劉翔宇，魏衛(wèi)兵，周賓賓

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣西 柳州 545000；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是各種原因引起的椎管內(nèi)脊髓或者馬尾神經(jīng)的不同程度損傷[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，SCI 患者一生的治療康復(fù)費(fèi)用多達(dá) 300萬美元以上，在美國每年對 SCI 患者的花費(fèi)超過40億美元[2-3]，如何促進(jìn)損傷后中樞神經(jīng)修復(fù)一直是神經(jīng)研究領(lǐng)域重點(diǎn)熱點(diǎn)課題[4]。電針對于SCI具有一定的修復(fù)作用，課題組前期研究結(jié)果顯示電針刺激可刺激缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor-1ɑ，HIF-1ɑ)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等相關(guān)因子的表達(dá)，改善脊髓損傷局部的血氧微環(huán)境，為中樞神經(jīng)軸突再生提供營養(yǎng)支持[5]。以往研究顯示蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)是環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)的主要受體，cAMP/PKA信號通路與神經(jīng)元之間的軸突連接處神經(jīng)遞質(zhì)的釋放緊密相關(guān)，在促進(jìn)軸突的再生發(fā)揮重要作用[6-7]。脊髓損傷中醫(yī)古稱“痿證”，認(rèn)為“痿證”的發(fā)生與氣血密切相關(guān)，中醫(yī)“疏通督脈氣血”“治痿獨(dú)取陽明”治則均可起到氣血疏通作用[8-10]，符合中醫(yī)“同病異治”理論，這與課題研究Nogo-A/NgR與NGF/TrkA的crostalk作用調(diào)節(jié)SCI后神經(jīng)可塑性有異曲同工之妙。本研究是為課題研究的關(guān)鍵部分，對于進(jìn)一步探討電針刺激對脊髓損傷后神經(jīng)再生修復(fù)具有重要意義,同時對于闡釋中醫(yī)“同病異治”理論的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)內(nèi)涵具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)所需60只健康成年雌性SPF(Specific pathogen Free,SPF)級SD(Sprague Dawley)大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號[SCXK桂-2014-0003]。動物均在SPF級動物標(biāo)準(zhǔn)房飼養(yǎng)(溫濕度適中)，每籠4只大鼠，可自由飲食、自由活動，飼料飲食充足。實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號：20171201),實(shí)驗(yàn)所有操作符合廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室及倫理相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器 微型血管夾、微型血管夾夾持器、有齒鑷、血管鉗、縫針及線等動物器械(購買于深圳市瑞沃德生命科技有限公司，商品批號：F23006-14);C6805-I型電針治療儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司，商品編號：30440175332);Trizol(大連寶生物有限公司，貨號9109);SYBR Green mix(南京諾維贊生物科技有限公司，貨號：Q111-01);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas公司，貨號K1622);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：Q1-15201);PMSF(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：ST506);RIPE蛋白裂解液(索萊寶科技生物有限公司，貨號：R0020);PKA抗體(美國Affiinit公司，貨號：bs-0520R)。

1.2 方法

1.2.1 SCI大鼠模型的建立 造模所有實(shí)驗(yàn)用器械均高溫消毒，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)用無菌墊。將準(zhǔn)備好的實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后，俯臥位放置于手術(shù)臺，術(shù)前備皮，以胸10節(jié)段為中心進(jìn)行備皮碘伏消毒，逐層切開皮膚、筋膜和肌肉逐漸暴露至椎板，用平板鉗慢慢咬開椎板，慢慢咬開錐弓根底部，充分暴露脊髓，用微型血管夾持器夾開微型血管夾，將血管夾打開后從脊髓下方穿過脊髓，確認(rèn)穿過脊髓后，閉合血管夾20 s夾閉脊髓，造模完畢后逐層縫合組織，完成造模。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素(20萬單位/只/d)，術(shù)后給予膀胱按摩，助排便、排尿，避免腸梗阻與尿潴留。具體造模過程見圖1。 SCI大鼠建模成功標(biāo)準(zhǔn)：①取下血管夾后脊髓被鉗夾處可觀察到脊髓充血；②大鼠清醒后下肢完全癱瘓，僅能靠上肢爬行。

