提取工藝對(duì)檸檬多糖得率及理化特征的影響

高 銘，陳瑞戰(zhàn)，吳 靜，白春龍，孫 惠，李冬雪，吳文靜

(長(zhǎng)春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130032)

多糖是由單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜和植物、微生物的細(xì)胞壁中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，常與蛋白質(zhì)結(jié)合參與細(xì)胞的調(diào)節(jié)和分化，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌[1]、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂[2]、抗病毒[3]、抗疲勞[4]、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[5]，幾乎沒(méi)有毒副作用，這使得它具有非常大的潛力，應(yīng)用于藥品、功能食品、化妝品、飲料等領(lǐng)域。但多糖常與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、花青素等化合物結(jié)合，導(dǎo)致提取效率低、分離純化難，且易引起結(jié)構(gòu)變化[6]。此外，不同的提取技術(shù)和工藝參數(shù)不僅會(huì)影響多糖的得率，還會(huì)引起多糖理化性質(zhì)的改變和生物活性的降低。因此，比較不同提取工藝對(duì)檸檬多糖(LPs)得率、理化性質(zhì)的影響對(duì)該多糖的開發(fā)利用具有極為重要的意義。

檸檬(CitruslimonL.)為雙子葉蕓香科柑橘屬常綠小喬木植物的果實(shí)，是藥食兩用水果。檸檬中富含果膠多糖、檸檬酸、橙皮苷、維生素、花青素等活性成分，具有抗氧化、抗癌[7]、抗炎[8]、抗增殖、抗菌、抗糖尿病和抗病毒等活性，廣泛應(yīng)用于冰糕、飲料、果醬、果凍、糖果等生產(chǎn)[9]。

本研究采用六種不同工藝提取LPs，并通過(guò)DEAE-Sepharose CL-6B陰離子交換和Sephadex G-150凝膠柱層析分離和純化多糖組分。利用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、紫外可見光譜(UV)等比較多糖的理化性質(zhì)，為該多糖在醫(yī)藥、功能食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬產(chǎn)自中國(guó)四川省資陽(yáng)市安岳縣，經(jīng)過(guò)60℃減壓干燥，粉碎，石油醚回流脫脂和脫色，乙醇(φ=95%)回流去除小分子，風(fēng)干得到預(yù)處理樣品。

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本愛郎儀器有限公司)；X1R高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus Multifuge)；FD-1E-50型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 多糖的提取及分離

LPs的提取、分離、純化工藝流程如圖1所示。

圖1 LPs的提取、分離、純化工藝流程

1.2.1 熱回流提取(HRE)

準(zhǔn)確稱取2 g預(yù)處理樣品，加入180 mL蒸餾水，在80℃的條件下提取2.5 h。提取物在轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心20 min，上清液于50℃下減壓濃縮至原體積的1/5，加入4倍體積的95%乙醇，在4℃條件下醇沉12 h；混合物在5 000 r/min離心15 min，收集沉淀用蒸餾水溶解，Sevage法脫蛋白，用分子量3 500 Da的透析袋流水透析36 h，冷凍干燥得到HRE多糖(LPHR)。

1.2.2 超聲輔助提取(UAE)

采用SL-2010N超聲裝置(南京順流儀器有限公司)，在頻率為20 kHz、溫度45℃、蒸餾水與預(yù)處理樣品比為80 mL/g、超聲功率675 W、超聲時(shí)間40 min條件下超聲提取。提取后離心、濃縮、醇沉、脫蛋白和透析步驟與HRE相同，凍干得到UAE多糖(LPUA)。

1.2.3 微波輔助提取(MAE)

采用MAS-I 微波提取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)，按提取溫度70℃、液料比60 mL/g，微波功率200 W、提取50 min條件進(jìn)行微波提取。提取混合物后處理方法與HRE相同，凍干得到MAE多糖(LPMA)。

1.2.4 復(fù)合酶輔助提取(EAE)

本項(xiàng)目使用的混凝土平倉(cāng)推土機(jī)有兩類，分別為D31p-18A和D65P-8，二者均產(chǎn)自日本；所使用的倉(cāng)面碾壓設(shè)備有三類，包括BW200、BW202AD和BW75S，三者均產(chǎn)自德國(guó)。檢測(cè)設(shè)備有DN-40中子儀和TS-600VC值測(cè)量?jī)x。

