胡毅翔,左清平,劉任祝,閆慶梓,邢琪昌,劉 湘*

(1湘潭市中心醫(yī)院臨床藥學(xué)科,湘潭 411000;2長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院藥學(xué)部;*通訊作者,E-mail:hhyxhi@163.com)

炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激是導(dǎo)致大多數(shù)慢性肝臟疾病進(jìn)展的常見原因，其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)的表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致TGF-β1/Smad通路的激活以及HSC活化，是肝纖維化向肝硬化、肝癌轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素[1,2]。NLRP3炎癥小體存在于各種內(nèi)源性免疫細(xì)胞以及非免疫細(xì)胞，NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，同時(shí)加速肝細(xì)胞的炎癥性死亡，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[3]。近年來(lái)研究表明，miRNA類藥物具有靶向性、選擇性、副作用低等特點(diǎn)，以NLRP3及下游信號(hào)通路為靶點(diǎn)的miRNA類藥物可能為肝纖維化的治療提供新的突破口[4]。miR-223-3p是一種重要的miRNAs類調(diào)控分子，其通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)作用在肝臟疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]，但關(guān)于miR-223-3p對(duì)肝星狀細(xì)胞的調(diào)控作用目前仍不清楚。本研究旨在探究miR-223-3p對(duì)人肝星狀細(xì)胞株LX-2增殖及遷移的影響及對(duì)NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，OPTI-MEM、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司，熒光素酶檢測(cè)試劑購(gòu)自Promega北京生物技術(shù)有限公司，miR-223-3p模擬物mimics和陰性對(duì)照mimics購(gòu)自廣州瑞博生物科技有限公司，miR-223-3p模擬物序列為UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA，目標(biāo)基因探針和內(nèi)參基因探針均為5′端采用FAM報(bào)告熒光標(biāo)記，3′端采用TAMRA淬滅熒光標(biāo)記；NLRP3兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

LX-2細(xì)胞用含10%胎牛血清及雙抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用PBS液清洗2次，棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)PBS，滴入0.25%胰蛋白酶(不含乙二胺四乙酸)1 ml，按1 ∶3進(jìn)行分瓶傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 LX-2細(xì)胞誘導(dǎo)增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞LX-2接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，加入10 μg/L的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激誘導(dǎo)24 h，吸出上清液，用含10%胎牛血清及雙抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 miRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miRNA mimics及miRNA inhibitor凍干粉于13 000 r/min瞬時(shí)離心1 min，用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解后稀釋成10 μmol/L母液，于-80 ℃冰箱保存。取TGF-β1誘導(dǎo)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LX-2細(xì)胞，采用胰酶消化1 min，重懸細(xì)胞于12孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞鋪滿瓶底50%左右時(shí)，吸出12孔板中培養(yǎng)基，用PBS洗2次。將綠色熒光染料FAM(6-carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester)標(biāo)記的miR-223-3p mimics、模擬物對(duì)照(NC mimics)分別轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，另設(shè)空白對(duì)照組，加入等體積的轉(zhuǎn)染溶劑。轉(zhuǎn)染步驟如下：取5 ml EP管，分別加入OPTI-MEM 6 μl，加入10 μmol/L的miRNA mimics母液5 μl，輕輕混勻，室溫下孵育5 min，加入Lipofectamine 3000后輕輕混勻，室溫下孵育15 min，最后加入的OPTI-MEM至1 000 μl，將配置好的miRNA mimics轉(zhuǎn)染液加入12孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染8 h，去除轉(zhuǎn)染液，加入1 ml的OPTI-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度及轉(zhuǎn)染效率。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，接種于96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，按上述轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)染，分別為空白對(duì)照組、miR-223-3p mimics組(200 nmol/L)、NC mimics組(200 nmol/L)。次日，待細(xì)胞貼壁后，在樣品中加入DMEM/F12培養(yǎng)基90 μl和CCK-8溶液10 μl，同時(shí)設(shè)置只含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的空白對(duì)照孔，孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A450)。分別于轉(zhuǎn)染后24 h和48 h檢測(cè)96孔板吸光度，以各組細(xì)胞A值減去對(duì)應(yīng)空白組A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組細(xì)胞增殖。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1×106/ml鋪在6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，盡量垂直于細(xì)胞上用無(wú)菌移液槍吸頭(200 μl)劃出一條細(xì)痕，PBS清洗3次，去除漂浮細(xì)胞，再加入含2.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定，顯微鏡下通過(guò)測(cè)量劃痕寬度代表遷移能力。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告