圖1 造模過程

1.2.2 大鼠分組及治療干預(yù) 分組：根據(jù)建模成功標(biāo)準(zhǔn)選取造模成功的大鼠進(jìn)行編號，并使用隨機(jī)數(shù)字法分為3組：對照組、陽明胃經(jīng)組和督脈組，每組20只。每組大鼠再次按照隨機(jī)數(shù)字法根據(jù)治療后留取標(biāo)本時間點(diǎn)分為5個亞組：1周、2周、3周、4周和5周，每個亞組4只。各組于造模后3 d開始干預(yù)。干預(yù)方法：①足陽明胃經(jīng)組：取“足三里”“伏兔”穴進(jìn)行電針干預(yù)；②督脈組：取胸9、胸11棘突之間的督脈阿是穴位電針；③對照組：僅固定大鼠，不進(jìn)行電針干預(yù)。電針干預(yù)使用0.5寸一次性無菌針灸針(0.18 mm×13 mm)針刺，進(jìn)針深度約2 mm；連接電針治療儀，以強(qiáng)度12～15 mV、頻率2 Hz和疏密波進(jìn)行電針干預(yù)。穴位選取參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]進(jìn)行定位。

1.2.3 脊髓樣本取材及保存 各組大鼠于觀察時間點(diǎn)經(jīng)水合氯醛(10%)麻醉，將其仰臥置于手術(shù)臺，充分暴露心臟，用灌胃針經(jīng)左心室穿刺至主動脈后用止血鉗固定灌胃針，以0～4 ℃生理鹽水經(jīng)灌胃針灌注，剪破右心房，持續(xù)灌注直至右心房流出澄清液體、心臟及眼珠無血色。待灌注完畢后，剪取受損脊髓(以受損處為中心長約1 cm)并將樣本用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存；用于免疫組化檢測,大鼠經(jīng)生理鹽水灌注后繼續(xù)用4%多聚甲醛灌注，然后取受損脊髓置4%多聚甲醛固定，備用。

1.2.4 檢測 ①光學(xué)顯微鏡下觀察PKA蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)量：常規(guī)脫蠟脫水，烘干，4 ℃孵育過夜，隔日滴加二抗孵育20 min，DAB顯色，漂洗、脫水和封片，光學(xué)顯微鏡下觀察胞漿為棕黃色的陽性細(xì)胞表達(dá)。②(Polymerase chain reaction，PCR)：取好標(biāo)本組織，充分研磨，加入1 mL trizol浸泡，離心后取上清液，加入異丙醇混合均勻沉淀20 min后以4 ℃ 12 000 r/min離心機(jī)離心，取上清液，以乙醇洗滌沉淀再次離心后取上清液，以紫外分析測定所抽提RNA的濃度。PKA上游引物：GGCTTCCAACTCCAACGAT;下游引物：TCCAACTGGGCTGTATTCT。參考引物ACTB上游引物：GCTATGTTGCCCTAGACTTCGA;下游引物：GATGCCACAGGATTCCATACC。③Western blot(WB檢測)：取50～100 g組織進(jìn)行充分研磨，裂解、離心和取上清后備用，SDS-PAGE膠制備、上樣和電泳，封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、曝光及拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化

從圖2中可以看出，PKA蛋白陽性表達(dá)位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上，1周時對照組蛋白陽性表達(dá)最強(qiáng)；從第2周時，陽性表達(dá)逐漸降低；至第5周時，陽性表達(dá)極低；各周間表達(dá)差異明顯。整體表達(dá)督脈組和足陽明胃經(jīng)組高于對照組。3周時足陽明胃經(jīng)組整體表達(dá)高于督脈組，其余時間點(diǎn)，差異不明顯。見圖2。