干燥的預(yù)處理樣品2 g，加入140 mL復(fù)合酶溶液(果膠酶(w=0.2%)、纖維素酶(w=0.2%)、木瓜蛋白酶(w=0.1%)，pH為4.5)、25℃條件下浸泡12 h，然后在60℃下復(fù)合酶輔助提取2 h。復(fù)合酶滅活后(100℃、滅活10 min)，提取混合物后處理方法與HRE相同，凍干得到EAE多糖(LPEA)。

1.2.5 復(fù)合酶輔助超聲提取(UEE)

干燥的預(yù)處理樣品2 g，加入140 mL復(fù)合酶溶液(w=0.5%)(果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶的活性比為2∶2∶1，pH為4.5)，于25℃浸泡12 h。隨后，使用SL-2010N超聲裝置，在超聲功率375 W、溫度40℃、超聲時(shí)間40 min、頻率20 kHz進(jìn)行提取。提取混合物在100℃下滅活復(fù)合酶10 min，得到的溶液處理方法與HRE相同，真空冷凍干燥得到UEE多糖(LPUE)。

1.2.6 復(fù)合酶輔助微波提取(MEE)

干燥的預(yù)處理樣品2 g，加入140 mL復(fù)合酶溶液(w=0.5%)(果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶的活性比為2∶2∶1，pH為4.5)，在25℃下浸泡12 h。然后使用MAS-I微波提取儀(微波功率400 W、溫度50℃、提取時(shí)間40 min)進(jìn)行復(fù)合酶輔助微波提取。提取混合物酶滅活后，提取液與HRE處理相同，冷凍干燥得到MEE多糖(LPME)。

1.3 LPs的分離純化

將50 mg LPUE和LPME溶于50 mL蒸餾水中，過(guò)0.45 μm濾膜。濾液加入DEAE-Sepharose CL-6B陰離子交換柱(2.5 cm×50 cm)，用 0、0.5、1 mol/L NaCl梯度洗脫，流速0.5 mL/min。洗脫液用全自動(dòng)收集器(5 mL/管)收集。用苯酚-硫酸法在490 nm處測(cè)定各管中吸光度值，繪制出吸光度值與管數(shù)的洗脫曲線。將每個(gè)主要峰的洗脫液匯集、透析、濃縮后上Sephadex G-150柱(1.5 cm×50 cm)進(jìn)一步純化，洗脫液為0.1 mol/L NH4HCO3、流速0.6 mL/min，收集洗脫液，測(cè)定吸光度值，繪制洗脫曲線，合并主要峰洗脫液、使用透析袋(8 000～14 000 Da)透析、凍干，得到四個(gè)純化多糖組分(LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2)。

1.4 LPs的理化特征分析

1.4.1 LPs的化學(xué)成分分析

采用苯酚-硫酸法(Glc為標(biāo)準(zhǔn)品)[10]、考馬斯亮藍(lán)法(牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品)[11]、硫酸-卡唑法(葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品)[12]、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法(蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品)[13]、福林-喬卡爾法(沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品)[14]，測(cè)定LPs中糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸、總黃酮和多酚含量。

將干樣品(1 mg)研磨并與干KBr(100 mg)混合，壓成薄膜，使用iS50 FT-IR分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)檢測(cè)。樣品(1 mg/mL)的紫外光譜用Cary 60紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法對(duì)LPs得率的影響

六種不同的提取工藝提取LPs，各工藝的得率和工藝參數(shù)見表1，LPs的得率按HRE、MAE、UAE、EAE、MEE、UEE的順序增高。HRE是最傳統(tǒng)的提取方法，主要依靠較高的溫度來(lái)提高LPs的溶解和傳質(zhì)速率、增加溶劑的擴(kuò)散速率，從而達(dá)到提高LPs得率的目的。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在液料比為90 mL/g、提取時(shí)間150 min、提取溫度80℃的條件下，LPHR的得率為(4.20±1.18)%。

EAE是一種新型有效的提取技術(shù)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞壁的解聚， 提高生物活性化合物的可提取性[15]。但由于天然植物材料的獨(dú)特性質(zhì)，適宜的水解酶的種類和配比各不相同，需要優(yōu)化考察。首先通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定復(fù)合酶的適宜配比，纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的活性比為10∶30∶3。在該復(fù)合酶配比和表1給出的最佳EAE條件下，LPEA的提取率為(12.70±1.05)%，是LPHR的3.02倍，表明EAE能夠有效提高多糖得率[16]。

