，有害物質(zhì)沉積于肝臟或免疫反應(yīng)均可造成肝細(xì)胞損傷、肝組織變性，引起肝內(nèi)結(jié)締組織增生等一系列代償反應(yīng)而形成肝纖維化。根據(jù)其病理學(xué)特點(diǎn)，正常的肝細(xì)胞之間有一些纖維組織，纖維組織特別少，如果纖維組織增加，則稱為肝纖維化，即為肝硬化發(fā)生的早期可逆階段。與早期肝硬化相比，晚期肝纖維化中肝組織假小葉及結(jié)節(jié)形成，已發(fā)展成肝硬化，為非可逆階段。因此，有效治療早期肝硬化即肝纖維化是阻止其向肝硬化甚至肝癌發(fā)展的重要手段。

目前化學(xué)合成藥物對(duì)于肝纖維化的治療效果并不理想，反而有引起藥源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。越來越多的學(xué)者開始對(duì)傳統(tǒng)中草藥進(jìn)行研究，以期找到更好的治療肝纖維化藥物。臨床以秋水仙堿治療肝纖維化，但其具有較大的細(xì)胞毒性，常見的不良反應(yīng)包括：消化道反應(yīng)、骨髓毒性反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致骨髓抑制、腎臟衰竭等致命性并發(fā)癥。近年來，中醫(yī)藥治療肝病已成為研究熱點(diǎn)，柴胡疏肝散作為經(jīng)典方劑，以其多靶點(diǎn)、多途徑、整體調(diào)控的作用特點(diǎn)在肝纖維化治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[10]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)柴胡疏肝散在臨床使用中尚未見不良反應(yīng)事件的明確報(bào)道[11,12]，但是因其在臨床廣泛治療眾多疾病，對(duì)于其方證的把握務(wù)需準(zhǔn)確，才能保證其療效和安全性，從而逐步擴(kuò)大本方新的治療領(lǐng)域和范圍[13]。本研究是以秋水仙堿為陽(yáng)性對(duì)照，通過大鼠肝纖維化模型對(duì)柴胡疏肝散改善肝損傷和肝纖維化的作用進(jìn)行了探索。

CCl4是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，在肝臟中可引起毒性三氯甲基(CCL3)自由基，引起炎癥反應(yīng)，能激活肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生ECM，導(dǎo)致肝纖維化[14]。本研究模型組大鼠的肝結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說明大鼠肝纖維化模型建立成功。AST、ALT和TBIL是臨床應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)肝功能的生化指標(biāo)。當(dāng)外部刺激因素導(dǎo)致肝細(xì)胞變性或者壞死時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加甚至破裂，ALT和AST分別從胞漿和線粒體內(nèi)迅速釋放出來，血清中ALT和AST隨之顯著升高。此外，肝細(xì)胞變性或者壞死時(shí)會(huì)導(dǎo)致膽紅素代謝發(fā)生紊亂，血清中TBIL也會(huì)相應(yīng)升高。因此，上述這些指標(biāo)血清水平的高低能直接反應(yīng)肝損傷程度。本研究模型組與正常組相比，大鼠血清中AST、ALT和TBIL水平均顯著升高，表明CCl4誘導(dǎo)的模型大鼠的肝功能明顯受損；而柴胡疏肝散干預(yù)后，大鼠血清中上述肝損傷指標(biāo)水平均顯著降低，說明柴胡疏肝散可明顯改善肝纖維化大鼠肝功能。

炎癥途徑在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6可以直接促進(jìn)HSC的激活，參與和促進(jìn)了肝纖維化的進(jìn)程[15,16]。本研究顯示，與正常組相較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著升高，表明CCl4誘導(dǎo)的模型大鼠出現(xiàn)了明顯的肝纖維化，提示模型建立成功；而給予秋水仙堿和柴胡疏肝散干預(yù)后，可顯著降低大鼠血清中炎癥因子含量，提示柴胡疏肝散可顯著減少大鼠肝臟炎癥浸潤(rùn)，降低肝纖維化程度。

TGF-β1是目前公認(rèn)的最強(qiáng)促纖維化因子之一，也是肝星狀細(xì)胞激活過程的最重要因子，在肝纖維化形成中發(fā)揮重要的作用[2]。在形成肝纖維化的過程中，α-SMA和Col Ⅰ的表達(dá)也逐漸增加。本研究模型組大鼠肝組織中Col Ⅰ、TGF-β1和α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加，肝組織中膠原纖維增生，柴胡疏肝散干預(yù)后，Col Ⅰ、TGF-β1和α-SMA表達(dá)顯著降低，提示柴胡疏肝散可能通過降低TGF-β1和α-SMA的表達(dá)減少肝星狀細(xì)胞的活化，從而減輕肝纖維化。柴胡疏肝散還可能通過減少Col Ⅰ，降低細(xì)胞外基質(zhì)積累，減輕膠原聚集。

綜上所述，本研究表明，柴胡疏肝散具有改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠早期肝纖維化的作用，其機(jī)制可能與抑制Col Ⅰ、TGF-β1和α-SMA的表達(dá)、降低炎癥因子的釋放有關(guān)。肝纖維化疾病的病因復(fù)雜、致病因素多。柴胡疏肝散抗肝纖維化的作用機(jī)制尚不明確，故還需要更深入的研究加以證實(shí)。