β-環(huán)糊精丁烯酸酯對噻菌靈的增溶效果及其復(fù)合物的抑菌活性

李詠富，羅其琪，田竹希，何揚波，石彬，龍明秀

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽 550006）（2.貴州省特色農(nóng)產(chǎn)品輻照保鮮與加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽 550006）

噻菌靈（2-(4-thiazolyl)-1H-benzimidazole）是一種苯并咪唑類殺菌劑，屬于內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，作用機制為抑制真菌有絲分裂過程中的微管蛋白的形成，可防治多種真菌引起的真菌病害[1]。此外，在水果保鮮領(lǐng)域中，噻菌靈也可用于柑橘、荔枝和梨等水果貯藏期的真菌病害[2,3]。噻菌靈雖然具有較好的抑菌活性，但其水溶性差，其溶解度隨溶液的pH 值變化而變化，25 ℃條件下，當水溶液的pH 值2 時，水中溶解度約為10 g/L，當pH值5～12時，水中溶解度低于50 mg/L[4]。雖然在低pH 值條件下，噻菌靈在水溶的溶解性較高，但在果蔬保鮮過程中，較低的pH 值處理果蔬表皮會對其表皮組織產(chǎn)生不可逆的損傷。處理后，噻菌靈經(jīng)果皮逐漸向果肉滲透，增加了人體攝入的風險。因此，增加噻菌靈在水溶液中的溶解度且降低其向果蔬組織內(nèi)部遷移是提高噻菌靈在果蔬保鮮領(lǐng)域中應(yīng)用安全性的有效途徑。

β-環(huán)糊精是一種常用的疏水性藥物的包埋載體，但在室溫下其溶解度較低，僅為18.5 g/L（16.3 mmol/L），在水中的溶解度隨著溫度的升高而升高，室溫下對疏水性藥物的增溶效果有限。因此，需要對β-環(huán)糊精進行化學改性，增加其溶解性，并提高其對疏水性藥物的包埋能力。張志飛[5]和馮鳴等[6]分別制備了2-羥丙基-β環(huán)糊精和6-羥丙基-β環(huán)糊精，其在水中的溶解度分別為700 g/L 和500 g/L。

本研究通過將β-環(huán)糊精的羥基酯化制備丁烯酸β-環(huán)糊精酯，以期增加其在水中的溶解度，同時在β-環(huán)糊精中引入乙烯基基團，可作為制備β-環(huán)糊精的高分子聚合物的結(jié)構(gòu)單體；同時，將丁烯酸β-環(huán)糊精酯作為藥物載體，增加疏水性抑菌劑噻菌靈在水中的溶解度。同時，本研究通過相溶解度實驗[7,8]，考察丁烯酸β-環(huán)糊精酯對噻菌靈的增溶效果，并確定噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成的藥物復(fù)合物的穩(wěn)定常數(shù)（Kc）。通過抑菌實驗，考察藥物包結(jié)復(fù)合物的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

β-環(huán)糊精、丁烯酸、N,N-羰基二咪唑、二甲氨基吡啶、N,N-二甲基甲酰胺、氫化鈣、三乙胺、磷酸、癸烷磺酸鈉和無水乙醇均為分析純試劑，采購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實驗用水為超純水。噻菌靈標準試劑采購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。黑曲霉（CMCCF98003）采購于南京樂診生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent-1260 型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Spectrum 400 ART-紅外光譜儀，珀金埃爾默科技有限公司；IKA-10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國艾卡科技有限公司。

1.3 噻菌靈的液相檢測

1.3.1 離子對試劑

取7.0 mL 磷酸加入盛有200 mL 水的燒杯中，攪拌稀釋，然后加入1.0 g 癸烷磺酸鈉，溶解，再加入10.0 mL 三乙胺，加水稀釋至1 000 mL。使用三乙胺調(diào)節(jié)pH 值至2.4。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18 柱，100A（250 mm×4.60 mm），Kromasil，德國Eka Chemicails 公司；流動相：甲醇/離子對試劑（50/50），流量0.8 mL/min；檢測條件：檢測波長300 nm；色譜柱溫度30 ℃；進樣量10.00 μL[9]。

