TGF-β1基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病發(fā)病的關(guān)聯(lián)性

楊亞莉，郭永平，馬穎，宋文俠，張雅麗

寶雞市婦幼保健院產(chǎn)科，陜西 寶雞 721000

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期出現(xiàn)或首次發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖代謝異常，其特征是妊娠期胰島β細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)存在潛在的缺陷，可對圍產(chǎn)期和產(chǎn)婦產(chǎn)后結(jié)局造成不良影響[1]。胰島素抵抗增強(qiáng)是GDM發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，報道表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種多功能促炎細(xì)胞因子，可激活促使炎癥調(diào)節(jié)啟動的關(guān)鍵細(xì)胞因子NF-κΒ活性，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，并上調(diào)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達(dá)，最終誘導(dǎo)胰島素抵抗增強(qiáng)[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1基因突變導(dǎo)致其表達(dá)水平異常可能與糖尿病腎病[4]、心肌梗死[5]、子癇前期[6]等一系列疾病發(fā)生有關(guān)，但關(guān)于TGF-β1基因多態(tài)性與GDM發(fā)病風(fēng)險關(guān)系的報道較少。本研究通過探討TGF-β1基因多態(tài)性與GDM發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，旨在進(jìn)一步明確GDM發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性選擇2019年1月至2020年12月于寶雞市婦幼保健院產(chǎn)科檢查并分娩的106例孕婦進(jìn)行研究，所有孕婦在妊娠24～28周進(jìn)行75 g葡萄糖負(fù)荷試驗，根據(jù)試驗結(jié)果將其分為GDM組(n=60)和正常組(n=46)。GDM組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《2016 SOGC臨床實踐指南：妊娠期糖尿病》[7]中有關(guān)GDM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以下任何一項升高即可確診：空腹血糖≥5.1 mmol/L；餐后1 h血糖≥10.0 mmol/L；餐后2 h血糖≥8.5 mmol/L；(2)入組前接受有關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并孕前及妊娠期間高血壓；(2)有嚴(yán)重心、肝、腎等功能臟器疾?。?3)有自身免疫系統(tǒng)疾?。?4)急性、慢性感染者。正常組為正常妊娠孕婦。兩組孕婦的年齡、孕產(chǎn)次等基線資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。此外，根據(jù)White分類法將GDM組分為A1級(n=25)和A2級(n=35)。A1級是指經(jīng)飲食運(yùn)動治療后，孕婦空腹血糖低于5.3 mmol/L，餐后2 h血糖低于6.7 mmol/L，無需給予胰島素干預(yù)；A2級則與A1級相反。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。全部孕婦及其家屬知情并簽署知情同意書。

表1 兩組孕婦的基線資料比較(±s)

表1 兩組孕婦的基線資料比較(±s)

組別GDM組正常組t/χ2值P值例數(shù)60 46年齡(歲)30.27±4.91 29.68±5.34 0.590 0.556孕次(次)2.14±0.39 2.21±0.37 0.936 0.351產(chǎn)次(次)1.56±0.34 1.49±0.31 1.091 0.278

1.2 檢測方法(1)標(biāo)本采集及DNA提?。翰杉惺茉囌咔宄靠崭怪忪o脈血4 mL，其中2 mL應(yīng)用ELISA法檢測血清TGF-β1水平，另外2 mL進(jìn)行抗凝處理，采用Qiagen DNA提取試劑盒提取DNA，DNA標(biāo)本濃度標(biāo)化至50 ng/μL，備用；(2)TGF-β1基因多態(tài)性檢測：目的基因片段擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP-PCR)法：PCR反應(yīng)程序：93℃預(yù)變性3 min，93℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；PCR反應(yīng)體積為30 μL，根據(jù)PCR產(chǎn)物凝膠電泳分帶，確定基因型。TGF-β1+869T/C引物為F：5'-TTCCCGAGCCCTCCTA-3'，R：5'-GCCGCAGCTTGGACAGGATC-3'。