采用預(yù)測(cè)軟件Targetscan(http://www.targetscan.org)和miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)預(yù)測(cè)miR-223-3p的靶基因，構(gòu)建NLRP3野生型(NLRP3-WT-Luc)與突變型(NLRP3-MUT-Luc)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將NLRP3-WT-Luc和NLRP3-MUT-Luc與miR-223-3p mimics和陰性對(duì)照(miRNA mimics隨機(jī)序列)同時(shí)轉(zhuǎn)染到LX-2細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染48 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，獲取細(xì)胞，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。最終以miR-223-3p mimics組與陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度比值作為NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值，最終以二者的比值作為相對(duì)表達(dá)量數(shù)值(Firefly/Renilla)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)水平

取上述給藥處理后的LX-2細(xì)胞，超聲機(jī)粉碎后清洗干凈，加入TRIzol試劑1 ml，吹打數(shù)次，靜置5 min。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)情況，反應(yīng)條件：分別在95 ℃環(huán)境下預(yù)變性10 min，在60 ℃環(huán)境下退火30 s，PCR反應(yīng)共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min，反應(yīng)體系為20 μl，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以U6為內(nèi)參基因，目的基因及內(nèi)參基因的引物序列見表1。NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測(cè)NLRP3蛋白表達(dá)

取上述給藥處理后的LX-2細(xì)胞，用PBS洗2次，加人細(xì)胞裂解液(RIPA)提取細(xì)胞總蛋白，100 ℃變性8 min。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量試，制作10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠，置于電泳槽，每孔加入20 μl的樣品，以110 V恒壓電泳60 min。根據(jù)Marker和分子量將膜上含β-actin，以及對(duì)應(yīng)蛋白分別切下，加入相應(yīng)的NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗(稀釋比例1 ∶200)，冰上孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。內(nèi)參β-actin以1 ∶2 000溶于T-TBS(含3%脫脂奶粉)中；制備約1 ml ECL工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min，除去多余ECL試劑，暗盒中放上X-ray曝光5～10 min后進(jìn)行顯影和定影。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-223-3p對(duì)LX-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

將200 nmol/L綠色熒光染料FAM標(biāo)記的miR-223-3p mimics和未標(biāo)記的miR-223-3p mimics分別轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞24 h，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上(見圖1)，由于mimics用綠色熒光染料FAM標(biāo)記，轉(zhuǎn)染成功后細(xì)胞發(fā)綠色熒光。

2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-223-3p對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的抑制作用

采用CCK-8實(shí)驗(yàn)研究miR-223-3p對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示miR-223-3p mimics組相對(duì)于空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染24 h LX-2細(xì)胞增殖被顯著抑制(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h miR-223-3p mimics對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，miR-223-3p mimics組與NC mimics組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中轉(zhuǎn)染miR-223-3p mimics 48 h抑制率可達(dá)42.21%±6.32%，而轉(zhuǎn)染NC mimics后，對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖活力無(wú)顯著影響(見表2)。以上結(jié)果提示miR-223-3p可以顯著抑制LX-2細(xì)胞的增殖活力。

圖1 miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞的效率 (×400)Figure 1 Transfection efficiency of miR-223-3p mimics in LX-2 cells (×400)