表1 不同提取工藝和參數(shù)對(duì)LPs的影響

LPUA的得率和UAE條件見表1。UAE提取的LPUA得率(8.82±1.04)%是HRE的2.1倍。這一結(jié)果證明，UAE在最佳條件下可以顯著提高LPUA的得率，這主要是由于超聲波可以導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，增加多糖的溶解和傳質(zhì)，從而提高多糖得率[17]。然而，當(dāng)這些參數(shù)超過(guò)表1給出的范圍時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致多糖降解，從而導(dǎo)致得率下降。這種現(xiàn)象可能是由于糖苷鍵斷裂，導(dǎo)致多糖的物理化學(xué)和功能特性發(fā)生一系列變化，證明UAE也是一種有用的多糖提取和修飾方法，最佳的工藝參數(shù)需要優(yōu)化。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定的MAE工藝條件為液料比60 mL/g、提取時(shí)間50 min、提取溫度70℃、微波功率200 W，可使LPMA得率達(dá)到(6.27±1.16)%。在此條件下，LPMA的得率比LPHR提高了49.29%，其原因可能是微波輻射導(dǎo)致植物細(xì)胞壁基質(zhì)疏松甚至破裂，增加了溶劑的滲透擴(kuò)散速度，促進(jìn)了多糖的溶解擴(kuò)散，提高了LPMA得率[18]。

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討復(fù)合酶與UEE和MEE的協(xié)同作用。在復(fù)合酶(w=0.5%)(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的活性比為10∶30∶3)、復(fù)合酶溶液與原料比為70 mL/g、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度40℃、超聲功率375 W時(shí)，LPUE的提取率最高(14.41±1.21)%。復(fù)合酶(w=0.5%)(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的活性比為10∶30∶3)、復(fù)合酶溶液與原料比70 mL/g、微波時(shí)間40 min、提取溫度50℃、微波功率300 W時(shí)，LPME的提取率最高(13.46±1.53)%。與單一EAE、UAE和MAE相比，UEE和MEE均能提高產(chǎn)率，說(shuō)明復(fù)合酶與超聲、微波組合具有顯著的協(xié)同作用。這可能是由于超聲波和微波破壞細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)多糖的釋放，并參與調(diào)節(jié)復(fù)合酶活性，使多糖得率大幅提高，這與LARSEN等[19]報(bào)道的在某些實(shí)驗(yàn)條件下，超聲和酶的聯(lián)合應(yīng)用可以增加植物多糖的提取并促進(jìn)聚合物的降解的結(jié)果一致，說(shuō)明超聲、微波和復(fù)合酶聯(lián)合使用不僅能提高多糖的提取率，還能調(diào)節(jié)多糖的理化特性和功能特性，是高效提取和修飾植物多糖的有效方法。

2.2 LPUE和LPME的純化

提取后，采用DEAE-Sepharose CL-6B色譜柱對(duì)LPUE和LPME進(jìn)行分離純化。如圖2(a)所示，用H2O和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫分離出兩個(gè)組分，分別命名為L(zhǎng)PUE-1s和LPUE-2s。LPME的洗脫曲線如圖2(b)所示，得到兩個(gè)主要組分(LPME-1s和LPME-2s)，其中LPME-2s為主要組分，表明LPME中包含兩種多糖。上述四個(gè)組分上Sephadex G-150凝膠柱進(jìn)一步純化，得到LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2四個(gè)純化多糖，其得率分別為(23.14±1.58)%、(14.70±1.08)%、(22.14±11.67)%和(23.25±2.01)%(表2)。