1.3.3 噻菌靈標準曲線

準確稱取10.00 mg 噻菌靈于燒杯中，加入少量甲醇溶解，并定容至10 mL。將上述溶液梯度稀釋至1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 和500.0 μg/mL，得到不同濃度的標準工作液。每個質(zhì)量濃度標準工作液進行液相色譜測量，每個樣品進樣3 次。根據(jù)峰面積同濃度建立標準工作曲線：

1.4 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的合成

1.4.1 催化劑溶液配制

稱取0.61 g 4-二甲基吡啶加入少量N,N-二甲基甲酰胺溶解，之后再100 mL 容量瓶中定容備用。

1.4.2β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的合成

準備潔凈的250 mL 三角瓶將其置于120 ℃烘箱中，加熱30 min 烘干備用。分別稱取11.35 gβ環(huán)糊精和7.74 g 丁烯酸置于250 mL 三角瓶，加入100 mL N,N-二甲基甲酰胺磁力攪拌溶解，之后再加入7.0 mL催化劑。稱取14.59 g N,N-羰基二咪唑置于250 mL 三角瓶中并加入100 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解。待三角瓶中無固體顆粒存在時，將羰基二咪唑溶液加入溶有環(huán)糊精的三角瓶中，25 ℃水浴磁力攪拌下反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后加入20 mL 水終止反應(yīng)[10]。

1.4.3 產(chǎn)物純化

上述反應(yīng)后的混合溶液于60 ℃，減壓（5 mbar）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液粘稠，向旋蒸瓶加入100 mL 無水乙醇沉淀出粗產(chǎn)物；將沉淀物加入到料理杯中充分攪拌，每次加入50 mL 無水乙醇，攪拌過后倒出靜止一段時間去除上清液，重復(fù)該操作5 次。將上述洗滌后的沉淀轉(zhuǎn)移至空的SPE 小柱，真空抽濾，在SPE 小柱中分3 次加入100 mL 無水乙醇沖洗上述沉淀物，得到純化后的產(chǎn)物。產(chǎn)物在55 ℃下烘干備用。

1.5 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的結(jié)構(gòu)表征

ATR-FTIR 譜圖采用紅外光譜儀Spectrum 400（Perkin Elmer Co.美國）進行檢測。ATR 附件包含金剛石晶體內(nèi)反射部件，紅外光束的入射角45 °。光譜分辨率為4 cm-1，光譜在該分辨率上執(zhí)行總共16 次掃描背景和樣本[11,12]。每個樣品大約10 mg，加樣后立即進行掃描。確保樣品表面無空氣氣泡，在樣品上方放置一小塊鋁箔。采樣結(jié)束后，ATR 附件晶體用75%（V/V）的酒精清洗，在收集下一個樣品圖譜前，重新進行背景掃描。每個樣品重復(fù)三次，取其均值使用Origin 2018 數(shù)據(jù)處理軟件進行作圖。

1.6 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的溶解度測定

稱取1.00 gβ-環(huán)糊精-丁烯酸酯到15 mL 離心管內(nèi)，加入10 mL 超純水，于25 ℃水域中磁力攪拌24 h，在6 000 r/min 的速度下離心，除去上清液，沉淀物于100 ℃烘箱內(nèi)至恒重，稱量質(zhì)量。溶解實驗重復(fù)三次。

1.7 相溶解度實驗

相溶性研究是一種評價環(huán)糊精對疏水藥物溶解度的影響傳統(tǒng)的方法，該方法由Higuchi 和Connors 在1965 年提出[13]。表觀穩(wěn)定系數(shù)的計算如式（1）所示：