注：1.對照組-1周；2.督脈組-1周；3.足陽明胃經(jīng)組-1周；4.對照組-2周；5.督脈組-2周；6.足陽明胃經(jīng)組-2周；7.對照組-3周；8.督脈組-3周；9.足陽明胃經(jīng)組-3周；10.對照組-4周；11.督脈組-4周；12.足陽明胃經(jīng)組-4周；13.對照組-5周；14.督脈組-5周；15.足陽明胃經(jīng)組-5周。

2.2 PCR檢測

PKA基因mRNA呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，4周時達(dá)到最高，5周有所降低。與對照組相比，1～4周的足陽明胃經(jīng)組的PKA基因mRNA表達(dá)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，到5周時，隨著脊髓損傷的逐漸恢復(fù)，雖然仍高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，督脈組PKA基因mRNA表達(dá)僅在1周時顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他時間點(diǎn)雖然也有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；足陽明胃經(jīng)組 PKA基因mRNA在1～5周與督脈組相比，均有一定程度的升高，除3周外，其他時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 PKA基因mRNA在各組大鼠表達(dá)量

2.3 WB檢測

PKA蛋白在脊髓損傷修復(fù)過程中起著非常重要的作用。PKA蛋白隨著時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在2周時達(dá)到高峰，2周后表達(dá)逐漸降低。與對照組比較，1～4周足陽明胃經(jīng)組的PKA蛋白表達(dá)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，到5周時，隨著脊髓損傷的逐漸恢復(fù)，雖然仍高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照組比較，督脈組PKA蛋白表達(dá)僅1～2周顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與督脈組比較，足陽明胃經(jīng)組PKA蛋白3周明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組大鼠PKA蛋白表達(dá)

注：A.對照組；B.督脈組；C.足陽明胃經(jīng)組。

3 討論

脊髓損傷發(fā)生后，機(jī)體隨之出現(xiàn)缺血、缺氧、出血、水腫及炎癥等病理變化導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂[12-14]，局部組織缺血、缺氧導(dǎo)致血管活性物質(zhì)的釋放及脊髓血液灌流的改變被視為脊髓缺血而致再灌注損傷[15-16]。脊髓損傷神經(jīng)再生一直是神經(jīng)研究領(lǐng)域重點(diǎn)熱點(diǎn)難題?？傮w來說脊髓損傷后神經(jīng)再生的困難在于：①脊髓損傷后形成一個不利于神經(jīng)再生微環(huán)境[17-18]；②損傷部位存在一些抑制神經(jīng)再生因子的髓鞘蛋白,如：髓磷脂相關(guān)糖蛋白(Myelin Associated Glycoprotein，MAG)、神經(jīng)生長抑制因子Nogo-A和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(Oligodendrocyte Myelin glycoprotein，OMgp)，抑制軸突生長[19-20]。因此，如何構(gòu)建一個良好的血氧微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)再生因子的表達(dá)是神經(jīng)研究領(lǐng)域重要課題。

3.1 PKA在神經(jīng)軸突再生的關(guān)鍵作用

cAMP-PKA信號通路是目前研究比較完善的中樞神經(jīng)軸突調(diào)控系統(tǒng)[21]，當(dāng)某信號配體與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶(Adenylatecyclase，AC)，催化ATP水解成第二信使cAMP，cAMP進(jìn)一步激活PKA[22-23]。激活的PKA具有滅活Rho的效應(yīng)，而Rho/ROCK的活化是軸突再生抑制中重要的分子事件，可以顯著降低抑制軸突再生蛋白MAG、Nogo-A及OMgp的表達(dá)水平，從而促進(jìn)軸突再生[24-25]。

3.2 中醫(yī)“同病異治”理論在神經(jīng)再生領(lǐng)域的應(yīng)用與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)內(nèi)涵

