馬 欣，鄧可斌，陳 穎，易新林，李 輝，余昪昪，雷西熙

(湖北省中醫(yī)院耳鼻喉科，武漢 430074；*通訊作者,E-mail:qcsdxsd@163.com)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是特異性個(gè)體接觸過敏原后，由免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導(dǎo)的發(fā)生在鼻黏膜的I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，多種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子參與AR的發(fā)病過程，臨床上以鼻塞、鼻癢、噴嚏、流清涕為主要癥狀[1]。AR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生主要與Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞相關(guān)[2]。其中，Th1細(xì)胞參與抗微生物炎癥反應(yīng)，而Th2細(xì)胞參與氣道炎癥形成和發(fā)病，能分泌白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)等細(xì)胞因子[3]。Th1/Th2的失衡會造成AR的發(fā)展，而γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和IL-4作為Th1和Th2細(xì)胞因子代表，它們的相互作用是維持Th1和Th2平衡的關(guān)鍵[4]。除了Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞外，也有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞特異產(chǎn)生的白細(xì)胞介素17(interleukin-17,IL-17)也與氣道炎癥和高反應(yīng)性密切相關(guān)，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在局部的募集和活化，上調(diào)Th2細(xì)胞調(diào)控的嗜酸粒細(xì)胞炎癥[5]。另外，叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box p3,Foxp3)+Treg是目前已知的抑制功能最強(qiáng)、抑制譜最廣泛的一類免疫細(xì)胞，在維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用，AR中的過敏反應(yīng)也有可能與之相關(guān)[2]。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，AR屬于“鼻鼽”范疇，中醫(yī)認(rèn)為，肺、脾、腎三臟虧虛，導(dǎo)致人體正氣不足、腠理疏松、衛(wèi)外不固，風(fēng)寒之邪容易侵襲，使得寒氣郁閉，陽氣不達(dá)，從而導(dǎo)致AR的發(fā)生[6,7]。鼻鼽合劑為治療AR的有效經(jīng)驗(yàn)方劑，在臨床上有很好的療效。研究證實(shí)，鼻鼽合劑具有促進(jìn)Th1/Th2分泌的多種細(xì)胞因子之間的平衡等功能[8,9]，然而，鼻鼽合劑是否對Th17/Treg有影響卻仍沒有充分的研究。而辛芩作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥已被證實(shí)對治療AR有很好的療效[10]，用于與許多藥物聯(lián)合對AR進(jìn)行治療[11-13]，辛芩也可以對Th1/Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生一定的影響[14]。因此，本研究通過構(gòu)建小鼠AR模型，檢測鼻鼽合劑干預(yù)后Th17/Treg在小鼠體內(nèi)的變化，并把辛芩顆粒作為陽性對照組，研究鼻鼽合劑對AR小鼠體內(nèi)Th17/Treg失衡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康狀況良好的6周齡BALB/c雌鼠25只，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0104；于溫度22～26 ℃，相對濕度50%～60%的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，人工光照明暗各12 h。在本次實(shí)驗(yàn)過程中，按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》等相關(guān)文件標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)與處置。

1.1.2 試劑 戊巴比妥鈉(貨號P3761，德國sigma公司)；雞蛋清蛋白(貨號A107821，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氫氧化鋁(貨號239186，德國sigma公司)；辛芩顆粒(貨號190122，四川同人泰藥業(yè)有限公司)；伊紅，中性樹脂，蘇木素(貨號分別為E8090，G8590，G1140，北京索萊寶科技有限公司)；SYBR FAST qPCR Master Mix(貨號KM4101，美國KAPA Biosystems公司)。

1.1.3 儀器 正置顯微鏡，石蠟切片機(jī)(型號分別為DM1000，RM2235，德國徠卡公司)；攤片烤片機(jī)(型號為TKD-TK，湖北康強(qiáng)科技發(fā)展有限公司)；生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)，生物組織包埋機(jī)(型號分別為TB-718L，TB-718D，湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；自動組織脫水機(jī)(型號為TKD-TSF，湖北康強(qiáng)科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠AR模型的構(gòu)建與鑒定 取160 μg卵清蛋白，80 mg氫氧化鋁，分別加入8 000 μl PBS中配制腹腔注射藥物。將小鼠分為空白對照組(5只)和AR模型組(20只)。模型組致敏階段于第1天開始，在第1，3，5，7，9，11，13天向每只小鼠腹腔注射藥物200 μl。模型組激發(fā)階段于第21天開始，用5%卵清蛋白溶液(貨號A107821-5g,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)對小鼠分別進(jìn)行霧化吸入30 min(霧化率約為30 mg/m3)，30 min之后，用配制好的體積分?jǐn)?shù)10%的卵清蛋白溶液滴入小鼠兩側(cè)鼻腔，用1 ml注射器去針頭后每側(cè)鼻腔各滴入10 μl，每天激發(fā)1次，連續(xù)7 d。