(a) (b)圖2 LPUE、LPME在CL-6B凝膠柱上的洗脫曲線

2.3 LPs的理化性質(zhì)

不同的提取工藝可能導(dǎo)致分子鏈水解斷裂和分子間氫鍵斷裂，從而改變多糖的理化性質(zhì)和生物活性[20]。LPs的理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果見表2，表明不同提取工藝得到的粗多糖理化性質(zhì)存在明顯差異。LPHR、LPEA、LPUA、LPUE、LPMA和LPME的PC分別為(2.32±0.22)%、(1.91±0.16)%、(2.24±0.20)%、(2.29±0.78)%、(2.01±0.15)%和(1.88±0.16)%，說(shuō)明這些LPs均含有一定量的蛋白質(zhì)。HRE的PC最高，MEE最低，LPHR的PC值比LPME提高了23.4%。與此同時(shí)，LPEA的PC值低于其他四種樣品，說(shuō)明復(fù)合酶水解比其他方法能更有效降低提取多糖的PC值，這可能是由于蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中的降解，而微波通過(guò)微波場(chǎng)與偶極子分子和離子的分子相互作用，可以迅速提高組織細(xì)胞內(nèi)部的溫度和壓力，使組織破裂，溶解內(nèi)部成分。在這一過(guò)程中，還可能引起生物大分子(如蛋白質(zhì)和多糖)的降解，這些綜合效應(yīng)可能導(dǎo)致LPME的PC降低。LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2中PC含量分別為(1.43±0.09)% 、(1.06±0.05)%、(1.19±0.07)%和(0.93±0.04)%，說(shuō)明四種純化多糖中也含有一定量的蛋白質(zhì)，但其含量明顯低于其粗多糖。這一結(jié)果表明，在Sevage法脫蛋白過(guò)程中，純化多糖中部分游離蛋白被去除，而剩余的蛋白質(zhì)可能通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵與多糖形成穩(wěn)定的復(fù)合物[21]。

表2 不同工藝提取檸檬多糖的理化性質(zhì)

LPs的UAC按照LPME(31.89±2.21)%>LPUE(27.37±2.08)%>LPEA(25.88±1.06)%>LPMA(19.66±1.14)%>LPHR(19.16±1.22)%>LPUA(18.71±1.04)%的順序遞減，說(shuō)明不同提取方法提取的UAC存在顯著差異。在所有提取的LPs中，LPME的UAC最高，證明微波和復(fù)合酶的協(xié)同作用可以提高多糖中的UAC，這可能是因?yàn)槲⒉ㄝ椛鋾?huì)增加偶極子旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致熱量快速產(chǎn)生，使細(xì)胞破裂，誘導(dǎo)聚半乳糖酸鏈水解，UAC增加。同時(shí)LPUE和LPME的純化多糖的LPUE-1和LPME-1明顯高于其粗多糖，這可能是純化后多糖的純度增加以及多糖結(jié)構(gòu)差異所致；同樣，MEE提取的純化多糖的UAC略高于UEE提取的純化多糖，這與兩種提取方法得到的粗多糖一致。

LPs中的TFC和TPC分別在(0.45±0.03)%～(1.46±0.13)%和(0.14±0.01)%～(0.42±0.04)%，表明不同提取方法的LPs及純化多糖均含有一定數(shù)量的黃酮類和多酚類物質(zhì)。LPME的TFC和TPC最高，分別為(1.46±0.13)%和(0.42±0.04)%，說(shuō)明MEE可有效增加LPME的TFC和TPC。這可能是由于在微波萃取過(guò)程中，微波萃取器內(nèi)腔溫度和壓力的迅速升高破壞了物質(zhì)細(xì)胞，將內(nèi)部的黃酮和多酚釋放到提取溶劑中，提高了LPs的TFC和TPC。

但純化多糖中的類黃酮和多酚含量明顯低于粗多糖，這可能與多糖在乙醇沉淀、透析等純化過(guò)程中游離類黃酮和多酚被去除有關(guān)。特別是LPUE-1和LPUE-2中較低的TPC也可能是由于高強(qiáng)度超聲對(duì)多酚結(jié)構(gòu)的破壞。但從表2可以看出，四種純化多糖中仍含有一定數(shù)量的類黃酮和多酚，這可能是由于這些化合物與多糖形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，這與報(bào)道的結(jié)果[21]一致。上述結(jié)果表明，選擇合適的提取方法和工藝參數(shù)不僅可以提高多糖的得率，而且還可以改善其理化性質(zhì)，從而導(dǎo)致其功能特性的變化。

