高玉華 魏民 邢鳴 夏鵬飛 陸峰 顏勛 傅宇彤 鄭學(xué)明

(1南京市高淳人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 高淳 211300；2鹽城市濱海人民醫(yī)院；3丹陽(yáng)市中醫(yī)院；4江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

顱腦損傷(TBI)是當(dāng)今威脅人類(lèi)生命健康的主要疾患之一，在暴力性死亡中TBI的死亡率居首位〔1，2〕。TBI后會(huì)引起腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞的功能喪失、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等〔3，4〕，但TBI對(duì)大腦不同區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的影響及導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚未完全清楚。本研究擬利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出大鼠TBI后不同時(shí)間、不同大腦區(qū)域的差異表達(dá)基因并富集分析差異的生物過(guò)程及信號(hào)通路，為進(jìn)一步的深入研究提供線(xiàn)索。

1 材料和方法

1.1數(shù)據(jù)的下載和預(yù)處理 從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)下載大鼠(Rattus norvegicus)TBI基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集GSE2871，芯片平臺(tái)為 Affymetrix Rat Genome U34 Array(GPL85)。該數(shù)據(jù)集來(lái)自側(cè)流沖擊(lateral fluid percussion)TBI的大鼠模型，為不同時(shí)間(損傷后4 h和24 h)、不同大腦區(qū)域的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集由47個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)組成，包括：TBI 4 h同側(cè)皮質(zhì)7例，對(duì)側(cè)皮質(zhì)8例，同側(cè)海馬芯片數(shù)據(jù)7例，對(duì)側(cè)海馬9例；TBI 24 h同側(cè)皮質(zhì)9例，對(duì)側(cè)皮質(zhì)7例。根據(jù)芯片的注釋信息，把探針替換成對(duì)應(yīng)的基因名，去除對(duì)應(yīng)多個(gè)基因的探針數(shù)據(jù)，對(duì)應(yīng)同一基因的多個(gè)探針數(shù)據(jù)，取其平均值。對(duì)所有的樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使得不同樣品中探針強(qiáng)度具有相似的分布。最后對(duì)探針強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)(log2)轉(zhuǎn)化得到所有樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)入下一步的差異表達(dá)基因(DEG)分析。

1.2差異基因分析 依據(jù)TBI后時(shí)間和區(qū)域?qū)M(jìn)行樣品分組，分別研究TBI后同側(cè)皮質(zhì)、對(duì)側(cè)皮質(zhì)及整體24 h和4 h基因表達(dá)差異。樣品的分組和不同組的DEG分析通過(guò)R軟件Bioconductor的limma包〔5〕實(shí)現(xiàn)，運(yùn)用 “BH” 算法對(duì)DEG的P值進(jìn)行調(diào)整得到矯正后的P值。篩選 |logFC| ≥ 1及矯正后的P值≤0.05的基因?yàn)橛行У腄EG。

1.3DEG的功能富集分析 根據(jù)芯片的注釋信息把DEG名稱(chēng)(Gene Symbol)轉(zhuǎn)化成NCBI Entrez基因數(shù)據(jù)庫(kù)的ID號(hào)(entrez gene id)。通過(guò)R軟件Bioconductor的clusterProfiler包〔6〕及大鼠的基因組注釋包org.Rn.eg.db進(jìn)行基因本體(GO)富集分析(enrichGO函數(shù))及京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路的富集分析(enrich KEGG函數(shù))，P和Q的值選擇默認(rèn)的參數(shù)(P=0.05，Q=0.2)。

2 結(jié) 果

2.1DEG篩選 為了研究大鼠TBI后24 h和4 h的腦組織表達(dá)基因差異，我們根據(jù)樣品信息，設(shè)計(jì)了3組實(shí)驗(yàn)分別對(duì)大腦不同區(qū)域及整體進(jìn)行DEG研究。大鼠TBI后24 h和4 h相比，大腦不同區(qū)域篩選到的DEG及之間的關(guān)系如圖1所示。損傷同側(cè)皮質(zhì)篩選到的DEG最多，共79個(gè)，其中上調(diào)43個(gè)，下調(diào)36個(gè)。損傷對(duì)側(cè)皮質(zhì)共找到差異基因60個(gè)，其中上調(diào)32個(gè)，下調(diào)28個(gè)。而只考慮時(shí)間因素，大鼠TBI 24 h和4 h相比，只有44個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)顯著變化，其中上調(diào)25個(gè)，下調(diào)19個(gè)。3種分組共同的DEG有3個(gè)：脫氧胞苷激酶(Dck)、Smad7及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(Cebpb)。其中上調(diào)基因?yàn)镈ck和Smad7，下調(diào)基因?yàn)镃ebpb。Dck〔7〕為脫氧核糖核酸脫氧胞苷(dC)、脫氧鳥(niǎo)苷(dG)和脫氧腺苷(dA)磷酸化所需，為核苷酸補(bǔ)救合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶。Smad7為SMAD家族成員7，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子( TGF)-β和肌動(dòng)蛋白(actin)的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白〔8〕。Cebpb是調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子〔9〕，在脂肪生成、糖異生途徑、肝臟再生和造血方面也發(fā)揮著重要作用〔10，11〕。