依據(jù)癥狀(噴嚏、流涕、鼻癢)評估總分判定AR小鼠造模是否成功。末次霧化、滴鼻激發(fā)后觀察30～60 min，采用疊加量化加分，總分大于5分表示建模成功，小鼠行為學(xué)癥狀分級評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.2 分組干預(yù) 除空白對照組(5只)外，將20只建模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、鼻鼽合劑低劑量組、鼻鼽合劑高劑量組與辛芩組，每組5只?？瞻讓φ战M與模型組每天灌胃生理鹽水一次，連續(xù)2周；鼻鼽合劑低劑量組每天按照10 g/kg劑量灌胃鼻鼽合劑1次，連續(xù)2周；鼻鼽合劑高劑量組每天按照20 g/kg劑量灌胃鼻鼽合劑1次，連續(xù)2周；辛芩組每天按照5 g/kg劑量灌胃辛芩顆粒1次，連續(xù)2周[8]。

表1 小鼠行為學(xué)癥狀分級評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 小鼠一般行為學(xué)觀察 觀察小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的精神狀態(tài)、飲食飲水、活動情況以及毛發(fā)光澤度等情況。

1.2.4 蘇木精—伊紅染色法觀察小鼠鼻中隔黏膜組織變化 將固定好的小鼠鼻中隔黏膜組織切取0.3 cm的厚度，按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋，切片厚度為3 μm，水浴展片，撈片，將切片小心貼附于載玻片上，控片，然后將切片放入展片器展片，貼平粘緊后烤片。根據(jù)蘇木精—伊紅染色法的步驟對組織切片進(jìn)行染色，通過顯微鏡拍照，Leica Application Suite圖像系統(tǒng)采集樣本相關(guān)部位。

1.2.5 qRT-PCR檢測小鼠鼻黏膜組織中IL-4、IL-17、IFN-γ、Foxp3基因mRNA的表達(dá) 取各組小鼠鼻黏膜組織樣本100 mg于含有1 ml Trizol的勻漿管中，于勻漿機(jī)勻漿20 s，立即放于冰上，抽提總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再按照SYBR GREEN PCR Kit說明書進(jìn)行qRT-PCR法檢測小鼠黏膜組織中IL-4、IL-17、IFN-γ、Foxp3的mRNA表達(dá)變化情況。42 ℃運(yùn)行程序60 min后，70 ℃運(yùn)行程序15 min執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)執(zhí)行real-time PCR擴(kuò)增。引物序列見表2。以GAPDH作為內(nèi)參，用GAPDH的Ct歸一目標(biāo)基因的Ct得ΔCt，其次用校準(zhǔn)樣本的Ct值歸一樣品的ΔCt，最后計(jì)算表達(dá)水平比率：2-ΔΔCt=表達(dá)量的比值。

表2 引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般行為學(xué)觀察結(jié)果

造模前各組小鼠精神活躍，正常采食飲水，毛發(fā)順滑有光澤；與空白對照組相比，模型組小鼠精神萎靡，采食與飲水次數(shù)減少，出現(xiàn)豎毛的情況，通過小鼠行為學(xué)癥狀分級評分評價(jià)，分?jǐn)?shù)都高于5分，顯示造模成功；經(jīng)鼻鼽合劑與辛芩顆粒治療后，小鼠精神、飲食及毛發(fā)情況均有所改善。

2.2 小鼠鼻中隔黏膜組織HE染色結(jié)果

各組小鼠鼻中隔黏膜組織HE染色結(jié)果顯示，空白對照組鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列整齊，無明顯增厚及炎性細(xì)胞浸潤；與空白對照組相比，模型組鼻黏膜組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞排列不齊；鼻鼽合劑低劑量組鼻黏膜的炎性細(xì)胞有輕微減少，但不明顯；鼻鼽合劑高劑量組和辛芩組的鼻黏膜炎性細(xì)胞有明顯減少，少量炎性細(xì)胞浸潤，但辛芩組和鼻鼽合劑高劑量組相比，仍然較多的炎性細(xì)胞浸潤(見圖1)。

圖1 小鼠鼻中隔黏膜組織HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining of mouse nasal septum mucosa

2.3 各組小鼠鼻黏膜組織IL-4、IL-17、IFN-γ、Foxp3 mRNA的表達(dá)情況

與對照組相比，模型組鼻黏膜組織中的IL-4、IL-17、IFN-γ與Foxp3的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；經(jīng)鼻鼽合劑與辛芩顆粒治療后，IL-4與IL-17的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但I(xiàn)FN-γ與Foxp3的mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。鼻鼽合劑的低劑量和高劑量組的IL-4和IL-17的mRNA表達(dá)水平都顯著低于辛芩組(P<0.05)，而IFN-γ與Foxp3的mRNA表達(dá)水平都顯著高于辛芩組(P<0.05)。另外，鼻鼽合劑高劑量組的IL-4和IL-17的mRNA表達(dá)量顯著低于低劑量組(P<0.05)，而IFN-γ與Foxp3的mRNA表達(dá)水平都顯著高于低劑量組(P<0.05，見圖2)。

