成年商品豬腸道可培養(yǎng)核心菌群的結(jié)構(gòu)與組成分析

田 野，蔡淳理，楊大容，李 慧，劉寶生,3*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸藥研究所，江西 南昌 330045)

動物腸道作為微生物最密集的棲息地，長期寄居著大約1014的微生物個體[1]。單胃哺乳動物胃腸道微生物主要是由細(xì)菌組成，約占機(jī)體微生物總量的78%[2]。據(jù)統(tǒng)計，腸道菌群中含有500～1 000種細(xì)菌[3]，其中已被記錄的菌門有50多個[4]。腸道菌群結(jié)構(gòu)并非固定，但在哺乳動物腸道中通常是以Bacteroidetes、Firmicutes中的1個或2個門占據(jù)優(yōu)勢[5]。動物腸道菌群與年齡有關(guān)，有研究表明，仔豬腸道菌群隨著發(fā)育過程逐漸轉(zhuǎn)化并趨于穩(wěn)定[6]，而成年豬的腸道菌群大致穩(wěn)定，總體上以Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes為主[7-8]。

近十多年來，因為高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，雖然在豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)、功能，以及腸道菌群與宿主關(guān)系等多方面展開了豐富的研究[9-10]，但迄今為止腸道內(nèi)生菌群的真實情況仍舊不夠明朗。16S rRNA基因全長1 540 bp，包含9個可變區(qū)，是目前細(xì)菌種屬鑒定和分類中應(yīng)用最廣泛的“biomarker”[11-12]。目前的高通量測序技術(shù)受制于本身測序長度的限制，往往只能選擇1～3個可變區(qū)作為靶點[13]。Claesson等[14]通過比較16S rRNA基因的V3+V4和V4+V5兩組高變區(qū)在Roche-454和Illumina 2個主流測序平臺中對細(xì)菌種屬特征分析的偏差，發(fā)現(xiàn)基因序列的覆蓋率越大，準(zhǔn)確性越高。為了避免高通量測序中的有限測序在菌群多樣性評價和估計上的不足，本研究通過基于16S rRNA基因的全序列擴(kuò)增與測序，構(gòu)建成年商品豬腸道普通可培養(yǎng)核心菌群(general culturable core bacteria, GCCB)的16S rRNA基因克隆文庫，利用Mothur、bioEdit、DNAstar等生物學(xué)軟件，對豬腸道內(nèi)源GCCB的多樣性進(jìn)行分析，為更好地闡明豬腸道不同腸段的菌群多樣性及其分布特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 腸道GCCB的分離與篩選

腸道菌群的分離方法同李慧等[15]。簡言之，隨機(jī)選擇3頭成年健康商品豬，分3次分別獨立采樣。按豬腸道的延續(xù)方向，自前向后將十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸依次分成3、5、1、2、3、3個節(jié)段，無菌操作，分別從每一節(jié)段中采集腸道內(nèi)容物，利用PCA(plate count agar)、NA(nutrient agar)、TSA(tryptic soy agar)、LB 營養(yǎng)瓊脂(Luria-Bertani nutrient agar)和標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ號瓊脂(standard I nutrient agar，StdI)5種實驗室常用非選擇性培養(yǎng)基(見表1)分別對每一腸段的腸道菌群進(jìn)行10倍梯度分離培養(yǎng)。根據(jù)不同培養(yǎng)基、不同腸段所分離菌群菌落形態(tài)的不同，選取每一腸段在每種不同培養(yǎng)基中數(shù)量最多、形態(tài)典型的3種不同類型菌落(如果菌落形態(tài)單一，選取的菌落數(shù)可小于3)組成該腸段的GCCB?？紤]到同一腸段中的同種優(yōu)勢菌種可能在五種培養(yǎng)基中反復(fù)出現(xiàn)，導(dǎo)致GCCB中同種菌種的重復(fù)采集，在目測菌落形態(tài)相同或相似的情況下，同一腸段不同培養(yǎng)基之間，相同的菌種只選擇其中1株作為GCCB成員。所有納入GCCB的菌株經(jīng)過進(jìn)一步純化培養(yǎng)后，挑單菌落接種至各自分離平板對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，制備成甘油凍干管，保藏在-40 ℃冰箱中備用。

