劉 輝，李佩芳，孫培養(yǎng)，吳 杰

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國人口老齡化程度進(jìn)一步加深，老齡化人口比例逐年增加，導(dǎo)致阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患病人數(shù)日趨升高，死亡率逐年攀升[1-2]。AD是引起中老年人癡呆的常見原因之一，臨床表現(xiàn)包括記憶、學(xué)習(xí)能力下降、日常生活能力降低和行為異常，并伴隨各種精神神經(jīng)癥狀[3-4]。AD的病因、發(fā)病機(jī)制仍未十分明確，其兩大病理特征表現(xiàn)為以β-淀粉樣蛋白(Bate amyloid protein，Aβ)沉積而成老年斑(Senile plaques，SP),同時(shí)出現(xiàn)大量的神經(jīng)元突觸的丟失和炎癥導(dǎo)致神經(jīng)元變性[5]。目前針對(duì)AD不同發(fā)病機(jī)制和環(huán)節(jié)，可模擬AD患者SP、NFTs等主要病變的AD轉(zhuǎn)基因小鼠孕育而生，其中APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前國際較為認(rèn)可的AD動(dòng)物模型，該模型從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，可同時(shí)表達(dá)小鼠阮病毒蛋白啟動(dòng)子的突變?nèi)祟愒缋纤?DeltaE9)和人鼠淀粉樣前蛋白(APPswe)[6-7]。本研究采用針灸督脈治療APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠，并利用水迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證治療效果后，通過i TRAQ技術(shù)篩選出針灸督脈治療前后的差異蛋白，并利用Western blot驗(yàn)證差異蛋白表達(dá)水平，可為挖掘AD治療提供蛋白水平層面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠為同時(shí)轉(zhuǎn)入淀粉樣前體蛋白基因(APP)K670N突變基因和早老蛋白1基因(PS1)dE9突變基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，7月齡，SPF級(jí)，購于邳州市東方養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)SCXK(蘇)2017-0003，飼養(yǎng)于江西中洪博元生物技術(shù)有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作及飼養(yǎng)均符合江西省動(dòng)物管理飼養(yǎng)條例，遵循人道原則。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室1周適應(yīng)環(huán)境，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，自由進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)時(shí)保持室內(nèi)安靜。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.2.1 試劑 iTRAQ試劑盒(貨號(hào)：4390812；廠家：AB Sciex)；乙腈ANC(貨號(hào)：A998-4；廠家：美國Fisher)；甲酸(formic acid)(貨號(hào)：64186；廠家：美國Thermo)；胰酶(貨號(hào)：V5280；廠家：Promega)；緩沖液試劑盒(貨號(hào)：4381664；廠家：AB Sciex)；BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(貨號(hào)：CW0014S；廠家：康為世紀(jì))；封閉專用脫脂奶粉(貨號(hào)：P1622；廠家：北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)(貨號(hào)：A8020；廠家：索萊寶)；超敏發(fā)光液(貨號(hào)：RJ239676；廠家：賽默飛)；內(nèi)參一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(貨號(hào)：TA-08；廠家：中杉金橋；稀釋比∶1/2 000)；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)(貨號(hào)：ZB-2305；廠家：中杉金橋；稀釋比∶1/2 000)；目的一抗：Rabbit Anti VGluT1(SLC17A7) (貨號(hào)：DF13657；廠家：Affinity；稀釋比∶1/500)；目的一抗：Rabbit Anti GLAST(SLC3A1)(貨號(hào)：20785-1-ap；廠家：proteintech；稀釋比∶1/500)；目的一抗：Rabbit Anti FAM98A(貨號(hào)：NBP2-38291；NOVUS；稀釋比∶1/500)；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號(hào)：ZB-2301；中杉金橋；稀釋比∶1/2 000)； Marker(貨號(hào)：#26617；廠家：美國Thermo)。

1.2.2 儀器 Morris水迷宮(型號(hào)：JLBehv-MWMG；廠家：上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；自發(fā)活動(dòng)系統(tǒng)(型號(hào)：JLBehv-LAG-4；廠家：上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；針灸針(型號(hào)：20010020；廠家：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；質(zhì)譜儀(型號(hào)：Thermo Scientific Q Exactive ；廠家：美國Thermo)；超聲破碎儀(型號(hào)：LTD JY96-ⅡN；廠家：寧波新芝)；冷凍離心機(jī)(型號(hào)：H2050R；廠家：湘儀)；酶標(biāo)儀(型號(hào)：ELx800；廠家：美國BioTek)；液相色譜儀(型號(hào)：Dionex Ultimate 3000 RSLCnano；廠家：美國Thermo)；色譜柱(型號(hào)：75 μm i.d. x150 mm, packed with Acclaim PepMap RSLC C18,2 μm,100?；廠家：nanoViper)；PVDF膜(型號(hào)：IPVH00010；廠家：Millipore)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)：WD-2102B；廠家：北京市六一儀器廠)；蛋白垂直電泳儀(型號(hào)：DYY-6C；廠家：北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[型號(hào)：Chemi DocTM XRS+；廠家：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.3 動(dòng)物分組