脊髓損傷中醫(yī)古稱“體惰”，屬于“痿證”范疇，中醫(yī)認(rèn)為：①脊髓局部受損，局部氣血瘀滯，導(dǎo)致血?dú)獠煌?，陽氣不達(dá)四肢,使皮肉筋脈骨節(jié)失于濡養(yǎng)，經(jīng)氣暗耗，皮肉暗萎，關(guān)節(jié)不用，故肢體萎軟、麻木和活動障礙。所以針灸治療SCI，當(dāng)以“疏通督脈氣血”作為治則。②《黃帝內(nèi)經(jīng)》提出:“治痿獨(dú)取陽明”，并成為后世治痿準(zhǔn)則，《素問·痿論》解釋了其機(jī)理：足陽明胃經(jīng)為五臟六腑之海，臟腑充盈，氣血運(yùn)行通常，則筋骨強(qiáng)、關(guān)節(jié)通利。所以《靈樞·根結(jié)》有云：治療痿證，取之陽明。針刺足陽明胃經(jīng)穴可補(bǔ)益素體陽氣，增補(bǔ)氣血之虧損，具有調(diào)理脾胃、補(bǔ)益氣血和舒筋通絡(luò)之功。針刺“督脈”“足陽明胃經(jīng)”穴治療SCI符合中醫(yī)“同病異治”理論。Nogo-A/NgR信號通路與NGF/TrkA信號通路通過共同受體P75NTR蛋白結(jié)合介導(dǎo)胞內(nèi)下游信號通路來分別發(fā)揮抑制SCI后受損脊髓局部神經(jīng)可塑性的作用以促進(jìn)SCI后受損脊髓局部神經(jīng)可塑性[26-27]，這與中醫(yī)“同病異治”理論不謀而合，本研究通過電針刺激“督脈”“足陽明胃經(jīng)”探討對SCI神經(jīng)再生的恢復(fù)機(jī)制，進(jìn)一步探討中醫(yī)“同病異治”的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)內(nèi)涵。

3.3 電針刺激“足陽明胃經(jīng)”“督脈”對于PKA表達(dá)水平的影響

電針是在傳統(tǒng)中醫(yī)針刺的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種現(xiàn)代物理療法，通過電流波對針刺穴位進(jìn)行刺激，電刺激通過膠原纖維實(shí)現(xiàn)信息及能量的傳輸，既保留了針刺作用又通過電信號傳導(dǎo)對患者的末梢直接發(fā)揮作用而促進(jìn)神經(jīng)興奮，對于神經(jīng)再生具有一定的作用[28-30]。本研究結(jié)果表明電針刺激足陽明胃經(jīng)及督脈穴均可以有效提高損傷部位陽性細(xì)胞的表達(dá)，提升PKA的mRNA及蛋白的表達(dá)，證明電針刺激足陽明胃經(jīng)及督脈穴均可顯著地提升PKA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)的軸突表達(dá)；同時，由觀察結(jié)果可知，足陽明胃經(jīng)組PKA的表達(dá)水平要稍高于督脈的表達(dá)，在第3周電針刺激足陽明胃經(jīng)的PKA表達(dá)水平顯著高于督脈及對照組。其可能機(jī)制是電針通過對受損節(jié)段軸突的電刺激，使神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，增加軸突生長前端的Ga2+內(nèi)流，從而激活第二信使鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)[31-32]，促使cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白的磷酸化形成P-CREB，激活cAMP信號通路，從而參與中樞和軸突外周敏化的形成，抑制損傷后微環(huán)境中的軸突生長抑制因子表達(dá)，改善軸突生長的狀態(tài)[33]。

綜上所述，電針刺激足陽明胃經(jīng)及督脈可以有效地促進(jìn)PKA和損傷區(qū)域陽性蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)受損神經(jīng)軸突的再生，符合中醫(yī)“同病異治”的基本理論；同時發(fā)現(xiàn)電針刺激足陽明胃經(jīng)在某個時間點(diǎn)可以顯著高于督脈，但其機(jī)制尚未能明確，有待于進(jìn)一步的研究。