表1 5種菌群分離用非選擇性培養(yǎng)基的配方

1.2 核心菌株的活化與培養(yǎng)

從-40 ℃冰箱中取出事先保存好的腸道核心菌株甘油管，自然解凍。無菌操作，將其接種至事先滅菌好的空白TSB(或NB)液，蓋緊后置于37 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)12～24 h，使冷凍菌株復(fù)蘇。取復(fù)蘇菌液劃線接種TSA(或NA)平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，用于確認(rèn)菌株的純一性。確認(rèn)純一的菌株則按2%的接種量用空白TSB(或NB)液連續(xù)傳代活化2次，取活化好的過夜培養(yǎng)液，用于16S rDNA的擴(kuò)增或細(xì)菌全基因組的提取。

1.3 16S rDNA序列的擴(kuò)增

取1 mL新鮮活化好的核心菌株培養(yǎng)液，10 000 r/min離心5 min，棄上清后用1 mL雙蒸水洗滌沉淀菌體細(xì)胞1次，同條件再次離心棄上清，沉淀菌體細(xì)胞用1 mL雙蒸水重懸后即作為DNA模板加入25 uL PCR反應(yīng)體系(無菌ddH2O、2×SanTaq PCR Mix(上海生工：B532061)、上下游引物)，利用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25個循環(huán)；72 ℃ 8 min)。陰性對照用無菌ddH2O替代DNA模板進(jìn)行。對于少量直接用菌體細(xì)胞重懸液作為DNA模板無法擴(kuò)增出其16S rDNA的菌株，則利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工：B518225)先進(jìn)行基因組的提取(提取方法參照試劑盒操作說明書)，然后再用提取后的基因組DNA作為16S rDNA序列擴(kuò)增的模板按上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

所有PCR產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳(200 V，30 min)，進(jìn)行純度與濃度的檢測，取條帶單一且清晰、亮度足夠，位于DNA Marker 所示1.5 kb左右的樣品，送往擎科生物(武漢公司)進(jìn)行測序。

1.4 16S rDNA測序

所有樣品均采用一代Sanger法進(jìn)行序列測定，為了測出16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的全序列，本研究采用雙向測通方案進(jìn)行測序。測序結(jié)束后，由測序公司負(fù)責(zé)將雙側(cè)序列拼接成一條完整的16S rDNA序列。

1.5 GCCB的OTU聚類分析

將測序獲得全部菌株的原始16S rDNA序列，根據(jù)數(shù)據(jù)處理的相關(guān)要求，使用Mothur、bioEdit、DNAstar等生物學(xué)軟件，對原始序列進(jìn)行質(zhì)檢、篩選、校正、對齊、合并等處理。然后經(jīng)Mothur軟件的summary程序檢測，去除前后引物并校正后的序列平均長度在1 400 bp左右。針對16S rDNA全序列測序結(jié)果，采用去冗余、嵌合體檢測、多重比對、過濾、雙序列距離矩陣比對等程序處理，然后根據(jù)furthest neighbor算法，選擇Mothur軟件對遺傳信息距離矩陣進(jìn)行聚類。將97%以上相似度的序列歸類并作為一個OTU(operational taxonomic unit)。提取OTU代表性序列文件，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行Clustal W算法比對，然后采用Neighbor-Joining算法構(gòu)建并繪制進(jìn)化樹。

1.6 GCCB的NCBI在線BLAST分析

登錄NCBI BLAST網(wǎng)址(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行在線分析。在nucleotide數(shù)據(jù)庫中采用 megablast法對所有序列進(jìn)行逐一比對。根據(jù)E值(Expect)、一致性(Indentities)、插入或缺失(Gaps)3個主要參數(shù)進(jìn)行結(jié)果分析判別。按照相似性好、匹配度高、Gaps少的標(biāo)準(zhǔn)來確認(rèn)每條序列最佳匹配物種序列。在門(phylum)、目(order)、科(family)、屬(genus)4個分類學(xué)水平上分析總結(jié)各腸道、各節(jié)段的菌群組成和分布特征。