將8只7月齡APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因雄性幼鼠隨機(jī)分為模型組和針刺組，每組4只。

1.4 治療方法

針刺組的4只APPswe/PS1ΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]每只每天在清醒狀態(tài)下針灸百會(huì)、風(fēng)府、神庭與水溝穴1次，行捻轉(zhuǎn)手法，采用0.20 mm×15 mm針灸針進(jìn)針深度2～3 mm，留針20 min，持續(xù)28 d。模型組不做任何治療，與針刺組平行評(píng)估。

1.5 水迷宮測(cè)試

訓(xùn)練時(shí)段：第1～5天，逃生平臺(tái)未設(shè)置物品，經(jīng)隨機(jī)方式確定其中4個(gè)方向，控制動(dòng)物面向缸壁，再置于水中，相鄰兩次入水的間隔期為15 min，正式測(cè)試，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確記錄；空間探索：始自第6天，將逃生平臺(tái)撤除，再任選1個(gè)方向，把動(dòng)物直接置入水內(nèi)，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄。

1.6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)備儀器：將自發(fā)活動(dòng)箱攝像頭、燈光打開，連接電腦，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)。自發(fā)活動(dòng)：將適應(yīng)房間2 h的小鼠放入自發(fā)活動(dòng)箱中，軟件記錄動(dòng)物其活動(dòng)30 min。

1.7 i TRAQ技術(shù)篩選APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠和針刺組之間的差異蛋白。

1.7.1 樣品信息 i TRAQ技術(shù)所用到的樣本信息見表1。

表1 樣本標(biāo)記信息

1.7.2 蛋白質(zhì)提取 在1 mL預(yù)冷的RIPA中加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和10 μL MSF混勻，冰上保存數(shù)分鐘后待用。取兩組海馬組織樣品，加入液氮研磨至粉末，加入0.8 mL前述配好的預(yù)冷RIPA，應(yīng)用超聲破碎儀破碎，13 000 g/min離心20 min，吸出上清液。滴加4倍體積-20 °的冰丙酮，-20 °沉淀120 min,1 200 g, 4 ℃，離心30 min。棄上清，蛋白沉淀加入300 μL RIPA，超聲5 min助溶，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，取上清至新離心管，測(cè)定其吸光值，并按照標(biāo)準(zhǔn)的曲線計(jì)算每份樣品的蛋白濃度。

1.7.3 蛋白酶切 待完成蛋白定量，將0.1 mg蛋白溶液移至離心管內(nèi)，再添加4 μL的TCEP Reducing Reagent，接著于37 ℃時(shí)，進(jìn)行60 min反應(yīng)；添加2 μL的MMTS Cysteine-Blocking Reagent，再于室溫下進(jìn)行0.5 h暗反應(yīng)；接著把已結(jié)束還原烷基化處理的蛋白溶液移至超濾管(10 Kd)內(nèi)，在12 000離心場(chǎng)力下作用20 min，接著將收集管最下端的溶液清理掉；之后添加0.1 mL酸堿度為8.5的尿素(8 M)，之后于12 000離心場(chǎng)力下作用20 min，結(jié)束后將收集管最下端溶液倒掉，以上操作進(jìn)行兩遍重復(fù)；添加0.1 mL的Dissolution Buffer，于12 000離心場(chǎng)力下作用20 min，結(jié)束后將收集管最下端溶液倒掉，并進(jìn)行3遍重復(fù)；之后準(zhǔn)備1支新收集管，通過Dissolution Buffer定容至0.05 mL，根據(jù)蛋白與胰蛋白酶(Trypsin)50∶1的質(zhì)量比，添加一定量的Trypsin，于37 ℃下進(jìn)行一整夜作用；第2天，添加Trypsin(蛋白與Trypsin的質(zhì)量比為100∶1)，于37 ℃下作用4 h，再于12 000離心場(chǎng)力下作用20 min，結(jié)束后收集管最下端為行酶解消化處理的肽段溶液；將0.05 mL的Dissolution Buffer添加至超濾管內(nèi)，于12 000 rpm離心場(chǎng)力下作用20 min，和上步合并，對(duì)管底部溶液進(jìn)行收集，合計(jì)獲得已酶解樣品0.1 mL。