式中：

S0——噻菌靈在純水中的溶解度；

slope——相溶解度圖中線性方程的斜率；

Kc——表觀穩(wěn)定系數(shù)。

將噻菌靈（100 mg）分別加入含有10 mL 不同濃度β-環(huán)糊精-丁烯酸酯（0、4.15、8.31、12.47 和16.62 mmol/L）和β-環(huán)糊精（0、0.88、2.64 和4.41 mmol/L）的具塞三角瓶內(nèi)。然后用封口膜將具塞三角瓶瓶口密封以防止溶液中水分的蒸發(fā)。將封口的三角瓶置于溫度為30、40 和50 ℃水域搖床中，振蕩3 d。當溶液中藥物達到溶解平衡后，將懸濁液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，除去未溶解的藥物，收集濾液，將濾液稀釋一定濃度后，使用高效液相色譜（HPLC）進行分析測試。

1.8 抑菌實驗

噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物對黑曲霉的抑制實驗采用察氏瓊脂法[14]。對照組為30、40 和50 ℃下噻菌靈在純水中的飽和溶液，處理組為上述溫度下噻菌靈在β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯水溶液（β-環(huán)糊精濃度為0.88、2.64 和4.41 mmol/L；β-環(huán)糊精丁烯酸酯的濃度為4.15、8.31、12.47 和16.62 mmol/L）中的飽和溶液。上述溶液經(jīng)0.45 μm 過濾后，分別用移液槍準確吸取7.5 μL 藥物溶液添加加到直徑為6 mm 的濾紙片上，藥物添加兩次（共計15 μL）。將含有藥物的濾紙片均勻的分布于瓊脂培養(yǎng)基上。培養(yǎng)皿于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h后，用游標卡尺測定抑菌圈的大小，抑菌圈的定義為濾紙片邊緣同抑菌圈邊緣之間的距離（單位：mm）。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均進行三次重復(fù)。實驗結(jié)果均值±標準差表示。實驗數(shù)據(jù)采用Prism 5.0 GraphPad 軟件進行統(tǒng)計學分析。差異的顯著性通過配對t檢驗來計算。p＜0.05 認為有統(tǒng)計學意義，兩者有顯著差異，p＞0.05認為兩者無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的紅外結(jié)構(gòu)解析

β-環(huán)糊精（圖1a）、丁烯酸（圖1b）和β-環(huán)糊精-丁烯酸酯（圖1c）的紅外光譜圖如圖1 所示。

丁烯酸的紅外圖譜（圖1b）中，在1 683 cm-1出現(xiàn)了C=O 的伸縮振動，在1 650 cm-1出現(xiàn)了C=C 的伸縮振動，在1 421 cm-1出現(xiàn)了C-OH 面內(nèi)彎曲振動，在1 314 cm-1和1 223 cm-1出現(xiàn)了羧酸C-OH 伸縮振動，在β-環(huán)糊精-丁烯酸酯中沒有出現(xiàn)丁烯酸的特征吸收峰，說明未反應(yīng)的丁烯酸經(jīng)純化過程被除去了。在β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的紅外圖譜中（圖1c）同樣觀察到了β-環(huán)糊精的紅外圖譜（圖1a）中的特征吸收，如說明在形成酯的過程中保留了β-環(huán)糊精完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。β-環(huán)糊精-丁烯酸酯中，在1 738 cm-1出現(xiàn)了不飽和酯羰基C=O 伸縮振動[15]，這是由于當烯類雙鍵與酯羰基的C 原子相連時，共軛效應(yīng)使羰基振動頻率向低頻移動；同時β-環(huán)糊精-丁烯酸酯保留了不飽和雙鍵C=C 的伸縮振動（1 650 cm-1），但該伸縮振動的吸收峰強度顯著降低。同時，在1 253 cm-1觀察到了酯鍵中C-O 的伸縮振動頻率（1 240 cm-1～1 150 cm-1）[16]，頻率升高的原因是由于不飽和雙鍵上的π電子與羰基相的C-O 上氧原子的電子形成了大共軛體系，增強了酯鍵中C-O 的鍵級[17]。通過紅外圖譜對比分析，可以確定β-環(huán)糊精丁烯酸酯的合成。

圖1 β-環(huán)糊精、丁烯酸和β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of β-cyclodextrin,butenic acid and β-cyclodextrin-butenate