與空白對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與辛芩組比較,cP<0.05;與低劑量組比較,dP<0.05圖2 各組IL-4、IL-17、IFN-γ和Foxp3 mRNA表達(dá)比較Figure 2 Comparison of IL-4, IL-17, IFN-γ and Foxp3 mRNA expression

3 討論

AR作為一種鼻黏膜炎癥性疾病，是全球最常見的鼻部疾病之一，通常會持續(xù)終生。目前，由于環(huán)境等多種原因，AR發(fā)病率逐年升高，病程長、易反復(fù)，嚴(yán)重者甚至引起哮喘、過敏性咽喉炎等，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[15]。AR發(fā)生常常會造成Th1與Th2的免疫失衡，過敏者在接觸外來抗原如花粉刺激物時(shí)，抗原呈遞細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞等會將抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞，促進(jìn)其分化為Th2細(xì)胞，并分泌IL-4。IL-4進(jìn)一步促使B細(xì)胞分化，產(chǎn)生IgE致使過敏介質(zhì)釋放，刺激黏膜組織細(xì)胞造成黏膜水腫[16]。本研究HE染色結(jié)果中就表明鼻黏膜在發(fā)生AR后的炎癥情況，模型組小鼠組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤且上皮細(xì)胞排列不齊。同時(shí)，模型組小鼠黏膜中IL-4的mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。國內(nèi)有團(tuán)隊(duì)[17,18]在研究Let-7e-5p、黃芪甲苷治療AR的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，AR小鼠的鼻黏膜組織中有明顯的炎性細(xì)胞浸潤。而目前，調(diào)節(jié)Th1與Th2的免疫平衡是抑制AR發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[16]。Th1細(xì)胞在白細(xì)胞介素-2(IL-2)作用下分泌IFN-γ，IFN-γ可以抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4和抑制IgE合成，是IgE強(qiáng)抑制因子[19]。鼻鼽合劑在治療AR方面的療效也有許多報(bào)道[20]。它是通過誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞的表達(dá)促使IFN-γ的產(chǎn)生，抑制IL-4的形成，從而減輕嗜酸性粒細(xì)胞的活化和濕潤，減少IgE的合成，從多方面阻止AR的炎癥反應(yīng)[9]。本研究HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)鼻鼽合劑與辛芩顆粒治療后炎癥情況明顯減緩。其中，鼻鼽合劑高劑量組的IFN-γ mRNA表達(dá)量顯著高于其他組，也表明其促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)。

AR發(fā)生過程中還涉及Th17/Treg免疫平衡[21]。CD4+T細(xì)胞可以分化為Th17和Treg細(xì)胞，Th17細(xì)胞主要分泌前炎性因子IL-17[22]，而Treg細(xì)胞的免疫抑制功能則主要由其特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3來調(diào)節(jié)[23]。因此，IL-17和Foxp3的mRNA表達(dá)量也作為這次我們探究鼻鼽合劑發(fā)揮治療效果的指標(biāo)。本研究中的qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，鼻鼽合劑治療能夠顯著降低AR小鼠中IL-7表達(dá)量，高劑量的鼻鼽合劑顯著增加Foxp3的表達(dá)，表明在Th17/Treg免疫平衡中，Treg免疫反應(yīng)在其中發(fā)揮了主要優(yōu)勢。有研究指出，F(xiàn)oxp3+Treg的免疫調(diào)節(jié)功能與其細(xì)胞表面表達(dá)的程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)及CD4+胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子p27kip1有關(guān)[4],這和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。Van等[24]也證實(shí)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡可以使α-硫辛酸成為治療AR的潛在藥物。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對于目前許多疾病都有特別的治療效果[25,26]，而祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)自身也有改進(jìn)和拓展的需求。本研究把辛芩顆粒作為陽性對照組，則發(fā)現(xiàn)其對IL-4和IL-17的mRNA表達(dá)有一定的抑制效果，但較鼻鼽合劑要差；而且辛芩顆粒對IFN-γ和Foxp3的mRNA表達(dá)較鼻鼽合劑沒有顯著的促進(jìn)效果。因此，鼻鼽合劑可能相對于辛芩顆粒有更好的臨床效果，后續(xù)可開展針對AR的臨床治療效果的研究。

綜上所述，鼻鼽合劑對小鼠的AR癥狀具有一定的改善效果，并且能促使Th17/Treg免疫平衡向Treg免疫反應(yīng)占優(yōu)趨勢轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)AR小鼠體內(nèi)Th17/Treg的免疫失衡，達(dá)到緩解AR癥狀的目的。