1.7 GCCB的多樣性分析

基于NCBI BLAST分析各腸道菌群結(jié)構(gòu)的結(jié)果，使用Mothur軟件進(jìn)行α多樣性分析并計算菌群多樣性指數(shù)。在多樣性方面，Shannon 指數(shù)反映了群落的多樣性，Simpson 指數(shù)反映了群落中優(yōu)勢物種的集中程度；在豐度方面，Chao1 指數(shù)和ACE指數(shù)對群落中的稀有菌種具有更好的估計。Shannon 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、ACE指數(shù)越大，Simpson 指數(shù)越小，則樣品中的物種多樣性越高。

1.8 GCCB在不同腸段的分布特征分析

綜合NCBI在線BLAST的分析結(jié)果及Mothur的OTU聚類分析數(shù)據(jù)，對豬腸道中的可培養(yǎng)核心菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸類處理。估計豬腸道可培養(yǎng)核心菌群在各個腸段的OTU真實分布，繪制不同OTU的菌株數(shù)在不同腸段的分布熱圖。根據(jù)全部腸道不同節(jié)段的菌株分布，利用heatmap軟件(“http://www.heatmapper.ca/”，Heml軟件)在種水平上繪制heatmap圖。同時歸納并描述各腸段分離可培養(yǎng)核心菌群的交叉分布信息，繪制各腸段菌群分布的Venn圖(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)。

1.9 相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

可培養(yǎng)核心菌群的組成以及其多樣性指數(shù)等的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和ANOVA分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

本研究共對分離自健康成年商品豬6個腸段17個腸節(jié)段的共355株可培養(yǎng)核心菌株進(jìn)行了16S rDNA全序列的檢測，其中十二指腸83株、空腸84株、回腸30株、盲腸48株、結(jié)腸58株、直腸52株。

2.1 OTU聚類與菌群結(jié)構(gòu)分析

在97%的相似水平上對全部核心菌株的16S rDNA進(jìn)行聚類分析，共獲得32個OTU，物種注釋結(jié)果顯示它們分屬于8個菌屬，17個菌種(見表2)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，各腸段分離的核心菌株數(shù)量與OTU的聚類個數(shù)無顯著相關(guān)性(P>0.05，見圖1)。

圖1 不同腸段GCCB的OTU聚類分析結(jié)果

將聚類所得32個OTU用MEGA 6.0軟件進(jìn)一步繪制種屬進(jìn)化樹(見圖2)，將所得進(jìn)化樹結(jié)合物種注釋結(jié)果(見表2)來看，同一菌屬下的種、亞種均能較好的聚集到1個分支上，各分支間的距離也能在一定程度上體現(xiàn)種屬間的差異水平，展示物種之間的親緣關(guān)系。

圖2 核心菌群OTU聚類后的種屬進(jìn)化樹繪制

表2 成年豬腸道GCCB的OTU聚類分析結(jié)果

2.2 腸道可培養(yǎng)核心菌群16S rDNA的NCBI在線BLAST結(jié)果與分析

本研究同時對所有核心菌株的16S rDNA序列進(jìn)行NCBI在線數(shù)據(jù)庫的逐一比對。將比對結(jié)果按種屬結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計，355株核心菌株分別屬于3個菌門、5個菌目、6個菌科、13個菌屬(見表3)、33個菌種及亞種。核心菌群中以Escherichia、Bacillus、Proteus3個菌屬豐度最高，分別占據(jù)檢測樣本的41%、30%和9%。

表3 成年豬腸道GCCB的結(jié)構(gòu)組成

2.3 α多樣性分析

α多樣性的分析結(jié)果(表4)表明，成年商品豬腸道中，可培養(yǎng)核心菌群多樣性最豐富的為結(jié)腸和空腸，其次為直腸和十二指腸，多樣性最簡單的則為回腸和盲腸。