1.7.4 i TRAQ試劑標(biāo)記 自冰箱內(nèi)將8標(biāo)的i TRAQ試劑盒取出，再平衡至室溫水平，經(jīng)離心處理，使i TRAQ分布于管底；各管i TRAQ試劑皆添加0.15 mL異丙醇(IPA)，行渦旋振蕩處理，離心至最下端；將0.05 mL樣品(0.05 mg酶解產(chǎn)物)移入新離心管內(nèi)；向樣品內(nèi)加入i TRAQ試劑，行渦旋振蕩處理，離心至最下端，于室溫中作用120 min；添加0.1 mL水，使反應(yīng)結(jié)束；混合標(biāo)記后的樣品，行渦旋振蕩處理，離心到最下端；接著行真空離心干燥處理；把已抽干樣品存放于冷凍環(huán)境中，備用。

1.7.5 第一維高pH-RP液相分離 先通過A相(95%)、B相(5%)平衡柱子0.5 h；再通過0.2 mL A相復(fù)溶已標(biāo)記、抽干的混合多肽；先取0.1 mL進(jìn)樣，再實(shí)施梯度洗脫處理，速率為0.2 mL/min：B相自5%至37%，最后5 min內(nèi)B相占比增到95%，同時(shí)保持5 min，接著洗脫掉全部多肽，用時(shí)合計(jì)85 min。每50 s接1次，單次85 min，如此進(jìn)行循環(huán)接樣；最后合計(jì)收取48個(gè)組分，統(tǒng)一為13組分，先行真空干燥處理，再實(shí)施第2維的LC-MS分析。見表2。

表2 流動(dòng)相參數(shù)說明

1.7.6 第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS 通過樣品溶解液(乙腈、甲酸各5%、0.1%)對(duì)肽段進(jìn)行溶解，先行徹底振蕩渦旋處理，于4 ℃溫度、13 500 r/min速度下，實(shí)施20 min離心處理，上清移入上樣管內(nèi)，開展質(zhì)譜鑒定。參數(shù)設(shè)置情況詳見表3、4。已分離肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀接受在線測(cè)定。參數(shù)設(shè)置情況詳見表5。

表3 液相色譜設(shè)置參數(shù)

表4 流動(dòng)相參數(shù)

表5 質(zhì)譜設(shè)置參數(shù)

1.7.7 數(shù)據(jù)庫檢索 本項(xiàng)目Proteome Discoverer 2.2(Thermo fisher)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，采用PEAKS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。具體檢索參數(shù)見表6。

表6 鑒定參數(shù)

1.8 Western blot驗(yàn)證差異蛋白

取APPswe/PS1△E9轉(zhuǎn)基因小鼠模型組和針刺組海馬組織液氮上研磨后添加裂解液，再移至冰上接受0.5 h裂解處理，接著于10 000 rpm/min 離心場(chǎng)力、4 ℃溫度下作用10 min，留存上清，即為總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒所示，對(duì)蛋白濃度展開測(cè)定。蛋白變性，上樣，接著實(shí)施60～120 min的十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)凝膠電泳處理，再濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。于4 ℃下移至一抗溶液內(nèi)，進(jìn)行一整夜孵育；再移至二抗溶液內(nèi)，于室溫下進(jìn)行1～2 h孵育。將ECL曝光液滴于膜上，借助凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。最后借助軟件Image J對(duì)各條帶灰度值展開分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 針灸督脈穴位治療APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)檢測(cè)

2.1.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型組比較，針刺組小鼠第3、4天潛伏期縮短;與模型組比較，針刺組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增多。見圖1。

圖1 定位航線實(shí)驗(yàn)結(jié)果和定位航線穿越平臺(tái)結(jié)果

2.1.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)針灸督脈治療對(duì)APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)能力影響 APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠模型組在曠場(chǎng)中的總運(yùn)動(dòng)距離為(6 252.11±2 144.73)mm，針刺組為(6 952.96±4 794.97)mm,比模型組總運(yùn)動(dòng)距離增加;模型組中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離為(34 757.14±5 364.25)mm，針刺組為(35 437.31±10 968.10)mm，比模型組中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離增加。見圖2。