2.2同側(cè)皮質(zhì)差異表達(dá)基因富集分析 對(duì)TBI大鼠同側(cè)皮質(zhì)進(jìn)行DEG GO富集分析發(fā)現(xiàn)DEG主要為膜電位調(diào)節(jié)、皮質(zhì)類(lèi)固醇刺激反應(yīng)及脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)等(圖2A)。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)受影響的信號(hào)通路主要為T(mén)oll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號(hào)通路等(圖2B)。

圖1 不同分組DEG

圖2 同側(cè)皮質(zhì)差異表達(dá)基因GO(A)及KEGG(B)富集分析結(jié)果

2.3對(duì)側(cè)皮質(zhì)差異表達(dá)基因富集分析 對(duì)TBI大鼠對(duì)側(cè)皮質(zhì)進(jìn)行DEG GO富集分析發(fā)現(xiàn)DEG主要和蛋白質(zhì)四聚體組裝有關(guān)(圖3A)。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)受影響的信號(hào)通路主要為神經(jīng)活性配體-受體相互作用及抗壞血酸和醛酸代謝(圖3B)。

2.4整體DEG富集分析 對(duì)TBI大鼠的所有樣品按時(shí)間分組進(jìn)行DEG GO富集分析，發(fā)現(xiàn)損傷后24 h和4 h相比，DEG主要和血液循環(huán)〔Smad7、嗅覺(jué)受體(Olr)59、b1腎上腺素能受體(Adrb1)、5羥色胺受體1A(Htr1a)、鈉通道蛋白1型亞單位a(Scn1a)、電壓依賴(lài)性T型鈣通道亞單位2-1H(Cacna1h)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Stat1)、G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子(Rgs)4、多巴胺D2受體(Drd)2和信號(hào)素3A(Sema3a)〕、心臟收縮(Smad7、Adrb1、Scn1a、Cacna1h、Rgs4、Drd2和Sema3a)及面神經(jīng)結(jié)構(gòu)等有關(guān)〔神經(jīng)肽(Nrp)2、E2SUMO蛋白連接酶(Egr2)、Sema3a〕。見(jiàn)圖4。KEGG信號(hào)通路分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異的信號(hào)通路。

圖3 對(duì)側(cè)皮質(zhì)差異表達(dá)基因GO(A)及KEGG(B)富集分析結(jié)果

圖4 整體差異基因GO富集分析結(jié)果

3 討 論

基因表達(dá)譜是從整體水平上反應(yīng)各個(gè)基因的表達(dá)水平，大鼠TBI后不同時(shí)間的基因表達(dá)譜分析可以揭示TBI后一系列癥狀的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。本研究對(duì)TBI后大鼠大腦的不同區(qū)域及整體分別進(jìn)行24 h和4 h的差異表達(dá)基因分析。分析結(jié)果表明大腦的不同區(qū)域在損傷后不同時(shí)間的DEG有非常大的差異，因此，分區(qū)域進(jìn)行分析非常重要。

大鼠TBI后24 h和4 h相比，同側(cè)皮質(zhì)比對(duì)側(cè)皮質(zhì)有更多的DEG并富集到更多的信號(hào)通路和生物過(guò)程。同側(cè)皮質(zhì)的DEG一部分屬于對(duì)生物、機(jī)械刺激的反應(yīng)及免疫、炎癥等信號(hào)通路相關(guān)。機(jī)械刺激的反應(yīng)可能直接應(yīng)答側(cè)流沖擊，而對(duì)生物刺激的反應(yīng)及免疫、炎癥等信號(hào)通路是否由于損傷后感染所致還有待進(jìn)一步的研究。另一部分DEG屬于膜電位和負(fù)離子運(yùn)輸調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞-細(xì)胞連接等信號(hào)通路，揭示可能的神經(jīng)細(xì)胞功能障礙機(jī)制。膜電位的變化及負(fù)離子的運(yùn)輸是否和TBI引起的腦水腫有關(guān)系需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。對(duì)側(cè)皮質(zhì)的DEG主要為蛋白質(zhì)四聚體組裝及神經(jīng)活性配體-受體相互作用相關(guān)，揭示了這一部分神經(jīng)細(xì)胞功能障礙可能的機(jī)制。這些差異基因及信號(hào)通路需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和深入研究。

本研究對(duì)整體樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，損傷24 h和4 h相比，主要的DEG為調(diào)節(jié)血液循環(huán)、心臟收縮及面神經(jīng)結(jié)構(gòu)組織(Nrp2、Egr2和Sema3a)等基因，為進(jìn)一步揭示TBI引起的神經(jīng)功能障礙的機(jī)制提供了線(xiàn)索。另外，3種分組共同的DEG在TBI中的功能值得進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和深入研究。綜上，大鼠TBI模式大大促進(jìn)了人TBI發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。本研究發(fā)現(xiàn)的大鼠TBI后不同時(shí)間、不同區(qū)域的DEG，為人TBI的監(jiān)控與治療提供新的線(xiàn)索。