表4 豬腸道GCCB的α多樣性指數(shù)分析

2.4 成年豬不同腸段GCCB的結(jié)構(gòu)及其分布特征分析

從本研究的結(jié)果來看，355株GCCB在門水平上，除其中1株為Actinobacteria外，其余均為Proteobacteria和Firmicutes。在全部檢出的33個菌(亞)種中，小腸共檢出27種，大腸共檢出26種，其中大、小腸共有菌種17種。不同腸段間，十二指腸共檢出8個菌屬，16個菌種，其中豐度排列前3的菌種依次為Escherichiacoli、Bacillusamyloliquefaciens和Bacillusvelezensis；空腸共檢出9個菌屬，20個菌種，其中豐度最高的3種為Escherichiacoli、Bacillusvelezensis和Bacillussubtilis；回腸共檢出6個菌屬，10個菌種，豐度排列前3的菌種為Escherichiacoli、Cronobactersakazakii和Proteusmitabilis；盲腸共檢出6個菌屬，10個菌種，豐度最高的前3菌種為Escherichiacoli、Bacillusvelezensis和Proteusmitabilis；結(jié)腸共檢出10個菌屬，20個菌種，豐度最高的前3菌種為Escherichiacoli、Klebsiellaquasipneumoniae和Bacillusvelezensis；直腸共檢出8個菌屬，15個菌種，豐度排列前3的菌種為Escherichiacoli、Cronobactersakazakii、Bacillusvelezensis(見圖3)。

圖3 成年商品豬不同腸段的GCCB組成結(jié)構(gòu)圖

通過對不同腸段中檢出菌種的相對豐度分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)Escherichiacoli在所有腸段均有檢出，且在各腸段中均是檢出數(shù)量最多的菌種，其中盲腸是檢出概率最高的腸段，占全部檢出菌株的56.25%。Bacillusvelezensis在盲腸、結(jié)腸、直腸，以及十二指腸、空腸均是主要檢出菌種，但在回腸卻沒有檢出。Bacillusamyloliquefaciens和Proteusmirabilis在各腸段均有分布，其中前者以十二指腸的檢出頻率最高，后者則在回腸中的相對含量更高。此外，Cronobactersakazakii雖然在十二指腸、盲腸和結(jié)腸都沒有檢出，但它在回腸中的檢出頻率卻僅次于Escherichiacoli。

圖4 成年商品豬不同腸段GCCB相對豐度圖

為了進(jìn)一步分析各腸段間共有菌群的分布特性，本研究還對全部檢出菌種進(jìn)行了分類統(tǒng)計，結(jié)果顯示，小腸、大腸各腸段之間的共有菌種均為6種，而在整個腸道的六個腸段均有分布的菌種有5種(圖5)，分別是Escherichiacoli、Bacillusamyloliquefaciens、Shigella、Bacillus和Proteusmirabilis，占全部檢出菌總數(shù)的60.56%。Proteuspenneri在小腸中廣泛分布而在大腸中僅在結(jié)腸中檢出，同樣，在大腸中普遍存在的Bacillusvelezensis在回腸中也沒有發(fā)現(xiàn)。

圖5 不同腸段共有核心菌群的分析

同時，本研究還對同一腸段不同腸節(jié)段之間的可培養(yǎng)核心菌群進(jìn)行了比較分析。從圖6可以看出，Escherichiacoli雖然廣泛分布于整個腸道，但檢出率最高的腸段還是回腸、盲腸和十二指腸前段。Cronobactersakazakii雖然不是在腸道的每一節(jié)段都有檢出，但其在回腸和直腸前段的檢出率卻很高。Bacillusamyloliquefaciens廣泛分布于十二指腸、回腸和大腸各段，但在空腸各節(jié)段中卻很少檢出。類似的還有Bacillusvelezensis，該菌廣泛分布在腸道的大多數(shù)節(jié)段，但回腸和直腸前段卻沒有檢出。

圖6 豬腸道不同節(jié)段可培養(yǎng)菌群的分布特征

3 討 論

3.1 成年豬腸道GCCB的總體結(jié)構(gòu)特征

本研究利用5種不同的非選擇性培養(yǎng)基，對商品豬不同腸段不同節(jié)段的GCCB進(jìn)行了分離培養(yǎng)，通過對分離菌株16S rDNA全序列的檢測與分析，發(fā)現(xiàn)成年商品豬腸道內(nèi)的GCCB絕大部分均屬于Proteobacteria和Firmicutes 2門，而且以Escherichia、Bacillus、Proteus3個屬為主，占樣本檢出量的80%。雖然本研究檢測的只是腸道中的GCCB，但從檢測結(jié)果來看，腸道菌群的總體構(gòu)成與Kelly等[16]和Zhao等[17]通過高通量的方法對不同腸段內(nèi)菌群多樣性的研究結(jié)果相一致，而與Regina等[18]和Kim等[19]利用糞便樣品所測得的豬腸道菌群主要由Firmicutes和Bacteroidetes構(gòu)成的結(jié)果不完全相同。因此可以推斷，動物腸道內(nèi)與動物糞便的菌群結(jié)構(gòu)是有差異的，對動物腸道菌群的研究來說，僅僅檢測糞便樣品中的菌群結(jié)構(gòu)是不夠的。