表2 CCK-8檢測(cè)各組LX-2細(xì)胞的增殖能力

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-223-3p對(duì)LX-2細(xì)胞遷移的抑制作用

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-223-3p mimics組轉(zhuǎn)染48 h LX-2細(xì)胞遷移能力被顯著抑制，而轉(zhuǎn)染48 h，NC mimics組LX-2細(xì)胞遷移能力與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(見圖2，表3)，提示miR-223-3p mimics可抑制LX-2細(xì)胞的遷移。

圖2 miR-223-3p mimics抑制LX-2細(xì)胞的遷移Figure 2 miR-223-3p mimics inhibits the migration of LX-2 cells

表3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LX-2細(xì)胞遷移能力

2.4 miR-223-3p靶基因結(jié)合位點(diǎn)分析

采用在線miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan(http://www.targetscan.org)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)對(duì)miR-223-3p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示NLRP3與miR-223-3p堿基序列存在8個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對(duì)(見圖3)，表明NLRP3可能為miR-223-3p的下游靶基因。

圖3 miR-223-3p與靶基因NLRP3結(jié)合位點(diǎn)分析Figure 3 Analysis of binding site of miR-223-3p to target gene NLRP3

2.5 雙熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果

為了驗(yàn)證miR-223-3p能否識(shí)別NLRP3-3′UTR區(qū)域，本實(shí)驗(yàn)將miR-223-3p mimics與包含NLRP3 3′UTR(WT)區(qū)域以及熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入LX-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h，測(cè)定熒光活性。與mimics陰性對(duì)照(NC mimics)組相比，miR-223-3p mimics與pMIR-REPORTER-NLRP3-WT-luc共轉(zhuǎn)染可顯著降低NLRP3的3′UTR區(qū)熒光素酶活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而pMIR-REPORTER-NLRP3-MUT-luc和miR-223-3p mimics及NC mimics組共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶活性均無(wú)顯著影響(見圖4)。

與NC mimics組相比，**P<0.01圖4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-223-3p mimics與NLRP3的靶向結(jié)合作用Figure 4 Verification of targeted binding of miR-223-3p mimics to NLRP3 by dual luciferase assay

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及NC mimics組相比，miR-223-3p mimics組LX-2細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，而NC mimics組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

表4 RT-qPCR法檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.7 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及NCmimics組相比，miR-223-3p mimics組LX-2細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，而NC mimics組NLRP3蛋白表達(dá)與空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖5)，提示miR-223-3p mimics可抑制NLRP3蛋白的表達(dá)水平。

與空白對(duì)照組和NC mimics組比較,*P<0.05圖5 Western blot法檢測(cè)NLRP3蛋白表達(dá)情況Figure 5 Expression of NLRP3 in LX-2 cells by Western blot；

3 討論

肝星狀細(xì)胞在多種肝臟疾病進(jìn)展過(guò)程中均具有重要的調(diào)控作用，肝損傷可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖、活化并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及炎癥細(xì)胞因子[6]。人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞屬于人肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，位于肝竇周圍的Disse間隙內(nèi)，大約占肝細(xì)胞總數(shù)的5%～8%[7,8]。在正常生理情況下，LX-2細(xì)胞表現(xiàn)為靜止表型，在多種促炎癥因子的作用下，LX-2細(xì)胞由靜止表型轉(zhuǎn)化為活化表型，分泌合成大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，同時(shí)活化的LX-2細(xì)胞具有增殖、遷移、分泌炎癥因子等特性，進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞焦亡[9,10]。NLRP3炎癥小體是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵起始位點(diǎn)之一，主要由NOD樣受體NLRP3，銜接分子ASC以及效應(yīng)分子pro-caspase-1組成[11]。在各種炎癥因此刺激下，NLRP3炎癥小體聚集并裂解pro-caspase-1前體形成其活化形式，繼而活化的caspase-1以蛋白水解的方式裂解炎癥介質(zhì)pro-IL-1β和IL-18成其成熟狀態(tài)，并分泌到細(xì)胞外導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生[12]。其中肝星狀細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致炎癥、焦亡通路激活刺激HSC活化，是肝纖維化向肝硬化、肝癌轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素[13]。NLRP3炎癥小體存在于各種內(nèi)源性免疫細(xì)胞以及非免疫細(xì)胞，NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的激活，可導(dǎo)致平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，同時(shí)加速肝細(xì)胞的炎癥性死亡[14]。研究表明，miRNA類藥物具有靶向性、選擇性、副作用低等特點(diǎn)，以NLRP3及下游信號(hào)通路為靶點(diǎn)的miRNA類藥物可能為肝臟疾病的治療提供潛在靶點(diǎn)[15]。