圖2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 各組小鼠海馬的差異蛋白表達(dá)

與模型組比較，針刺組差異蛋白上調(diào)23個(gè)、下調(diào)61個(gè)。

2.2.1 差異指標(biāo)篩選 此項(xiàng)研究的過濾標(biāo)準(zhǔn)為：同時(shí)滿足fold change≠1.2倍、P值在0.05以下的條件。針對(duì)蛋白質(zhì)通過變異倍數(shù)分析(FC Analysis)以及T檢驗(yàn)開展單變量統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)完成火山圖的繪制。經(jīng)由圖3可知，樣本間代謝物存在顯著性變化。

注：紅色、藍(lán)色分別代表顯著上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)(FC在1.2以上, P在0.05以下)。

2.2.2 差異指標(biāo)聚類分析 對(duì)于各組樣本，通過定性所得顯著性差異代謝物的表達(dá)水平實(shí)施層次聚類，經(jīng)由圖4能夠發(fā)現(xiàn)，模型組、針刺組樣本可經(jīng)由聚類見于同一簇內(nèi)。

圖4 蛋白質(zhì)聚類分析圖

2.3 生物信息學(xué)分析

本研究的蛋白差異分析主要采用GO和KEGG富集分析，方便更全面、更系統(tǒng)地掌握細(xì)胞的生物學(xué)行為、藥物作用機(jī)制、性狀或病機(jī)等信息。

2.3.1 Gene Ontology(GO)富集分析 本研究采用WebGestalt軟件對(duì)篩選所得差異蛋白質(zhì)實(shí)施GO富集分析。經(jīng)由差異蛋白的GO分析，對(duì)比于模型組，針刺組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)有52個(gè)，主要涉及神經(jīng)肌肉控制平衡過程、藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和酸性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等信號(hào)途徑，圖5為展示的前20個(gè)差異蛋白。

注：橫坐標(biāo)表達(dá)的是富集到的蛋白質(zhì)數(shù)量，縱坐標(biāo)表示富集到的主要通路，P-value是富集分析的顯著性指標(biāo)，P-value越小表示其通路在特定的生物學(xué)處理下所受的影響越大，由超幾何分布計(jì)算。

2.3.2 KEGG富集分析 本研究采用WebGestalt軟件和KEGG數(shù)據(jù)對(duì)篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行富集分析，通過差異蛋白的KEGG分析，與模型組比較，針刺組表達(dá)差異的蛋白質(zhì)有52個(gè)，主要有瘧疾、糖尿病與甲狀腺癌等疾病，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中的脂肪分解、cGMP-PKG等信號(hào)通路，圖6為展示的前20個(gè)差異蛋白。

注：橫、縱坐標(biāo)分別代表富集所得蛋白質(zhì)數(shù)量、主要通路，P值代表富集分析的顯著性水平，此項(xiàng)指標(biāo)愈小說明其通路于特定的生物學(xué)干預(yù)下所受的影響愈大，由超幾何分布計(jì)算。

2.3.3 Western blot檢測(cè)篩選出的差異蛋白表達(dá)情況 如圖7和表7所示為利用Western blot驗(yàn)證i TRAQ篩選出的FAM98A、SLC3A1及SLC17A7共3個(gè)差異蛋白的結(jié)果圖，由圖、表中可知，與模型組比較，F(xiàn)AM98A、SLC3A1及SLC17A7在針刺督脈治療后的模型鼠的海馬組織中表達(dá)顯著上升。

注：與模型組比較，*P<0.05。

表7 Western blot檢測(cè)篩選出的差異蛋白表達(dá)情況

3 討論

近年來，AD患病導(dǎo)致的人口死亡率顯著上升，對(duì)AD早發(fā)現(xiàn)早治療是極必要的。對(duì)AD的治療除了主要的乙酰膽堿酯酶抑制劑和美金剛外，多項(xiàng)臨床研究及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示針刺對(duì)AD模型的行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)能產(chǎn)生有益的影響[9-11]。本研究采用針灸督脈治療 AD相關(guān)研究中常見的動(dòng)物模型APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠，通過水迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察治療效果。相關(guān)研究表明[12-13]電針能提高AD模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，朱書秀等[14]認(rèn)為電針刺激后抑制了模型鼠腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，同時(shí)減少神經(jīng)毒性因子的釋放，從而達(dá)到提高AD模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的效果。