3.2 成年豬腸道GCCB不同腸段的結(jié)構(gòu)特征

本研究因為菌群分離時不同腸段內(nèi)容物的稀釋倍數(shù)不同，因此不同腸段分離所得的菌株在各腸段的實際數(shù)量也是不同的，但所有分離菌株均為所在腸段含量最多的可培養(yǎng)菌種，因此能很好地反映不同腸段和節(jié)段中的可培養(yǎng)優(yōu)勢菌群組合。從不同腸段GCCB的結(jié)構(gòu)來看，Escherichiacoli、Bacillusamyloliquefaciens、Shigella、Bacillus和Proteusmirabilis5種菌是廣泛分布于所有腸段的共有菌。同時本研究還發(fā)現(xiàn)盡管空腸的可培養(yǎng)菌含量相對不高[20]，但其種類卻比較豐富，而盲腸含菌量相對豐富，但其菌群的多樣性卻不高。Looft等[21]認(rèn)為，不同腸段中菌群結(jié)構(gòu)的不同是基于不同菌群在腸道中所起的作用不同，小腸菌群多與腸道內(nèi)小分子物質(zhì)的吸收有關(guān)，而大腸菌群則與腸道內(nèi)容物中的植物細(xì)胞壁降解有關(guān)。同樣，Kelly等[16]認(rèn)為不同腸段的菌群構(gòu)成還因其腸道粘膜毛細(xì)血管擴(kuò)散出來的氧分及腸腔內(nèi)容物中的營養(yǎng)成分的含量不同而不同，十二指腸和空腸粘膜菌群絕大部分為Proteobacteria，隨著腸道向后延續(xù)，在回腸和大腸部分Proteobacteria逐漸減少，而Bacteroidetes和Firmicutes依次增多。由于菌群分離過程的工作量比較大，本試驗未同時對成年豬腸道中的厭氧可培養(yǎng)菌群進(jìn)行分離篩選，因此，本研究的結(jié)果僅代表普通可培養(yǎng)核心菌群的結(jié)果。

3.3 腸道菌群多樣性分析中16S rDNA全長測序與局部測序的差異

在當(dāng)前動物腸道菌群的結(jié)構(gòu)與多樣性研究中，16S rDNA的高通量測序分析法已成主流，但由于測序技術(shù)所限，目前大多都是基于16S rDNA的1個或2個可變區(qū)進(jìn)行，無法覆蓋整個16S rRNA基因，因此必然存在比對信息不足、比對結(jié)果準(zhǔn)確度偏低等問題[22-23]。為了避免此類問題的發(fā)生，本試驗采用了16S rDNA的全序列進(jìn)行測序并比對。通過Mothur軟件的OTU聚類分析，結(jié)果表明本研究所分離菌株分別屬于8個屬，17個種。然而，通過16S rDNA全序列的NCBI在線比對結(jié)果卻顯示本研究所分離菌株分為13個屬，33個種或亞種。這一結(jié)果表明，OTU的聚類分析雖然具有很好的科學(xué)依據(jù)，但它作為一種純粹的計算機(jī)算法，依然存在一定系統(tǒng)缺陷[13]，某些預(yù)測的OTU并不能代表真實的細(xì)菌種類，并與傳統(tǒng)的菌群分類學(xué)分類不符[24]。

4 結(jié) 論

成年商品豬腸道中的GCCB主要包括Escherichia、Bacillus、Proteus3個菌屬中的十幾個菌種，在這些菌種中，Escherichiacoli、Bacillusamyloliquefaciens、Shigella、Bacillus和Proteusmirabilis5個菌種分布于成年豬腸道的幾乎所有節(jié)段。在腸道菌群多樣性分析中，計算機(jī)軟件的OTU聚類分析結(jié)果可能與16S rDNA全序列測定后的比對結(jié)果存在較大的差異。