miRNAs是一類特殊的非編碼單鏈小分子RNA，由20～25個(gè)核苷酸組成，生物信息學(xué)家預(yù)測(cè)人體50%～60%的編碼蛋白基因可能受miRNA調(diào)控。大量研究證實(shí)，miRNA可通過(guò)抑制靶mRNA翻譯而降低相應(yīng)蛋白合成，對(duì)基因表達(dá)、蛋白重組、細(xì)胞生長(zhǎng)、機(jī)體應(yīng)激等生理生化活動(dòng)以及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有深遠(yuǎn)和復(fù)雜的效應(yīng)，可作為疾病早期診斷及預(yù)后的新型生物標(biāo)志物，亦可作為藥物干預(yù)的新靶點(diǎn)和新途徑[16]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可通過(guò)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移及活化等過(guò)程，從而調(diào)控肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。例如，據(jù)報(bào)道m(xù)iR-122在肝纖維化患者血清中顯著高表達(dá)，并與患者預(yù)后相關(guān)，提示miR-122可能在藥物誘導(dǎo)的肝損傷中具有作為循環(huán)生物標(biāo)志物的潛力[17]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b通過(guò)靶向作用于Smad3調(diào)控TGF-β1表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞的活化，抑制ECM及炎癥因子的表達(dá)[18]。miR-223-3p屬于miR-223家族一員，在胚胎組織中幾乎不表達(dá)，在成熟組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，miR-223-3p具有多種生物學(xué)功能，是一種作用廣泛的miRNAs分子。研究表明，miR-223-3p可抑制肝細(xì)胞炎癥性損傷，減少肝細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而抑制肝纖維的進(jìn)展[19]。Ji等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，Hsa_circ_0070963可通過(guò)調(diào)控miR-223-3p和LEMD3的表達(dá)抑制HSC的激活，提示Hsa_circ_0070963可能成為肝纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。Calvente等[21]的研究表明，巨噬細(xì)胞能夠調(diào)控miR-223-3p的表達(dá)從而逆肝細(xì)胞炎癥狀態(tài)，通過(guò)給予miR-223-3p模擬物可恢復(fù)小鼠中性粒細(xì)胞水，提示其具有免疫調(diào)控作用。

本研究表明，miR-223-3p可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖，同時(shí)對(duì)LX-2細(xì)胞的遷移具有顯著的阻抑作用，采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan、miRanda對(duì)miR-223-3p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)NLRP3與miR-223-3p堿基序列存在8個(gè)連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對(duì)，提示NLRP3可能為miR-223-3p的下游靶基因，通過(guò)將miR-223-3p mimics與包含NLRP3 3′UTR(WT)區(qū)域以及熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入LX-2細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-223-3p可識(shí)別NLRP3-3′UTR區(qū)域，miR-223-3p可直接靶向NLRP3的3′UTR區(qū)域，抑制NLRP3的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組及NC mimics組相比，miR-223-3p mimics組LX-2細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)量均顯著下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示miR-223-3p mimics可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的激活，阻斷下游細(xì)胞因子表達(dá)。綜上所述，miR-223-3p可靶向作用于NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路從而抑制人肝星狀細(xì)胞株LX-2的增殖及遷移。