涂片抗酸染色T-SPOT.TB與GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合檢測在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值分析

趙 麗， 胡黎梅， 袁育林， 梁 亮， 蔣 潔

由結(jié)核分枝桿菌感染所致的結(jié)核病是人類傳染病的主要死亡原因之一[1]?！?021年全球結(jié)核病報告》中指出2020年全球新發(fā)結(jié)核病患者約為987萬例，約有150萬例死于結(jié)核病。我國新發(fā)結(jié)核病患者為84.2萬例，僅次于印度，位于全球第二，結(jié)核病對公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[2]。結(jié)核分枝桿菌感染的早期快速診斷是有效控制結(jié)核病的重要手段。目前，用于結(jié)核病診斷或輔助診斷的實驗室方法包括針對結(jié)核分枝桿菌病原體檢測的涂片法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)法；基于免疫反應(yīng)的結(jié)核抗體檢測、結(jié)核菌素皮膚試驗、γ-干擾素釋放試驗[結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-cell spot of tuberculosis assay,T-SPOT.TB)]等。2022年發(fā)布了《綜合醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌感染實驗室檢查共識》[3]，要求綜合醫(yī)院應(yīng)常規(guī)開展涂片鏡檢輔助結(jié)核病的診斷，建議開展γ-干擾素釋放試驗分枝桿菌感染的診斷，有條件的實驗室開展分子生物學(xué)檢測。本研究通過回顧性分析臨床診斷為結(jié)核病患者和非結(jié)核病患者采用涂片抗酸染色(涂片法)、T-SPOT.TB、結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)(GeneXpert MTB/RIF)三種方法的檢測結(jié)果及病例資料，進一步評估三種方法單獨和聯(lián)合檢測對結(jié)核病診斷的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2021年12月至2022年9月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院同時進行涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF檢測的臨床疑診結(jié)核分枝桿菌感染患者的檢測結(jié)果以及病例資料，共298例。排除陳舊性結(jié)核、無法確診是否為結(jié)核分枝桿菌感染的患者31例，最終納入267例。

1.2分組方法 (1)結(jié)核組：根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)[4]，①臨床診斷病例：經(jīng)鑒別診斷排除其他肺部疾病。成人：胸部影像有活動性肺結(jié)核相符的病變并伴有以下任意一條，a.有肺結(jié)核癥狀；b.結(jié)核菌素試驗中度以上陽性；c.γ-干擾素釋放試驗陽性；d.結(jié)核抗體檢查陽性；e.肺外組織病理為結(jié)核病變；f.支氣管鏡鏡下符合結(jié)核病改變。兒童：胸部影像學(xué)有活動性肺結(jié)核相符的病變；伴有肺結(jié)核可疑癥狀；伴結(jié)核菌素試驗中度以上陽性或γ-干擾素釋放試驗陽性。②確診病例：痰涂片陽性肺結(jié)核(符合以下三項之一)，a.2份痰涂片抗酸桿菌檢查陽性；b.1份痰涂片抗酸桿菌檢查陽性+胸部影像有活動性肺結(jié)核相符的病變；c.1份痰涂片抗酸桿菌檢查陽性+1份痰分枝桿菌培養(yǎng)陽性。僅分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性肺結(jié)核：胸部影像有活動性肺結(jié)核相符的病變且僅結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性。分子生物學(xué)陽性肺結(jié)核：胸部影像有活動性肺結(jié)核相符的病變且僅分枝桿菌核酸檢測陽性。肺組織病理學(xué)陽性肺結(jié)核：肺組織病理符合結(jié)核病病理改變。最終臨床確診結(jié)核患者共74例。(2)非結(jié)核組：經(jīng)相關(guān)檢查及治療后排除結(jié)核感染的患者193例。兩組年齡、性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組年齡、性別比較[n(%)，M(P25，P75)]

1.3檢驗方法

1.3.1 涂片法 取干凈容器收集清晨的深咳痰、支氣管鏡檢灌洗液、胸水等標(biāo)本，采用萋-尼抗酸染色，按《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]進行涂片染色鏡檢及結(jié)果判讀。

1.3.2 T-SPOT.TB 抽取患者足量的外周靜脈血置于肝素抗凝管中，于4 h內(nèi)進行外周血單個核細胞分離后嚴(yán)格按照結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒(Oxford Immunotec，英國)說明書操作。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照孔正常，空白對照孔斑點數(shù)為0～5個，抗原A或抗原B孔的斑點數(shù)-空白對照孔斑點數(shù)≥6個，結(jié)果判讀為陽性。若空白對照孔斑點數(shù)為6～10個，抗原A或抗原B孔的斑點數(shù)≥2×空白對照孔斑點數(shù)，結(jié)果亦判讀為陽性。若不符合以上標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果則判讀為陰性。