2.2 噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯藥物復(fù)合物的紅外圖譜解析

在噻菌靈的紅外圖譜中（圖2a），在1 456 cm-1、1 404 cm-1和1 393 cm-1處，觀察到了噻菌靈化學結(jié)構(gòu)中苯環(huán)骨架的振動吸收峰，在737 cm-1處觀察到了芳環(huán)中C-H 的面外彎曲振動吸收峰[18]，在1 579 cm-1處觀察到了噻菌靈化學結(jié)構(gòu)中C=N 的伸縮振動[19,20]；在噻菌靈-β-環(huán)糊精-丁烯酸酯復(fù)合物的紅外圖譜中同樣觀察到了1 579 cm-1處噻菌靈化學結(jié)構(gòu)中C=N 的伸縮振動吸收峰，說明β-環(huán)糊精-丁烯酸酯可以同噻菌靈形成包結(jié)復(fù)合物；但在藥物復(fù)合物中未觀察到噻菌靈苯環(huán)結(jié)構(gòu)的紅外特征吸收峰，說明噻菌靈同β-環(huán)糊精-丁烯酸酯的作用位點是其結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)同β-環(huán)糊精-丁烯酸酯中的疏水性內(nèi)腔通過弱的分子間相互作用力結(jié)合。

圖2 噻菌靈和噻菌靈-β-環(huán)糊精-丁烯酸酯復(fù)合物的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of thiabendazole and thiabendazole-β-cyclodextrin-butenate complex

2.3 液相色譜分析

通過觀察液相色譜圖發(fā)現(xiàn)，在相同色譜條件下，噻菌靈的保留時間為10.54 min，噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物的保留時間為9.94 min，噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的保留時間為9.88 min，如圖3 所示。保留時間的差異說明噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成包結(jié)復(fù)合物后，其親水性有了一定程度的提高。由于噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的保留時間更靠前，也說明-β-環(huán)糊精丁烯酸酯的親水性優(yōu)于β-環(huán)糊精，也從側(cè)面佐證了β-環(huán)糊精丁烯酸酯的溶解度高于β環(huán)糊精。

圖3 噻菌靈、噻菌靈-β-環(huán)糊精和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatographic diagram of thiabendazole,and thiabendazole-β-cyclodextrin complex and thiabendazole-β-cyclodextrin butenate complex

2.4 β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物對噻菌靈的增溶效果

β環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物均可增加噻菌靈在水中的溶解度，如圖4 所示。隨著溫度及β環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物水溶液濃度的升高，噻菌靈在水中的溶解度也隨之升高。

圖4 不同溫度下噻菌靈在β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物水溶液中的濃度Fig.4 Concentration of thiabendazole in β -cyclodextrin and its butenatederivant aqueous solution at different temperatures

Ay?e Nur Oktay 在藥物復(fù)合物的相溶解度研究中發(fā)現(xiàn)，當客體（藥物）濃度與包埋物溶液濃度成線性關(guān)系時，兩者的化學計量比應(yīng)為1:1[21]。噻菌靈的濃度同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物在水溶液中的濃度成良好的線性關(guān)系，表明噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成的復(fù)合物的化學計量比為1:1。通過線性擬合，得到不同溫度下的斜率，結(jié)合噻菌靈在水溶液中的初始濃度S0值，利用式（1）計算得到藥物復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)Kc，如表1 所示。

表1 不同溫度下復(fù)合物噻菌靈-β-環(huán)糊精和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯的表觀穩(wěn)定系數(shù)Kc及S0值Table 1 The Kc and S0 value of thiabendazole-β-cyclodextrin complex and thiabendazole-β-cyclodextrin-butenate complex at different temperature