2.4 FT-IR光譜分析

傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)是表征多糖中有機(jī)基團(tuán)的有力工具。FT-IR光譜(圖3)顯示，四種純化多糖均有強(qiáng)而寬的吸收峰，這是由于羧酸的游離/鍵合羥基的分子內(nèi)或分子間氫鍵的O—H伸縮振動(dòng)，表明 LPUE和LPME中存在—OH[22]。四種多糖均未發(fā)現(xiàn)新的結(jié)構(gòu)峰，表明在分離純化過(guò)程中未產(chǎn)生新的官能團(tuán)[23]。純化多糖的FT-IR光譜在3 300～3 500 cm-1之間顯示出寬范圍的強(qiáng)吸收區(qū)，表明PMP結(jié)構(gòu)中存在—OH[24]，該吸收峰與羧酸的游離/鍵合羥基的分子間和分子內(nèi)氫鍵的振動(dòng)模式有關(guān)[25]。2 920 cm-1左右是甲基或亞甲基的C—H伸縮振動(dòng)，是多糖的特征吸收峰[26]。在1 739 cm-1和1 651 cm-1處的兩個(gè)吸收峰分別表示酯羰基(C═O)基團(tuán)和羧酸根離子伸縮帶(COO-)，表明檸檬多糖中存在羰基[27]。由于1 739 cm-1處的吸光度高于1 651 cm-1處的吸光度，這是低甲氧基果膠多糖的特征[27]。1 739 cm-1附近的吸收表明存在糖醛酸[28]。LPUE-1和LPME-1中糖醛酸含量相近，LPME-2中約1 730 cm-1處的峰略高于LPUE-2，說(shuō)明LPME-2中糖醛酸含量高于LPUE-2，這與UAC測(cè)定結(jié)果一致。此外，蛋白質(zhì)氨基帶也可能在1 636 cm-1處出現(xiàn)吸收，表明LPs中存在蛋白質(zhì)[29]。1 413 cm-1是C—H剪切振動(dòng)的特征吸收峰[30]。而622 cm-1處的吸收峰為O—H的伸縮振動(dòng)，揭示了LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2中酚類化合物的存在[31]。UEE和MEE處理并未改變LPs在3 400 cm-1、2 920 cm-1和1 621 cm-1附近的主要吸收峰[32]。結(jié)果表明，超聲波處理對(duì)糖苷鍵和糖環(huán)的結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯影響，但不同提取方法所得產(chǎn)物的峰強(qiáng)存在一定差異，說(shuō)明不同工藝會(huì)影響多糖中的PC、UAC。

A—LPUE-2，B— LPUE-1，C—LPME-2，D—LPME-1圖3 LPUE-1、LPME-1、LPUE-2和LPME-2的FT-IR光譜

2.5 紫外光譜分析

用紫外分光光度計(jì)測(cè)量260～280 nm處的吸收峰，以確定樣品是否含有蛋白質(zhì)[33]。研究表明，不僅芳香族氨基酸或蛋白質(zhì)在250～290 nm處有吸收峰，帶有羰基的化合物在280 nm附近也有弱吸收[34-35]。四種檸檬多糖的紫外可見光譜見圖4。最大紫外吸收值在200 nm處，證明多糖的紫外吸收處于末端，在260～280 nm附近有吸收峰，說(shuō)明多糖含有蛋白質(zhì)、多酚和糖醛酸(表2)。如圖4所示，LPUE-2和LPME-2在260 nm附近沒(méi)有明顯的峰，說(shuō)明兩種LPs的蛋白質(zhì)含量較低。圖中LPUE-1的吸收峰明顯高于其他三種純化多糖，說(shuō)明超聲波在UV-Vis光譜中，280 nm附近的LPUE-1吸收強(qiáng)度增加[36]。四種多糖經(jīng)分離純化后仍含有一定量的蛋白質(zhì)，其原因可能是蛋白質(zhì)與多糖形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這些復(fù)合物的形成可能會(huì)影響其生物活性[37]。

(a)LPUE-1

(b)LPUE-2

(c)LPME-1

(d)LPME-2

3 結(jié)論

不同的提取工藝對(duì)LPs得率和理化特征有顯著影響。UEE和MEE的多糖LPUE和LPME得率、UAC、TPC和TFC均高于其他工藝得到的LPs組分。分離、純化后四種LPs多糖組分的PC、TPC和TFC均低于分離前的LPs多糖組分。紫外光譜分析表明LPUE-1和LPME-1的蛋白質(zhì)含量高于其LPUE-2和LPME-2。紅外光譜證明所有多糖官能團(tuán)都具有多糖的一般特征吸收峰。研究表明，UEE和MEE是兩種高效的植物多糖提取和改性技術(shù)。LPs結(jié)構(gòu)和功能特性有待進(jìn)一步研究。