1.3.3 GeneXpert MTB/RIF 不同標(biāo)本的前處理：(1)痰、氣管吸物：取1 ml痰標(biāo)本放置到旋蓋錐形管中，加入2 ml樣本處理液，使用渦旋儀振蕩15～30 s，室溫靜置10 min；再次使用渦旋儀振蕩10 s，室溫靜置5 min，直至痰液充分液化。(2)肺泡灌洗液：將灌洗液(>5 ml)轉(zhuǎn)移至錐形離心管中，3 000 g離心15 min，棄上清，加入2 ml樣本處理液并渦旋振蕩，重懸沉淀物，充分混勻。(3)胸水、腹水、腦脊液：將胸水、腹水、腦脊液轉(zhuǎn)移至錐形離心管中，3 000 g離心15 min，棄上清，加入2 ml樣本處理液并渦旋振蕩，重懸沉淀物，充分混勻。將2 ml處理好的標(biāo)本加入反應(yīng)盒，應(yīng)用GeneXpert檢測系統(tǒng)(美國Cepheid公司)進行檢測。系統(tǒng)可自動判讀待測樣本是否檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及利福平的耐藥情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(下四分數(shù)，上四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF單項檢測診斷效能比較 涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF檢測的靈敏度分別為43.2%、94.6%、63.5%，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=44.861，P=0.000)；特異度分別為99.5%、66.3%、100.0%，其中涂片法與GeneXpert MTB/RIF特異度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.000，P=1.000)，而T-SPOT.TB檢測特異度低于涂片法和GeneXpert MTB/RIF，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=74.861，P=0.000；χ2=78.162，P=0.000)。GeneXpert MTB/RIF的準(zhǔn)確率最高，為89.9%，三種方法檢測準(zhǔn)確率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.468，P=0.000)。見表2。

表2 涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF單項檢測診斷效能比較[%(n/N)]

2.2涂片法分別聯(lián)合T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF檢測診斷效能比較 聯(lián)合實驗診斷過程中，兩種方法中有一種方法為陽性即診斷為陽性。267例患者均接受了三種方法檢測，涂片法聯(lián)合T-SPOT.TB檢測的靈敏度與涂片法相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=45.548，P=0.000)。涂片法聯(lián)合GeneXpert MTB/RIF檢測的靈敏度與涂片法相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.965，P=0.008)。見表3。

表3 涂片法分別聯(lián)合T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF檢測診斷效能比較[%(n/N)]

3 討論

3.1結(jié)核病因其高發(fā)生率、易傳染、發(fā)病隱匿以及臨床癥狀無特異性造成社會極大的疾病負擔(dān)[6]。因此，早期快速診斷結(jié)核分枝桿菌的感染對于有效控制結(jié)核病傳播、減輕社會疾病負擔(dān)具有重要意義。本研究通過回顧性分析我院2021年12月至2022年9月同時進行涂片法、T-SPOT.TB、GeneXpert MTB/RIF三種方法的患者檢測結(jié)果以及病例資料，評估其診斷效能，為臨床快速診斷結(jié)核病提供思路。

3.2涂片法是結(jié)核病確診應(yīng)用最廣泛的實驗室診斷方法[7]。其基于結(jié)核分枝桿菌細胞壁內(nèi)含有大量脂質(zhì)與石碳酸復(fù)紅結(jié)合后能夠抵抗酸性酒精的脫色作用致使菌體保持紅色這一特性對結(jié)核分枝桿菌進行鑒定，簡單快速、成本低廉、可行性高。以往研究顯示涂片法易受標(biāo)本含菌量(每毫升樣本含菌量達5 000～10 000條時才可檢出陽性)、操作人員技術(shù)水平影響，陽性率低，僅為14%～47%[8-9]。本研究結(jié)果顯示涂片法的靈敏度為43.2%，在三者中最低，進一步說明了涂片法容易造成臨床漏診。本研究中涂片法特異度為99.5%，193例非結(jié)核患者中有1例涂片法結(jié)果陽性而經(jīng)二代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)診斷為非結(jié)核分枝桿菌感染，提示涂片法無法區(qū)別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，易引起臨床誤診。陳蕾等[10]研究發(fā)現(xiàn)我國非結(jié)核分枝桿菌感染率逐年上升。楊栗坤等[11]指出非結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌感染所致的臨床癥狀、肺部影像學(xué)表現(xiàn)十分相似。非結(jié)核分枝桿菌對臨床治療結(jié)核藥物表現(xiàn)出耐藥性，楊燕和曾誼[12]研究表明非結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平、鏈霉素以及二線抗結(jié)核藥物對氨基水楊酸、卡那霉素、左氧氟沙星的耐藥率均超過90%。若臨床將非結(jié)核分枝桿菌感染誤診為結(jié)核病，其治療效果差，且延誤病情致使患者預(yù)后差。