AD屬于中醫(yī)“呆病”“健忘”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病位在腦，與心、肝、脾和腎功能失調(diào)關(guān)系密切。歷代醫(yī)家素有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說。《難經(jīng)·二十八難》記載:“督脈者，……上至風(fēng)府，入屬于腦?！蹦X是元神之府，督脈的1條支脈有“上貫心”，心藏神，心神與腦神共司精神、情志活動(dòng)。督脈還有1條支脈“絡(luò)腎”，腎藏精，精充可化神。《備急千金要方》云:“煩悶恍惚，喜怒無常……次灸百會(huì)一處七壯?！薄夺樉拇蟪伞费园贂?huì)治“驚悸健忘，忘前失后，心神恍惚，無心力……”，《銅人腧穴針灸圖經(jīng)》亦曰:“神道主健忘驚悸。”針灸督脈治療范圍的描述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)AD的某些癥狀十分相似，表明針刺督脈對(duì)AD有一定的治療作用,是在針刺督脈經(jīng)穴百會(huì)、神庭、風(fēng)府與水溝為主防治中風(fēng)病的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以針刺督脈達(dá)到通調(diào)神志功用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，以百會(huì)、水溝、神庭與大椎等穴位為主穴，運(yùn)用該針法治療PSD療效顯著，但臨床療效機(jī)制尚不清楚。

現(xiàn)今借助神經(jīng)影像學(xué)可以直觀了解病人海馬的病變狀況，但進(jìn)行神經(jīng)影像檢查時(shí)，檢查對(duì)象需要長(zhǎng)期保持固定姿勢(shì)，較難操作，也存在價(jià)格昂貴的弊端。本研究以模型組和針刺組小鼠為研究對(duì)象，借助適宜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，針對(duì)此類方法的優(yōu)劣勢(shì)與適用性，在實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合應(yīng)用，篩選出AD治療的候選蛋白，并通過Western blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，從而從候選生物標(biāo)志物中鑒定出可信的治療靶點(diǎn)。

本研究以模型組和針刺組海馬組織為研究對(duì)象，運(yùn)用i TRAQ和蛋白芯片技術(shù)，研究治療AD的蛋白靶點(diǎn)，從眾多差異蛋白中挑選FAM98A、SLC3A1及SLC17A7共3個(gè)與疾病、尿酸代謝和激素釋放相關(guān)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。目前關(guān)于FAM98A蛋白生物學(xué)功能的報(bào)道還很少，有研究顯示[15]FAM98A在人體內(nèi)的腦組織和睪丸組織中高表達(dá)，在卵巢癌組織中作為一種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的底物發(fā)揮作用。研究證實(shí)[16]下調(diào)FAM98A蛋白的表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲等能力顯著下降，同時(shí)相關(guān)的蛋白水平表達(dá)發(fā)生改變，提示FAM98A蛋白表達(dá)參與人體內(nèi)的腦組織疾病發(fā)生。堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因SLC3A1對(duì)于機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵性作用，其負(fù)責(zé)編碼的rBAT蛋白為動(dòng)物堿性氨基酸(AA)轉(zhuǎn)運(yùn)體系的關(guān)鍵構(gòu)成單元。研究結(jié)果表明[17]SLC3A1基因的突變會(huì)引起腎小管減少對(duì)胱氨酸等多種氨基酸的重吸收，嚴(yán)重影響人體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，調(diào)查顯示大多數(shù)阿爾茨海默癥患者為營養(yǎng)缺乏的老年人[18]，提示SLC3A1可能參與AD鼠的營養(yǎng)攝取。研究表明[19]，SLC17A7編碼cl-依賴性囊泡性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體存在于大腦和內(nèi)分泌組織中，編碼的蛋白參與跨膜囊性谷氨酸，在激素的釋放中起到一定的作用，提示SLC17A7可能參與AD鼠大腦中的激素分泌。

綜上所述，本研究通過針刺督脈腧穴治療AD模型小鼠后，F(xiàn)AM98A、SLC3A1及SLC17A7表達(dá)顯著上升，提示FAM98A、SLC3A1及SLC17A7可作為AD治療的靶位點(diǎn)。為了進(jìn)一步確認(rèn)這些預(yù)測(cè)靶點(diǎn)是否參與AD小鼠的治療過程，在后續(xù)研究中，可通過上調(diào)或下調(diào)AD小鼠內(nèi)FAM98A、SLC3A1及SLC17A7的表達(dá)并運(yùn)用行為學(xué)對(duì)小鼠狀態(tài)進(jìn)行治療評(píng)價(jià)。