隨著溫度的升高噻菌靈-β-環(huán)糊精和噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)Kc逐漸升高，升溫有利于藥物復(fù)合物的形成。經(jīng)方差顯著性分析Kc-β-環(huán)糊精和Kc-β-環(huán)糊精丁烯酸酯并無顯著性差異（p＞0.05），說明兩種藥物復(fù)合物在水中的穩(wěn)定性相近。β-環(huán)糊精丁烯酸酯對噻菌靈的增溶效果是因為其自身在水中的溶解度高于β-環(huán)糊精。在β-環(huán)糊精丁烯酸酯的溶解實驗中，其水溶液中的溶解度為37.92g/L，β-環(huán)糊精在水溶液中溶解度的2.05 倍。目前，未見關(guān)于噻菌靈同β-環(huán)糊精形成包結(jié)復(fù)合物的相關(guān)報道，但根據(jù)姜慧明等的研究報道[22]，多菌靈在羥丙基-β-CD 中的表觀穩(wěn)定系數(shù)為600 M-1，說明多菌靈同羥丙基-β-環(huán)糊精形成的包結(jié)復(fù)合物在水溶液中的穩(wěn)定性更高，這是因為相較于多菌靈分子，噻菌靈的分子結(jié)構(gòu)更大，其4 位的噻唑基的親水性更強，同疏水性的β-環(huán)糊精內(nèi)腔的親合力更低。

2.5 噻菌靈藥物復(fù)合物的抑菌活性

噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物及噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的抑菌圈直徑如圖5a 和圖5b 所示。隨著β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯水溶液濃度的增加，抑菌圈的直徑也逐漸增大。在制備藥物復(fù)合物時，水溶液溫度越高，噻菌靈藥物復(fù)合物的抑菌效果越強。在水溫為50 ℃時，噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物及噻菌靈-β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的抑菌圈直徑分別比噻菌靈對照組增大了1.74 倍和2.09 倍。經(jīng)配對t檢驗，處理組的抑菌圈直徑同對照組存在顯著差異（p＜0.05）；在50 ℃條件下，β環(huán)糊精水溶液濃度為4.41 mmol/L，β環(huán)糊精丁烯酸酯水溶液濃度為4.15 mmol/L 時，抑菌圈的直徑分別為6.18 mm 和5.93 mm，兩者間無顯著差異（p＞0.05）。圖5c（1）為不同溫度下，噻菌靈水溶液的抑菌圈（對照組），圖5c 中（2）和（3）為不同溫度下（β環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物水溶液濃度分別為4.41 mmol/L 和16.62 mmol/L），噻菌靈藥物復(fù)合物的抑菌圈（處理組），由圖5c 可直觀地證明β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物可提高噻菌靈在水中的溶解度，進而提升其抑菌效果。這是由于隨著水溶液溫度、β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯濃度的升高，噻菌靈在水溶液中的濃度也越高。

圖5 不同濃度下噻菌靈復(fù)合物的抑菌圈直徑Fig.5 The inhibition zone diameter of thiamethazim complex at different concentrations

3 結(jié)論

β-環(huán)糊精-丁烯酸酯在水中的溶解度要略好于β-環(huán)糊精，溶解度較β-環(huán)糊精提高了2.05 倍。β-環(huán)糊精-丁烯酸酯在水中的溶解度要低于2-羥丙基-β-環(huán)糊精和6-羥丙基環(huán)糊精，這是由于丁烯酸酯基的親水性要低于羥丙基的親水性。噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成包結(jié)復(fù)合物后，噻菌靈在水中的溶解度得到一定程度上的提升，且隨著β-環(huán)糊精及β-環(huán)糊精丁烯酸酯水溶液濃度的升高而升高；噻菌靈復(fù)合物的抑菌效果也強于噻菌靈對照組，抑菌能力的提升原因在于β-環(huán)糊精及β-環(huán)糊精丁烯酸酯可提高噻菌靈在水溶液中的溶解度。噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物及噻菌靈-β-環(huán)糊精-丁烯酸酯水中的表觀穩(wěn)定系數(shù)無顯著性差異，隨著溫度升高，表觀穩(wěn)定系數(shù)也隨之增高。在近似濃度下（4 mmol/L），噻菌靈-β-環(huán)糊精復(fù)合物和噻菌靈β-環(huán)糊精丁烯酸酯復(fù)合物的抑菌效果之間無顯著性差異（p＞0.05）。噻菌靈同β-環(huán)糊精及其丁烯酸酯衍生物形成的包結(jié)復(fù)合物在水中的穩(wěn)定性要低于多菌靈-羥丙基β-環(huán)糊精復(fù)合物在水中的穩(wěn)定性。