1.3 觀察指標(biāo)統(tǒng)計TGF-β1基因+869T/C位點基因型以及等位基因頻率；比較兩組孕婦血清TGF-β1水平；比較GDM組TGF-β1基因+869T/C位點三種基因型患者血清TGF-β1水平；比較不同基因型GDM患者糖脂代謝指標(biāo)水平，包括空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density liptein cholesterol，LDL-C)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨立t檢驗，TGF-β1基因+869T/C位點三種基因型血清TGF-β1水平比較行單因素方差檢驗分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1基因+869T/C位點多態(tài)性分布所有標(biāo)本均成功進(jìn)行了基因分型，TGF-β1基因+869T/C基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.671，P=0.263)，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 +869T/C位點基因型電泳結(jié)果

2.2 兩組孕婦的TGF-β1基因型及等位基因頻率比較GDM組孕婦的TGF-β1+869T/C位點TT基因型、T等位基因頻率明顯低于正常組，CC基因型、C等位基因頻率明顯高于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而兩組孕婦的TC基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 兩組孕婦TGF-β1+869T/C基因型及等位基因頻率比較[例(%)]

2.3 兩組孕婦的血清TGF-β1水平比較GDM組孕婦的血清TGF-β1水平為(213.68±28.93)ng/mL，明顯高于正常組的(165.81±25.36)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.901，P=0.001)，而A1級與A2級孕婦的血清TGF-β1水平[(208.97±27.72)ng/mL vs(217.04±30.58)ng/mL]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.047，P=0.299)。

2.4 GDM組TGF-β1基因+869T/C位點三種基因型孕婦的血清TGF-β1水平比較GDM組TGF-β1+869T/C位點CC基因型孕婦的血清TGF-β1水平明顯高于TT、TC基因型，TC基因型孕婦的血清TGF-β1水平明顯高于TT基因型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 GDM組TGF-β 1基因+869T/C位點三種基因型孕婦的血清TGF-β1水平比較(±s)

表3 GDM組TGF-β 1基因+869T/C位點三種基因型孕婦的血清TGF-β1水平比較(±s)

注：與TT比較，aP＜0.05；與TC比較，bP＜0.05。

基因型TGF-β1+869T/C(TT)TGF-β1+869T/C(TC)TGF-β1+869T/C(CC)F值P值例數(shù)2 20 38 TGF-β1(ng/mL)152.29±24.47 199.05±26.21a 224.61±31.85ab 9.108 0.001

2.5 不同基因型GDM孕婦的糖脂代謝指標(biāo)比較CC基因型GDM孕婦的FPG、TG水平明顯高于TT+TC基因型，HDL-C水平明顯低于TT+TC基因型，差 異 均 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義(P＜0.05)，而HbA1c、TC及LDL-C水平與TT+TC基因型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表4 不同基因型GDM孕婦糖脂代謝指標(biāo)比較(±s)

表4 不同基因型GDM孕婦糖脂代謝指標(biāo)比較(±s)

組別TT+TC CC t值P值例數(shù)22 38 FPG(mmol/L)4.78±0.57 5.15±0.53 2.535 0.014 HbA1c(%)5.35±0.31 5.29±0.46 0.544 0.589 TC(mmol/L)6.02±0.59 5.94±0.68 0.460 0.647 TG(mmol/L)2.40±0.28 2.59±0.36 2.128 0.038 HDL-C(mmol/L)1.96±0.17 1.87±0.14 2.217 0.031 LDL-C(mmol/L)3.21±0.36 3.27±0.42 0.561 0.577

3 討論

GDM是妊娠期常見的并發(fā)癥之一，可對患者健康及其生活質(zhì)量造成不利影響，此外，GDM還是影響新生兒不良結(jié)局的危險因素[8]。GDM癥狀較為隱蔽，患者缺乏典型糖尿病表現(xiàn)，從而延誤其治療時機(jī)，因此早期預(yù)測GDM的發(fā)生至關(guān)重要[9]。GDM發(fā)病與后天環(huán)境及先天遺傳因素存在密切關(guān)聯(lián)，越來越多的研究表明，遺傳易感性與GDM的發(fā)生有關(guān)[10-11]。既往報道表明，TNF-α、IL-6、NF-κΒ等細(xì)胞因子可能通過介導(dǎo)胰島素抵抗增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)GDM發(fā)生發(fā)展[12]。故探討上述細(xì)胞因子異常分泌的機(jī)制，尋找發(fā)生變化的基因位點并分析與GDM發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，有助于明確GDM發(fā)生的機(jī)制，以早期對GDM進(jìn)行篩查和預(yù)防。

TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子家族成員之一，與細(xì)胞生長、增殖和分化、組織纖維化、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移、傷口愈合、胚胎發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[13]。TGF-β1能夠刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)錄，高水平TGF-β1與細(xì)胞外基質(zhì)積聚、纖維化以及胰島素抵抗有關(guān)，而胰島素抵抗增強(qiáng)是GDM最重要的特征之一[14]。YENER等[15]研究表明，GDM患者TGF-β1水平明顯升高，高血糖和胰島素抵抗所致的炎癥反應(yīng)可能是TGF-β1表達(dá)上調(diào)的主要原因。一項TGF-β1基因+869T/C多態(tài)性與GDM的研究[16]也顯示，TGF-β1基因+869T/C位點單核苷酸多態(tài)性可能與GDM易感性有關(guān)。因此，TGF-β1基因可能在GDM發(fā)生過程中起著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1基因至少存在9個單核苷酸多態(tài)性位點，其中多項研究支持+869T/C位點單核苷酸多態(tài)性與GDM有關(guān)[17]。本文研究結(jié)果顯示，GDM組TGF-β1+869T/C位點TT基因型、T等位基因頻率明顯低于正常組，CC基因型、C等位基因頻率明顯高于正常組，兩組TC基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明TGF-β1+869T/C位點單核苷酸多態(tài)性可能與GDM發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，與張燕等[18]、陳海霞等[19]報道相符。另外，GDM組血清TGF-β1水平明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而A1級GDM患者與A2級GDM患者血清TGF-β1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，GDM組TGF-β1+869T/C位點CC基因型患者血清TGF-β1水平明顯高于TT、TC基因型患者，TC基因型患者血清TGF-β1水平明顯高于TT基因型患者，與上述疾病基因型分布結(jié)果一致，提示攜帶C等位基因可能促進(jìn)TGF-β1合成，從而調(diào)節(jié)胰島素基因轉(zhuǎn)錄以及胰島β細(xì)胞功能，最終參與GDM發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果還顯示，CC基因型GDM患者FPG、TG水平明顯高于TT+TC基因型GDM患者，HDL-C水平明顯低于TT+TC基因型GDM患者，推測+869T/C位點多態(tài)性可能與GDM患者糖脂代謝異常有關(guān)。一項關(guān)于體外GDM小鼠模型實驗發(fā)現(xiàn)，miR-335-5p可通過升高血糖水平以及增強(qiáng)胰島素抵抗，進(jìn)而抑制胰島β細(xì)胞分泌，激活GDM小鼠TGF-β1信號途徑，為臨床治療提供參考[20]。文獻(xiàn)研究也表明，TGF-β1與胰島細(xì)胞受損相關(guān)，在2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。因此，+869T/C位點多態(tài)性可能通過升高血糖水平，對胰島β細(xì)胞分泌功能造成影響，最終導(dǎo)致GDM發(fā)生[21]。

本研究創(chuàng)新之處在于，發(fā)現(xiàn)了TGF-β1基因+869T/C位點多態(tài)性與GDM發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性，并結(jié)合TGF-β1表達(dá)及糖脂代謝進(jìn)行分析，初步闡明了TGF-β1基因+869T/C位點變異影響GDM發(fā)生的可能原因。但本研究收集例數(shù)有限，后續(xù)有待收集更多樣本數(shù)以擴(kuò)大研究。此外，其他多態(tài)性位點是否協(xié)同參與GDM的發(fā)生尚不清楚，TGF-β1基因變異影響GDM發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制有待深入探究。

綜上所述，TGF-β1基因+869T/C位點多態(tài)性可能與GDM發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，TGF-β1+869T/C位點CC基因型可能通過上調(diào)TGF-β1表達(dá)參與GDM發(fā)生發(fā)展，C等位基因為其風(fēng)險因素，并可能與患者糖脂代謝異常相關(guān)，提示臨床應(yīng)盡早規(guī)范篩查和管理GDM，以利于改善妊娠結(jié)局。