3.3T-SPOT.TB是以結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼的早期分泌抗原靶6(early secretory antigenic target 6,ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10,CFP10)作為刺激源刺激存在于結(jié)核分枝桿菌感染患者體內(nèi)的效應(yīng)T細胞分泌γ-干擾素，并聯(lián)合酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)檢測是否感染結(jié)核的免疫學(xué)方法。檢測標(biāo)本為外周靜脈血，對不易咯痰的患者具有優(yōu)勢；不受患者排菌狀態(tài)、排菌數(shù)量的影響，靈敏度高；且不與環(huán)境分枝桿菌、卡介苗發(fā)生交叉反應(yīng)。本研究中，T-SPOT.TB的靈敏度為94.6%，三者中最高；特異度為66.5%，三者中最低。比尹洪云等[13]研究中對不同人群T-SPOT.TB檢測的靈敏度(82%～84%)和特異度(53%～54%)都高。臨床應(yīng)用T-SPOT.TB輔助診斷結(jié)核感染時需考慮假陽性的可能。假陽性的原因包括堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、戈登分枝桿菌的存在[14-15]。在本研究中，3例T-SPOT.TB檢測結(jié)果為陽性的非結(jié)核患者中，1例NGS診斷為龜分枝桿菌感染，2例NGS診斷為膿腫分枝桿菌感染，這與以往文獻報道不一致，需進一步研究。另外，研究表明T-SPOT.TB具有較高的陰性預(yù)測值[16]，陰性結(jié)果對于排除結(jié)核病具有重要意義。但需注意T-SPOT.TB實驗與機體內(nèi)效應(yīng)T細胞的數(shù)量和功能密切相關(guān)[17]?；颊呙庖呦到y(tǒng)發(fā)育不完善或免疫系統(tǒng)遭到破壞時易出現(xiàn)T-SPOT.TB實驗結(jié)果假陰性。本研究中有3例T-SPOT.TB陰性的結(jié)核患者，2例起病急，考慮可能為感染早期導(dǎo)致的假陰性；另1例為20歲年輕女性，免疫功能正常，發(fā)病20 d檢測結(jié)果顯示假陰性，胸水GeneXpert MTB/RIF檢測陽性。假陰性結(jié)果原因有待進一步研究。

3.4GeneXpert MTB/RIF是世界衛(wèi)生組織推薦的結(jié)核病檢測分子診斷方法[18]，2017年發(fā)布的《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷》[4]將其納入肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其檢測快速，2 h即可完成[19]。Wang等[20]指出GeneXpert MTB/RIF的靈敏度比涂片法、培養(yǎng)法高，約為53.54%；能夠準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，特異度近100%[21]。在本研究中，GeneXpert MTB/RIF的檢測靈敏度為63.5%，與文獻報道相比靈敏度略高，造成這種差異的原因可能是地區(qū)、研究樣本總數(shù)的不同。該法特異度為100.0%。因此，當(dāng)患者涂片法結(jié)果為陽性而GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果為陰性時，提示醫(yī)師應(yīng)高度懷疑患者感染非結(jié)核分枝桿菌，及時對患者進行非結(jié)核分枝桿菌相關(guān)檢查并調(diào)整治療方案。此外，GeneXpert MTB/RIF能夠檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥情況，其靈敏度為66.7%，特異度為100.0%[22]。值得注意的是，rpoB基因的沉默突變會導(dǎo)致GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥情況出現(xiàn)假陽性[23]。

3.5本研究結(jié)果顯示，三種方法中GeneXpert MTB/RIF的準(zhǔn)確率(89.9%)、特異度(100.0%)和陽性預(yù)測值(100.0%)最高，T-SPOT.TB的靈敏度(94.6%)和陰性預(yù)測值(97.0%)最高，T-SPOT.TB或GeneXpert MTB/RIF檢測的靈敏度顯著高于涂片法。采用T-SPOT.TB或GeneXpert MTB/RIF聯(lián)合涂片法均可顯著提高結(jié)核病診斷的靈敏度。T-SPOT.TB和GeneXpert MTB/RIF還具有快速檢測的特性，可大大縮短檢測時間。

綜上所述，綜合醫(yī)院應(yīng)根據(jù)實際情況進行多種結(jié)核病診斷方法的聯(lián)合檢測，能有效提高結(jié)核病的快速實驗室診斷能力，及時協(xié)助臨床制定抗感染方案，遏制結(jié)核感染性疾病的傳播。